BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI." pot

BIỂU HIỆN CAO LIPASE KIỀM VÀ CHỊU NHIỆT
CỦA CHỦNG RALSTONIA SP. M1 Ở E.COLI.

Quyền Đình Thi, Lê Thị Thu Giang, Nguyễn Thị Thảo
Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ
Quốc gia
Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology,
Korea
MỞ ĐẦU

Lipase (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) xúc tác
phản ứng thủy phân triglyceride ở giao diện cơ chất và
nước [1] và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến
dầu, chuyển hóa sinh học, và đồng phân nhờ một số đặc
tính như đặc hiệu cơ chất, vị trí, chọn lọc đồng phân, bền
nhiệt và kiềm [2].
Lipase vi khuẩn Family I được chia thành 7 Subfamily dựa
vào mức độ tương đồng trình tự amino acid [2]. Lipase
Subfamily I.1 (P. aeruginosa [3, 4], Acinetobacter sp. [5,
6], P. fragi [7], etc), và I.2 (B. glumae [8], B. cepacia [9],
C. viscosum [10], P. luteola [11], Ralstonia sp. M1 [12],
etc) có độ tương đồng trình tự amino acid cao (>33%) [13]
và hầu hết chúng còn có một đặc điểm chung khác là gene
lipase luôn luôn gắn kết với gene thứ hai nằm ngay sau [3-
5, 9, 12, 14] hoặc trước gene lipase [6]. Gene thứ hai mã
hóa một protein được gọi là lipase-specific foldase
(modulator, activator, helper protein, hoặc chaperone) cần
thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào.

Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt
mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 đã
được nhân dòng, phân tích và xác định thuộc họ phụ I.2
Burkholderia lipase/chaperone [12]. Trong bài báo này,
chúng tôi biểu hiện năng suất cao lipase hoàn thiện LipA và
chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở E. coli BL21 dưới sự
điều khiển của T7 promoter. Cả hai protein được tinh sạch
và lipase được hoạt hóa với chaperone. Một số tính chất
hóa lý của lipase tái tổ hợp được nghiên cứu.


NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Dầu olive được mua của Sigma (Mỹ), Bacto-tryptone và
cao nấm men của Difco (Korea). Enzyme hạn chế, CIAP,
T4 ligase do Roche (Korea) cung cấp. DNA Gel-Extraction
Kit và Ni-NTA-matrice được mua của QIAGEN, PCR mix
và Minipreps của Bioner (Korea).


Hình. 1. Các plasmid biểu hiện pELipAB và pELipB dẫn
xuất từ vector biểu hiện pET22b+ cho hệ E. coli BL21.
Phân đoạn chèn và điểm cắt hạn chế sử dụng để nhân
dòng trên hình. T7Pro, T7 promoter; PelB, PelB signal
peptide; LipA, lipase hoàn thiện; His, đuôi 6-histidine;
T7Ter, T7 terminator; (LipB, 56aa chaperone cắt 56aa;
LipB, chaperone hoàn chỉnh.


Hai plasmid pELipAB và pELipB (Hình 1) được thiết kế

trước đây [12] dẫn xuất từ pET22b+ vector dưới sự kiểm
soát của T7 promoter được sử dụng để biểu hiện cao lần
lượt lipase LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở
Escherichia coli BL21 (DE3). E. coli BL21 được nuôi cấy
trong môi trường LB với ampicillin (nồng độ cuối cùng 100
(g/ml) ở 37(C. Hai trăm ml LB chứa 200 (l ampicillin (100
mg/ml) được chủng với 2 ml dịch nuôi cấy qua đêm và
nuôi cấy ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ cho tới khi
OD600nm đạt 0,