Tổng hợp và kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope kháng nguyên ha virus cúm a h5n1 được nhận diện bởi tế bào b

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
oOo


TRẦN THỊ NHƯ THÙY


TỔNG HỢP VÀ KIỂM CHỨNG
HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH CỦA EPITOPE
KHÁNG NGUYÊN HA VIRUS CÚM A/H5N1
ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI TẾ BÀO B


Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ:
CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
GS.TS. TRẦN LINH THƯỚC



Thành phố Hồ Chí Minh – Năm 2011

Luận văn thạc sĩ Mục lục
MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT i
DANH MỤC CÁC BẢNG iii
DANH MỤC CÁC HÌNH iv
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA VIRUS CÚM H5N1 3
1.1.1. Đặc điểm và cấu tạo virus cúm A/H5N1 3
1.1.2. Chu trình nhân bản 4
1.1.3. Cơ chế tiến hóa 5
1.2. CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG NGỪA VIRUS CÚM A/H5N1 6
1.2.1. Vaccine truyền thống 6
1.2.2. Vaccine thế hệ mới 6
1.2.3. Nghiên cứu, phát triển vaccine epitope tái tổ hợp trên thế giới 8
1.2.4. Tình hình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam 9
1.3. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG PROTEIN HEMAGGLUTININ (HA) 10
1.3.1. Cấu trúc 10
1.3.2. Chức năng 10
1.4. TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ 11
1.4.1. Tế bào lympho B 11
1.4.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể 12
1.5. EPITOPE VÀ TÍNH CHẤT CỦA CÁC EPITOPE ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI TẾ
BÀO B 13
1.5.1. Epitope 13
1.5.2. Tính chất của các epitope được nhận diện bởi tế bào B 13
1.6. DỰ ĐOÁN EPITOPE TRÊN CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1 BẰNG CÁC CÔNG CỤ TIN – SINH HỌC 14
1.7. TÁ DƯỢC VACCINE 16

1.7.1. Sơ lược về tá dược 16


Luận văn thạc sĩ Mục lục
1.7.2. Flagellin và triển vọng sử dụng làm tá dược 17
1.7.3. Freund’s adjuvant 18
1.8. HỆ THỐNG DUNG HỢP VỚI PROTEIN GLUTATHIONE S-
TRANSFERASE 18
1.9. NGUYÊN TẮC CÁC PHƯƠNG PHÁP CHÍNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN
VĂN 19
1.9.1. Biểu hiện gen ngoại lai trong tế bào E. coli 19
1.9.2. Vector biểu hiện trong E. coli 20
1.9.3. Phương pháp tinh chế sắc ký ái lực 21
1.9.4. Phương pháp gây đáp ứng miễn dịch trên động vật để thu nhận kháng thể
đa dòng…… 22
1.9.5. Phương pháp ELISA để kiểm chứng tính kháng nguyên của epitope HA tái
tổ hợp 23
PHẦN 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 26
2.1.1. Dụng cụ và thiết bị 26
2.1.2. Vật liệu sinh học 26
2.1.3. Hóa chất – Môi trường 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP 33
2.2.1. Qui trình tạo dòng tế bào E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab có khả năng biểu
hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 33
2.2.2. Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR và xử lý bằng enzyme EcoRI -
SalI 34
2.2.3. Thu nhận và cắt mở vòng plasmid pVFT-hab chứa gen mã hóa epitope
HAeB 36
2.2.4. Tạo dòng plasmid tái tổ hợp PVFT-fljB-hab 37

2.2.5. Tạo dòng tế bào E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab biểu hiện epitope
dung hợp GST-H:1,2-HAeB 40
2.2.6. Cảm ứng, biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 41


Luận văn thạc sĩ Mục lục
2.2.7. Tối ưu hóa các điều kiện biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-
H:1,2:HAeB trong chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 44
2.2.8. Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 46
2.2.9. Gây đáp ứng miễn dịch chuột với epitope HAeB và epitope tái tổ hợp
GST-H:1,2-HAeB 48
2.2.10. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB và epitope tái tổ hợp
GST-H:1,2-HAeB bằng phương pháp ELISA gián tiếp 49
2.2.11. Kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết thanh
chuột tiêm epitope HAeB và protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB 51
2.2.12. So sánh khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của kháng huyết
thanh chuột tiêm epitope HAeB và epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-
HAeB với vaccine thương mại 52
PHẦN 3. KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN
3.1. TẠO DÒNG VECTOR TÁI TỔ HỢP pVFT-fljB-hab 53
3.1.1. Thu nhận gen fljB bằng phương pháp PCR 53
3.1.2. Thu nhận plasmid pVFT-hab/EcoRI, SalI 53
3.1.3. Tạo dòng E. coli DH5α mang vector pVFT-fljB-hab 54
3.1.4. Sàng lọc và kiểm tra các dòng tế bào E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab 55
3.1.5. Giải trình tự đoạn gen fljB-hab đã tạo dòng 57
3.2. TẠO DÒNG E. COLI BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab CÓ KHẢ NĂNG BIỂU HIỆN
EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB 57
3.2.1. Biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E. coli BL21(DE3) 57
3.2.2. Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pVFT-fljB-hab từ dòng tế bào E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 58

3.2.3. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB 59
3.3. TỐI ƯU HÓA CÁC ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-
H:1,2- HAeB 61
3.3.1. Khảo sát nồng độ chất cảm ứng IPTG 61
3.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp63
3.3.3. Ảnh hưởng của ôxi hòa tan lên sự biểu hiện của epitope tái tổ hợp 64


Luận văn thạc sĩ Mục lục
3.3.4. Cảm ứng biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB trong E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab ở các điều kiện cảm ứng đã được tối ưu hóa 66
3.4. THU NHẬN VÀ TINH CHẾ EPITOPE TÁI TỔ HỢP GST-H:1,2-HAeB 66
3.4.1. Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2:HAeB 67
3.4.2. Xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp sau khi tinh chế 67
3.5. KIỂM CHỨNG HOẠT TÍNH MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU CỦA EPITOPE TÁI
TỔ HỢP 68
3.5.1. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope HAeB tổng hợp hóa học 68
3.5.2. Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-
HAeB 69
3.5.3. Kiểm tra tính đặc hiệu của kháng huyết thanh đối với virus H5N1 72
3.6. SO SÁNH KHẢ NĂNG GẮN VIRUS H5N1 BẤT HOẠT CỦA KHÁNG
HUYẾT THANH CHUỘT TIÊM EPITOPE HAeB, EPITOPE TÁI TỔ HỢP
GST-H:1,2- HAeB VÀ VACCINE THƯƠNG MẠI 74
PHẦN 4. KẾT LUẬN – ĐỀ NGHỊ
1. KẾT LUẬN 77
2. ĐỀ NGHỊ 78
TÀI LIỆU THAM KHẢO 79


Luận văn thạc sĩ Danh mục

Trang i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
ANN artificial neural network
bp base pair
BSA bovine serum albumin
CEP conformational epitope prediction
CFA complete Freund adjuvant
DNA deoxyribose nucleic acid
dH
2
O distilled water (nước cất)
dNTP deoxynucleotide triphosphate
ĐHKHTN Đại học Khoa học Tự nhiên
ĐHQG-HCM Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
E. coli Escherichia coli
EDTA ethylene diamine tetra acetic acid
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
GST gluthathione-S-tranferase
HA hemagglutinin (heamagglutinin)
hab gen mã hóa cho epitope HAeB
HAeB epitope hemagglutinin H5N1 được nhận diện bởi tế bào B
His polyhistidine
HMM hiden Markov model
IFA incomplete Freund adjuvant
IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside
IL interleukin
INF interferon
Kan kanamycin

Kan
r
kanamycin resistance (kháng kanamycin)
kDa kilo Dalton
LB môi trường Luria-Bertani
MBP protein gắn maltose


Luận văn thạc sĩ Danh mục

Trang ii

MCS multiple cloning site
MDP muramyl dipeptide
MHC major histocompatibility complex
NA neuraminidase
NFDM non fat dry milk
OPD o-phenylene diamine
PBS phosphate buffered saline
PBST phosphate buffered saline tween
PCR polymerase chain reaction
PMSF phenyl methyl sulphonyl fluoride
PTN.CNSHPT Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử
RNA ribose nucleic acid
RNase ribonuclease (enzyme thuỷ giải RNA)
SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl-ethane-1,2-diamine
TLR Toll-like receptor
Trx thioredoxin

Luận văn thạc sĩ Danh mục

Trang iii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A 3
Bảng 1.2. Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng
phòng ngừa virus 8
Bảng 1.3. Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học
bởi đề tài KC.04.18/06-10 15
Bảng 2.1. Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn 28
Bảng 2.2. Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 42
Bảng 3.1. Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab 53
Bảng 3.2. Mật độ tế bào (OD
600
) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác
nhau 61
Bảng 3.3. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB
theo các nồng độ IPTG cảm ứng 62
Bảng 3.4. Mật độ tế bào (OD
600
) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau 63
Bảng 3.5. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-
HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 63
Bảng 3.6. Mật độ tế bào (OD
600
) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau 65
Bảng 3.7. Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-
HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau 65

Bảng 3.8. Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp
thu quang phổ 68



Luận văn thạc sĩ Danh mục

Trang iv

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Quá trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm 5
Hình 1.2. Qui trình thực hiện phương pháp Reverse Vaccinology 9
Hình 1.3. Cấu trúc vùng MCS của hệ thống biểu hiện pVFT 2S 21
Hình 2.1. Plasmid pVFT-hab 27
Hình 2.2. Các thang chuẩn DNA 29
Hình 2.3. Thang chuẩn protein 29
Hình 2.4. Quy trình tạo dòng E. coli DH5α/pVFT-fljB-hab 34
Hình 3.1. Kết quả thu nhận gen bằng phản ứng PCR 53
Hình 3.2. Kết quả thu nhận pVFT-hab và plasmid pVFT-hab/EcoRI, SalI 54
Hình 3.3. Kết quả biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E. coli DH5α 55
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc sàng lọc dòng tế bào E. coli
DH5α/pVFT-fljB-hab 56
Hình 3.5. Kết quả điện di sản phẩm PCR plasmid kiểm tra các dòng E. coli
DH5α/pVFT-fljB-hab 57
Hình 3.6. Kết quả giải trình tự đoạn gen fljB- hab trong plasmid pVFT-fljB-hab 57
Hình 3.7. Kết quả biến nạp plasmid pVFT-fljB-hab vào tế bào E. coli BL21(DE3) 58
Hình 3.8. Kết quả PCR kiểm tra plasmid các dòng tái tổ hợp E. coli
BL21(DE3)/pVFT-fljB-hab 59
Hình 3.9. Kết quả biểu hiện của protein dung hợp GST-H:1,2-HAeB bằng SDS-
PAGE (a), lai Western Blot với kháng thể anti-GST (b) và định lượng

Quantity One (c) 60
Hình 3.10. Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các
nồng độ IPTG khác nhau 62
Hình 3.11. Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các
nhiệt độ khác nhau 64
Hình 3.12. Kết quả định lượng Quantity One các mẫu protein cảm ứng ở các tốc độ
lắc khác nhau 65


Luận văn thạc sĩ Danh mục

Trang v

Hình 3.13. Kết quả điện di SDS-PAGE (a), lai Western Blot với kháng thể anti-GST
(b) và định lượng Quantity One (c) của chủng E. coli BL21(DE3)/pVFT-
fljB-hab được nuôi cấy lắc đã kết hợp các điều kiện tối ưu 66
Hình 3.14. Phân tích kết quả tinh chế bằng SDS-PAGE(a) và lai Western Blot(b) 67
Hình 3.15. Kết quả xác định độ tinh sạch của epitope tái tổ hợp đã tinh chế bằng
SDS-PAGE 68
Hình 3.16. Kết quả ELISA của kháng huyết thanh kháng kháng nguyên epitope
HAeB với kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB 69
Hình 3.17. Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được tiêm kháng
nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H:1,2-HAeB 70
Hình 3.18. Kết quả ELISA của kháng huyết thanh từ chuột được nhỏ mũi kháng
nguyên GST-H:1,2-HAeB và kháng nguyên GST-H;1,2-HAeB 71
Hình 3.19. Kết quả ELISA so sánh khả năng nhận diện kháng nguyên GST-H:1,2-
HAeB của các kháng huyết thanh khác nhau 71
Hình 3.20. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của
kháng huyết thanh chuột tiêm epitope HAeB 72
Hình 3.21. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của

kháng huyết thanh chuột tiêm protein dung hợp GST-H;1,2-HAeB 73
Hình 3.22. Kết quả ELISA kiểm tra khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của
kháng huyết thanh chuột nhỏ mũi protein dung hợp GST-H;1,2-HAeB 73
Hình 3.23. Kết quả ELISA so sánh khả năng nhận diện virus H5N1 bất hoạt của các
kháng huyết thanh khác nhau 74








Luận văn thạc sĩ Đặt vấn đề
Trang 1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vaccine phòng ngừa một số phân type cúm hiện nay tuy có hiệu quả tốt nhưng lại
bị giới hạn về chủng. Do đó, nhiều phương pháp mới được nghiên cứu nhằm cải thiện
các hạn chế của vaccine hiện có và chủ yếu tập trung vào hai hướng sau: i) Tạo vaccine
đa giá phòng được nhiều chủng virus; ii) Con đường tạo sự miễn dịch. Trong đó,
phương pháp nghiên cứu tạo vaccine dựa trên các epitope bảo tồn ở các chủng virus
thuộc các phân type khác nhau của virus cúm A hiện đang được quan tâm rộng rãi. Ưu
điểm của loại vaccine này là khả năng gây đáp ứng miễn dịch chỉ với cấu trúc kháng
nguyên tối thiểu. Vì vậy, nếu có đầy đủ các epitope cần thiết, vaccine sẽ kích thích phản
ứng miễn dịch chuyên biệt mà không gây ra những ảnh hưởng không mong muốn.
Cùng với sự phát triển của ngành Tin Sinh học, nhóm nghiên cứu của Phòng thí
nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử (PTN.CNSHPT), Trường Đại học Khoa học Tự
nhiên (Trường ĐHKHTN) thuộc Đại học Quốc gia TP. HCM (ĐHQG - HCM) quan tâm

đến hướng nghiên cứu nêu trên. Trong các năm 2008 – 2010, PTN.CNSPT đã được Bộ
Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai một đề tài khoa học công nghệ cấp Nhà
nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vaccine và thuốc”, mã
số KC.04.18/06-10. Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là dự đoán các epitope
được nhận diện bởi tế bào T, tế bào B từ các kháng nguyên khác nhau của virus cúm A
bằng các chương trình dự đoán epitope khác nhau và đánh giá hoạt tính miễn dịch của
các epitope dự đoán. Do thời gian thực hiện đề tài có giới hạn nên đề tài chưa đánh giá
được hết tất cả các epitope đã được dự đoán từ kết quả của đề tài. Trong luận văn này,
chúng tôi tiến hành tổng hợp bằng kỹ thuật gen một epitope liên tục nhận diện bởi tế bào
B đã được dự đoán từ kháng nguyên HA của virus cúm A/H5N1 và tiến hành đánh giá
khả năng gây đáp ứng miễn dịch tạo kháng thể nhận diện kháng nguyên của epitope này.
Để tổng hợp epitope bằng kỹ thuật gen, epitope liên tục nhận diện bởi tế bào B (HAeB)
được thiết kế để tổng hợp thành protein tái tổ hợp trong tế bào chủ E. coli ở dạng dung
hợp với GST (Glutathione S-transferase) và kháng nguyên roi (flagellin) H:1,2 của


Luận văn thạc sĩ Đặt vấn đề
Trang 2

Salmonella Typhimurium. Do vector được sử dụng để biểu hiện protein trong E. coli
được chọn thuộc hệ thống pVFT, được thiết kế để biểu hiện protein ngoại lai ở dạng
dung hợp với GST, nên epitope tái tổ hợp cũng được tổng hợp ở dạng dung hợp với
GST. Ngoài ra, do flagellin H:1,2 của S. Typhimurium đã được chứng minh có hoạt tính
kích thích đáp ứng miễn dịch ở vật chủ, nên chúng tôi thiết kế epitope dung hợp với
H:1,2 với mục đích tăng cường khả năng gây đáp ứng miễn dịch của epitope tổng hợp.
Epitope tái tổ hợp được tổng hợp bằng kỹ thuật gen sẽ dung hợp với GST và H:1,2 ở
đầu N (GST-H:1,2-HAeB).
Nội dung thực nghiệm của luận văn gồm:
- Tạo dòng tế bào E. coli biểu hiện epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Tối ưu hóa điều kiện cảm ứng tổng hợp epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.

- Thu nhận và tinh chế epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-HAeB.
- Kiểm chứng hoạt tính miễn dịch đặc hiệu của epitope tái tổ hợp GST-H:1,2-
HAeB với kháng nguyên HA của virus A/H5N1.








PHẦN 1
TỔNG QUAN



Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 3

1.1. CÁC ĐẶC TÍNH SINH HỌC CHÍNH CỦA VIRUS CÚM H5N1

1.1.1. Đặc điểm và cấu tạo virus cúm A H5N1 [5], [23]
H5N1 là một phân type của chi Influenza A virus, một chi thuộc nhóm IV, họ
Orthomyxoviridae. Họ này có các đặc tính như sau: bộ gen ssRNA mạch âm, vỏ bọc với
nhiều hình dạng, bộ gen có từ 6 – 8 mạch với kích thước 10 – 15kb, gây bệnh ở các loài
động vật có xương sống.
Virion có dạng hình cầu hay đa hình, đường kính 80 – 120nm, chiều dài 200 –
300nm, khối lượng phân tử khoảng 250 triệu Dalton. Vỏ virus được tạo thành từ màng
lipid của tế bào ký chủ, bề mặt được cấu thành bởi các protein hay glycoprotein của
virus, chủ yếu là hemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Phần ngoài màng của các

glycoprotein có chiều dài 10 -14nm và đường kính 4 – 6nm. Các nucleocapside chứa các
đoạn gen có cấu tạo xoắn ốc với chiều dài khác nhau, từ 50 – 130nm. Các nucleocapside
có dạng thẳng và xoắn ở cuối. Mặt trong của lớp vỏ được bao phủ bằng protein nền
(protein M), gồm 2 loại là: M1 và M2. Bên trong là bộ gen virus cúm A, gồm 8 sợi âm
RNA mạch đơn, riêng biệt, mã hóa cho 11 loại protein. Các protein của virus cúm A và
chức năng của chúng được tổng hợp trên Bảng 1.1. Hai đầu của sợi RNA có gắn thêm
chuỗi nucleotide có tính bảo tồn cao. Virus cúm A tương đối nhạy cảm với các tác nhân
bất hoạt vật lý hay hóa học; các hạt virus tồn tại thích hợp trong khoảng pH từ 6,5 – 7,9.
Bảng 1.1. Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A
Phân đoạn
RNA
Protein

Kích thước
(kDa)
Vai trò, chức năng
1 PB2 85,7 Khởi đầu phiên mã
2 PB1 86,5 Gắn mũ
3 PA 84,2 Kéo dài phiên mã
4 HA 76 Gắn với các thụ thể trên bề mặt tế bào chủ, dung
hợp màng virus với màng tế bào chủ để đưa
nucleocapsid vào, dễ bị biến đổi hình thành nên
chủng mới
5 NP 56,1 Là protein cấu trúc bao quanh các phân đoạn RNA
6 NA 32 Loại bỏ sialic acid ra khỏi glycoprotein, giúp virus
vượt qua lớp nhầy của ống hô hấp, tham gia vào
việc lây truyền của virus


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu

Trang 4

7 M1 và
M2
M1: 27,8
M2: 11
M1: thành phần cấu trúc chính, tham gia quá trình
lắp ráp và nảy chồi
M2: là các kênh ion
8 NS1 và
NS2
NS1: 26,8
NS2: 14,2
NS1: ức chế vận chuyển mRNA
NS2: đưa ribonucleoprotein ra ngoài nhân

1.1.2. Chu trình nhân bản [19], [31]
Chu trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm A trải qua 3 bước:
- Bước 1: Bám dính, xâm nhập và tháo vỏ
Các virus cúm bám vào tế bào bằng cách gắn các protein bề mặt hemaglutinin với
các phân tử đường của sialic acid trên bề mặt của tế bào biểu mô (ở mũi, cổ họng và phổi
của động vật có vú và ruột của chim). Sự hình thành liên kết giữa sialic acid và đường
galactose mang tính đặc trưng loài, quyết định giới hạn truyền bệnh của virus cúm. Virus
vào trong tế bào theo cơ chế ẩm bào, hình thành các endosome. Nồng độ pH bên trong
endosome thấp kết hợp với các protease đã làm thay đổi cấu hình của HA, để lộ ra phần
kỵ nước giúp đính trên màng lipid của endosome, dẫn đến sự dung hợp màng. Đồng
thời, các proton H
+
đi vào bên trong virus thông qua kênh ion M2, phá vỡ mối tương tác
giữa protein M1 với các ribonucleoprotein (RNP) và giải phóng chúng vào tế bào chất.

- Bước 2: Sinh tổng hợp mRNA và sao chép RNA
Sau khi vào trong bào tương tế bào, virus sử dụng bộ máy sinh học của tế bào chủ
để sinh tổng hợp protein và RNA của chúng. Quá trình sao chép thông tin di truyền RNA
này được thực hiện trong nhân tế bào chủ. Các RNA của virus được đưa vào nhân nhờ
protein NP. Tại đây, xảy ra quá trình sao chép thành hai loại RNA: sợi dương mRNA và
cRNA từ khuôn là sợi âm của hệ gen virus.
- Bước 3: Đóng gói và nảy chồi
Các protein HA, NA và M2 được biến đổi sau dịch mã tại thể Golgi và được đưa
lên màng. Protein N như một tín hiệu điều chỉnh giữa hai quá trình biểu hiện gen virus
và quá trình lắp ráp RNP mới, nếu protein này nhiều thì quá trình biểu hiện giảm xuống,
quá trình lắp ráp sẽ tăng lên.


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 5

Các protein M1 liên kết nhau tạo thành lớp vỏ phía dưới màng bao của virus. Tại
màng, các RNP cùng với các glycoprotein HA, NA, M2 và vùng nảy chồi tạo thành các
chồi virus hoàn chỉnh gắn chặt vào màng tế bào chủ nhờ liên kết giữa HA với thụ thể
chứa sialic acid. Protein NA còn giúp phân cắt các thụ thể sialic acid trên màng, giải
phóng virus và có thể nhiễm vào các tế bào khác để tiếp tục chu kỳ xâm nhiễm mới.

Hình 1.1. Quá trình xâm nhiễm và nhân bản của virus cúm

1.1.3. Cơ chế tiến hóa [33], [26]
Các chủng virus cúm gia cầm mới xuất hiện là kết quả của sự tiến hóa dẫn đến sự
thay đổi các kháng nguyên bề mặt của chúng, giúp virus tránh được hệ miễn dịch của cơ
thể vật chủ. Có hai phương thức tiến hóa chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên ở virus
cúm A.
- Cơ chế làm lệch kháng nguyên:

Kháng nguyên bị biến đổi do các đột biến điểm trên RNA virus. Do RNA
replicase của virus không có cơ chế sửa sai và độ chính xác rất thấp nên khi nhân bản
RNA sẽ tạo ra nhiều đột biến sai lệch nucleotide. Tần suất đột biến điểm rất cao, khoảng
1/10.000. Như vậy, gần như mỗi virus mới sinh ra đều chứa một đột biến điểm trong hệ
gen của nó. Các đột biến này được tích lũy qua nhiều thế hệ, làm xuất hiện một phân
type mới có đặc tính kháng nguyên mới. Hiện tượng này thường xảy ra ở các đoạn gen
mã hóa kháng nguyên NA và HA.
- Cơ chế tái tổ hợp kháng nguyên:


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 6

Sự tái sắp xếp bộ gen từ nhiều chủng khác nhau cũng có khả năng tạo thành
chủng virus mới nhanh chóng do sự tổ hợp các đoạn RNA từ các chủng khác nhau. Điều
này còn giúp cho virus có khả năng lây nhiễm ở loài vật chủ mới hoặc gia tăng độc lực.
Do bộ gen virus gồm 8 đoạn RNA khác nhau, việc tái tổ hợp giữa đoạn gen của các
chủng virus khác nhau khi xâm nhiễm cùng một ký chủ rất dễ dàng xảy ra. Đây là vấn đề
đáng lo ngại của virus cúm H5N1 hiện nay.

1.2. CÁC LOẠI VACCINE PHÒNG NGỪA VIRUS CÚM A/H5N1
Hiện nay, vaccine phòng bệnh virus cúm H5N1 đang rất được quan tâm nghiên
cứu trên thế giới. Đây được xem là biện pháp y học chính để bảo vệ con người khỏi đại
dịch cúm.

1.2.1. Vaccine truyền thống [15]
Các nghiên cứu hiện nay tập trung chủ yếu trên các vaccine virus bất hoạt và
vaccine nhược độc.
Vaccine virus bất hoạt được phát triển đầu tiên là virus được nuôi cấy trong dịch
niệu gà, sau đó tinh chế và cô đặc, cuối cùng được bất hoạt bằng formaldehyde hoặc β-

propiolactone. Vaccine này an toàn và khả năng dung nạp với tế bào chủ tốt, hiệu quả
bảo vệ 60 – 90% ở trẻ em và người lớn.
Vaccine nhược độc là dạng virus được làm yếu đi do tạo sự thích nghi với điều
kiện lạnh (cold adapted influenza vaccine). Ưu điểm của loại vaccine này là kích thích
hệ miễn dịch dịch thể, miễn dịch tế bào và tạo đáp ứng miễn dịch lâu dài.

1.2.2. Vaccine thế hệ mới [12], [25]
Các loại vaccine truyền thống tuy có tính bảo vệ cao nhưng độ an toàn không cao,
vì vậy nhiều thử nghiệm đang được tiến hành nhằm tạo ra vaccine cúm mới vừa có hiệu
quả bảo vệ tốt, vừa an toàn cho người. Hai trong số các phương pháp phát triển vaccine
mới có triển vọng cao là vaccine virus tái tổ hợp và vaccine epitope tái tổ hợp.


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 7

- Vaccine virus tái tổ hợp
Hướng nghiên cứu đang được phát triển hiện nay là phương pháp di truyền ngược
(reverse genetics), sử dụng vector là plasmid chứa gen và vùng promoter của virus cúm.
Vector tái tổ hợp được chuyển vào trong tế bào, tạo ra các đoạn RNA bộ gen của virus,
tạo protein của virus và hình thành các phần tử virus mới. Phương pháp này tạo ra một
chủng virus mới không có độc lực để làm vaccine một cách nhanh chóng. Ví dụ, người
ta có thể tạo ra một chủng virus tái tổ hợp chứa 6 đoạn RNA từ chủng virus yếu và đoạn
RNA mã hóa HA và NA từ chủng virus đang lưu hành.
- Vaccine epitope tái tổ hợp
Một phương pháp khác cũng đang được quan tâm nghiên cứu hiện nay là dựa trên
các epitope được bảo tồn ở các chủng virus thuộc các type khác nhau của virus cúm A để
phát triển vaccine phòng H5N1 và có thể phòng các phân type virus khác nhau. Nhiều
loại vaccine cúm hiện nay ở người và động vật đều có nhiều tác dụng phụ, phổ kháng
hẹp, nên vaccine cần phải được sản xuất mới hàng năm. Để tránh việc phải nghiên cứu

thay đổi vaccine hàng năm, các nhà khoa học mong muốn tạo ra một loại vaccine có phổ
kháng rộng, có khả năng kháng lại tất cả các phân type virus gây bệnh trên người và gia
cầm. Ưu điểm chính của vaccine dựa trên epitope là khả năng gây đáp ứng miễn dịch với
cấu trúc kháng nguyên tối thiểu, do vậy có thể tránh được những ảnh hưởng không mong
muốn. Tuy vậy, vaccine dựa trên epitope có thể có khả năng gây đáp ứng miễn dịch thấp
hơn so với vaccine toàn phần. Vì vậy, khi phát triển vaccine dựa trên epitope nên có sự
hiện diện của cả epitope tế bào B và epitope tế bào T. Các epitope phải chuyên biệt cho
tác nhân gây bệnh. Các epitope đang được tập trung nghiên cứu hiện nay là các epitope
trên hai kháng nguyên bề mặt HA và NA của virus cúm. Đồng thời, các nhà khoa học
còn nghiên cứu các tá dược và các chất mang kết hợp với các epitope bảo tồn nhằm làm
tăng hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch.



Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 8

1.2.3. Nghiên cứu phát triển vaccine epitope tái tổ hợp trên thế giới [17], [27]
Hiện nay đã có một loại vaccine nhỏ mũi dựa trên epitope đã được cấp patent
(patent số 7192595, 20/03/2007) có khả năng phòng ngừa một số chủng virus cúm. Các
epitope được lựa chọn bao gồm ít nhất bốn epitope virus cúm ở người gồm một epitope
(HA) tế bào B; một epitope (HA hay NP) tế bào T trợ giúp có khả năng gắn với nhiều
phân tử HLA và ít nhất hai epitope (NP hay M) tế bào CTL. Cụ thể là các epitope HA91-
108 (epitope tế bào B: SKAFSNCYPYDVPDYASL), HA307-319, NP335-350 và
NP380-393. Các epitope trên khi được dung hợp với tiên mao flagella của vi khuẩn
Salmonella đã cho đáp ứng miễn dịch và hiệu quả bảo vệ tốt đối với một số chủng cúm.
Bảng 1.2. Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng phòng
ngừa virus
Epitope Trình tự Giới hạn HLA Chủng cúm A
NP335-350 SAAFEDLRVLSF

IRGY
A2, A3, Aw68,
B37
H1N1, H2N2, H3N2, H5N2,
H5N1, H6N1, H9N2
NP380-393 ELRSRYWAIRTR
SG
B8, B27 H1N1, H1N2, H2N2, H5N1,
H5N2, H6N1, H6N2, H6N9,
H7N7, H9N2, H11N1, H14N5
HA307-
319
PKYVKQNTLKL
AT
DR1, DR2, DR4,
DR5, DR7, DR9,
DR52A…
H1N1, H3N1, H3N2, H3N8

Nguồn dữ liệu bộ gene được giải mã ngày càng tăng cùng với sự phát triển của
các công cụ Tin Sinh học đã mở ra một phương pháp mới để hỗ trợ nghiên cứu phát triển
vaccine là phương pháp Vaccine học ngược (Reverse Vaccinology - RV). Khác với
phương pháp nghiên cứu vaccine truyền thống, xuất phát điểm của RV là việc phân tích
toàn bộ bộ gene của tác nhân gây bệnh để xác định tất cả kháng nguyên có khả năng là
vaccine dự tuyển (Hình 1.2). Đây là một bước nhằm tìm ra tất cả các protein kháng
nguyên tiềm năng chưa được quan tâm đến tính miễn dịch in vitro. Phương pháp RV đã
được ứng dụng thành công trên nhiều trường hợp ở cả vi khuẩn và virus.
Các protein kháng nguyên tiềm năng là đầu vào để dự đoán các epitope tế bào T
và tế bào B có thể có cho tác nhân gây bệnh. Có nhiều thuật toán, phương pháp đã được
phát triển để dự đoán epitope tế bào T và epitope tế bào B nhưng có thể được chia thành

Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 9

hai nhóm chính là dự đoán dựa trên phân tích trình tự (phương pháp dùng các dữ liệu
đầu vào là các trình tự acid amin) và dự đoán dựa trên phân tích cấu trúc (sử dụng thông
tin về cấu trúc không gian ba chiều).

Hình 1.2. Qui trình thực hiện phương pháp Reverse Vaccinology

1.2.4. Tình hình sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người tại Việt Nam [4], [13]
Ở nước ta, các nhà sản xuất trong nước hiện đang ở giai đoạn nghiên cứu phát
triển sản xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người ở qui mô phòng thí nghiệm với các
phương pháp khác nhau.
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương từ giữa năm 2004 đã phát triển kỹ thuật sản
xuất vaccine cúm A/H5N1 cho người trên tế bào thận khỉ tiên phát. Vaccine này sử dụng
một chủng tái tổ hợp từ chủng virus A/Vietnam/1203/2004 với một chủng tái tổ hợp từ
chủng virus do Đại học Tokyo, Nhật Bản cung cấp. Hiện nay, Viện đã sử dụng chủng
NIBRG-14 (nguồn gốc từ chủng A/Vietnam 1194/2004 và PR8 do Viện NIBSC – Vương
quốc Anh cung cấp). Vaccine do Viện sản xuất đã được nghiệm thu dưới dạng đề tài cấp
Nhà nước vào đầu năm 2007, đang nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng.
- Viện Pasteur TP. HCM nghiên cứu phát triển dạng vaccine nuôi cấy trên tế bào
VERO, sử dụng chủng NIBRG-14.
- Viện Vaccine và Sinh phẩm y tế phối hợp với Viện Công nghệ Sinh học (Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam) nghiên cứu sản xuất vaccine nuôi cấy trên trứng gà
có phôi, sử dụng chủng NIBRG-14.


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu

Trang 10

- Việc nhiều đơn vị trong nước nghiên cứu sản xuất vaccine cúm A/H5N1 làm
tăng khả năng nước ta có thể chủ động nguồn vaccine cúm cho người khi đại dịch xảy ra.
Đặc biệt việc sử dụng các chủng sản xuất có nguồn gốc từ các chủng virus phân lập tại
Việt Nam làm cho vaccine có hiệu lực bảo vệ tốt nhờ tính tương đồng kháng nguyên.

1.3. CẤU TRÚC VÀ CHỨC NĂNG PROTEIN HEMAGGLUTININ (HA)

1.3.1. Cấu trúc [8]
HA là kháng nguyên bề mặt rất quan trọng của virus cúm A. Ngày nay, các hiểu
biết chính về HA chủ yếu dựa trên các nghiên cứu trên cúm gia cầm type A. Đây là một
trimer gồm 3 đơn phân HA0 kết hợp với nhau tạo thành dạng siêu xoắn, có khối lượng
phân tử khoảng 220kDa. Mỗi monomer là hạng HA0 chưa được cắt, sau đó được cắt
bằng protease thành hai tiểu đơn vị là HA1 và HA2. Hai tiểu đơn vị này nối với nhau
bằng cầu nối disulfide. Dạng HA tồn tại trên bề mặt virus là dạng đã được cắt. Khi được
xử lý với bromelain, HA sẽ bị cắt tại vùng sát màng và giải phóng vùng ectodomain của
HA, được gọi là cấu trúc BHA. Vùng đáy của khối trụ này chứa các đoạn polypeptide từ
các cấu phần HA1 và HA2, thành phần chính của nó là một tâm của các vùng xoắn α
trên HA2 và tạo nên xương sống của protein. Một vùng kỵ nước ở đầu N của mỗi đơn
phân HA2 cũng rất quan trọng trong sự dung hợp màng và thường được đề cập đến với
tên gọi vùng peptide dung hợp. Phần xa màng nhất của cấu trúc BHA là một khối cầu
lớn tạo nên chủ yếu từ HA1. Vùng này có cấu trúc cơ bản là các phiến β đối song 8 đoạn.
Khu vực này chứa vị trí gắn thụ thể và các vị trí nhận biết quan trọng của kháng thể
trung hòa.

1.3.2. Chức năng [9], [22]
- Dung hợp màng
Sau khi vào tế bào chủ, virus cúm A sẽ dung hợp màng virus với màng hạt nội
bào, phóng thích các nucleocapsid vào tế bào chất. HA0 được cắt thành hai tiểu phần

HA1 và HA2. Môi trường acid bên trong hạt nội bào giúp HA thay đổi cấu hình, khởi


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 11

đầu sự dung hợp màng. Cơ chế cụ thể của sự dung hợp hai lớp màng này vẫn chưa được
làm sáng tỏ. Một giả thuyết cho rằng có sự tham gia của nhiều phân tử HA cùng lúc. Các
HA tụ lại với nhau sau đó ống xoắn duỗi ra và đẩy peptide dung hợp lên tương tác với
màng tế bào. Sự tái gấp cuộn vùng gần màng của chuỗi xoắn α dài của HA2 kéo hai
màng lại gần nhau. Khi tiếp xúc nhau, chúng nhập vào nhau và hình thành trạng thái bán
dung hợp. Trạng thái này mở rộng dần do tác dụng của HA và đến mức nào đó đủ sức
căng để phá vỡ cấu trúc, tạo một lỗ trên màng dung hợp. Từ đó, vật chất bên trong được
giải phóng ra bên ngoài.
- Gắn thụ thể
Hiện nay, kiến thức về cơ chế này đã sâu hơn rất nhiều. Một cấu trúc nhỏ dạng túi
ở vùng đầu hình cầu của HA là vị trí gắn với thụ thể. Các amino acid ở vùng này có tính
bảo tồn rất cao so với các vùng xung quanh, đồng thời trình tự này sẽ qui định loại nối
của thụ thể mà HA có thể gắn vào. Hai vị trí quan trọng nhất qui định sự gắn vào thụ thể
là vị trí 226 và 228 trên HA1. Các chủng nhận biết thụ thể α(2,3) thường có glutamine ở
vị trí 226 và glycine ở vị trí 228 và các chủng nhận biết thụ thể α(2,6) có leucine và
serine ở hai vị trí này.

1.4. TẾ BÀO LYMPHO B VÀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH DỊCH THỂ [1]

1.4.1. Tế bào lympho B
Tế bào lympho B (tế bào B) là tế bào sản xuất kháng thể nhận diện và gắn lên
kháng nguyên giúp hệ miễn dịch phá hủy kháng nguyên. Tế bào này trưởng thành trong
tủy xương, sau đó đi vào hệ tuần hoàn và tập trung ở các cơ quan lympho ngoại biên.
Chức năng của tế bào B là nhận diện kháng nguyên và tạo ra đáp ứng miễn dịch dịch thể.

Tế bào nào không tiếp xúc với kháng nguyên thì sẽ chết theo phương thức apotosis. Các
globulin trên bề mặt tế bào B đóng vai trò là các thụ thể của kháng nguyên. Có khoảng
1,5 x 10
5
phân tử thụ thể kháng nguyên trên bề mặt của một tế bào B.



Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 12

1.4.2. Đáp ứng miễn dịch dịch thể
Miễn dịch dịch thể do các kháng thể thực hiện là một trong hai nhánh của đáp ứng
miễn dịch thích ứng có chức năng trung hoà, loại bỏ các vi sinh vật ngoại bào và độc tố
của vi sinh vật. Quá trình đáp ứng này có thể xảy ra ở bất cứ mô nào, thường xảy ra
trong tỳ hoặc ở hạch bạch huyết. Kháng nguyên sẽ gây đáp ứng miễn dịch dịch thể trong
đó kháng thể được tế bào B sản xuất để chống lại kháng nguyên. Kháng nguyên gắn vào
các thụ thể trên tế bào B và liên kết chéo với các thụ thể liền kề (các tế bào T có vai trò
phối hợp trong quá trình này), qua đó hoạt hóa tế bào B. Sự gắn của kháng nguyên xảy
ra khá nhanh, sau đó là quá trình nhập bào. Hiện tượng hoạt hóa này gây ra sự chọn lọc
dòng, kích thích tế bào B sinh trưởng và sinh sản để tạo thành một dòng tế bào hoàn toàn
giống nó, có các thụ thể bề mặt của cùng một kháng nguyên đặc hiệu. Hầu hết các tế bào
này trở thành các tương bào, là tế bào tiết kháng thể trong đáp ứng miễn dịch dịch thể.
Tế bào B bình thường tiết một lượng kháng thể rất giới hạn. Ngược lại, các tương bào đã
phát triển bộ máy có thể tiết các kháng thể với tốc độ khoảng 2.000 phân tử/giây. Mỗi
tương bào hoạt động trong 4 – 5 ngày rồi chết. Kháng thể được tiết vào máu hoặc bạch
huyết, gắn vào các kháng nguyên tự do để đánh dấu và huy động các cơ chế không đặc
hiệu hoặc đặc hiệu của hệ thống miễn dịch nhận biết và phá hủy kháng nguyên. Các tế
bào của dòng không biệt hóa thành tương bào sẽ trở thành các tế bào nhớ, có khả năng
tồn tại lâu dài, có vai trò giúp cơ thể có đáp ứng miễn dịch dịch thể nhanh chóng, hầu

như tức thì khi tiếp xúc lại cùng một kháng nguyên.
Đáp ứng miễn dịch dịch thể nguyên phát xảy ra khi hệ thống miễn dịch tiếp xúc
lần đầu tiên với một kháng nguyên đặc biệt. Đáp ứng này hình thành chậm khoảng 3 -6
ngày sau khi hệ thống bị nhiễm kháng nguyên. Thời gian này cần thiết để một số ít tế
bào B đặc hiệu đối với kháng nguyên được chọn lọc dòng, sinh sản và biệt hóa thành
tương bào. Sau thời kỳ này, lượng kháng thể trong huyết tương tăng lên, đạt đến đỉnh
trong khoảng 10 ngày, rồi bắt đầu giảm xuống.
Đáp ứng miễn dịch thứ phát xảy ra khi một người nào đó bị nhiễm lại bởi cùng
một kháng nguyên. Đáp ứng lúc này xảy ra nhanh hơn, kéo dài hơn và hiệu quả hơn vì


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 13

hệ miễn dịch đã sẵn sàng, các tế bào nhớ được kích thích và sản xuất tương bào nhanh
hơn. Các kháng thể được sản xuất lần này gắn chặt hơn, lượng kháng thể trong máu giữ
ở mức cao trong hàng tuần cho tới hàng tháng. Ngay cả khi không có kháng nguyên, các
tế bào nhớ vẫn tồn tại trong thời gian dài và nhiều tế bào nhớ vẫn còn khả năng gây các
đáp ứng miễn dịch dịch thể thứ phát trong cả cuộc đời.

1.5. EPITOPE VÀ TÍNH CHẤT CỦA CÁC EPITOPE ĐƯỢC NHẬN DIỆN BỞI
TẾ BÀO B [20]

1.5.1. Epitope
Các tế bào miễn dịch không nhận diện toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ nhận
diện những vùng nhất định trên phân tử kháng nguyên, gọi là epitope. Đây là những
vùng có hoạt tính miễn dịch của một kháng nguyên, được nhận diện và gắn đặc hiệu bởi
thụ thể tương ứng của nó trên bề mặt tế bào lympho hoặc bởi kháng thể do tế bào
lympho tiết ra. Sự tương tác này có thể xảy ra ở các mức độ cấu trúc khác nhau của
kháng nguyên. Có hai loại epitope: epitope liên tục (epitope bậc 1) và epitope không liên

tục (epitope lập thể). Epitope liên tục được hình thành bởi chuỗi các acid amin kế tiếp
nhau trên phân tử kháng nguyên. Epitope không liên tục được hình thành bởi các acid
amin nằm cách xa nhau trên phân tử kháng nguyên. Epitope không liên tục chỉ hiện diện
ở phân tử kháng nguyên có cấu hình gấp cuộn tự nhiên và bị mất đi khi kháng nguyên bị
biến tính hoặc bị phân hủy.

1.5.2. Tính chất của các epitope được nhận diện bởi tế bào B
Kích thước của epitope được nhận diện bởi tế bào B được quyết định bởi kích
thước, hình dạng và thứ tự acid amin của vị trí kết hợp (paratope) trên kháng thể. Trong
trường hợp kháng nguyên là một protein hình cầu thì epitope có thể lớn hơn.
Các tế bào B nhận diện được kháng nguyên khi kháng nguyên gắn vào các thụ thể
kháng nguyên trên bề mặt tế bào. Vì vậy các epitope được tế bào B nhận diện thường có
vị trí dễ tiếp cận trên bề mặt của phân tử kháng nguyên. Các epitope này thường gồm các


Luận văn thạc sĩ Tổng quan tài liệu
Trang 14

acid amin ưa nước và hiện diện tại các vị trí gấp cuộn trong chuỗi acid amin. Các đoạn
acid amin nằm bên trong phân tử protein kháng nguyên thì không thể là epitope nhận
diện bởi tế bào B. Nhìn chung các vùng có khuynh hướng lộ trên bề mặt của protein
thường là những epitope vì các gốc acid amin này có thể tiếp cận được và ưa nước. Bề
mặt tương tác giữa kháng nguyên và kháng thể có một số chỗ lồi lõm để bổ sung cho
nhau. Sự tiếp xúc này được tạo ra giữa 15 – 22 acid amin và có khoảng 75 – 120 cầu nối
hydro, nhiều liên kết ion và tương tác kỵ nước tham gia.

1.6. DỰ ĐOÁN EPITOPE TRÊN CÁC KHÁNG NGUYÊN CỦA VIRUS CÚM
A/H5N1 BẰNG CÁC CÔNG CỤ TIN SINH HỌC [2]
Năm 2008 – 2010, PTN. CNSHPT Trường ĐHKHTN thuộc ĐHQG TP.HCM đã
được Bộ Khoa học và Công nghệ giao chủ trì triển khai đề tài khoa học công nghệ cấp

nhà nước là “Nghiên cứu ứng dụng Tin Sinh học trong việc phát triển vaccine và thuốc”,
mã số KC.04.18/06-10. Một trong hai nhóm nội dung của đề tài này là tạo và ứng dụng
các chương trình Tin Sinh học trong dự đoán epitope phục vụ việc nghiên cứu phát triển
vaccine thế hệ mới đối với virus H5N1 và đánh giá hoạt tính miễn dịch của các epitope
dự đoán.
Đối với epitope nhận diện bởi tế bào T, việc dự đoán epitope dựa trên trình tự
bằng cách sử dụng một số phương pháp đã có như mạng nơron nhân tạo (artificial neural
network), mô hình Markov ẩn (hiden Markov model), support vector machine. Ngoài ra,
việc xây dựng một hệ thống tự động dự đoán epitope dựa trên trình tự bằng cách tích hợp
các phương pháp dự đoán, cho phép lựa chọn nhiều tham số bao gồm cách chia dữ liệu
luyện mô hình dự đoán, các tham số ngưỡng ; có thể tự động tìm mô hình dự đoán tối
ưu khi muốn thay đổi hay cập nhật dữ liệu epitope thực nghiệm hay thay đổi nhóm MHC
(major histocompatibility complex). Hệ thống này được thiết kế nhằm tạo ra tính linh
động cao trong việc dự đoán những epitope của H5N1. Sau khi dự đoán được trình tự
epitope tế bào T gắn MHC, tiến hành mô phỏng trên máy tính sự gắn của phân tử peptide
với cấu trúc MHC tương ứng để kiểm tra ái lực gắn.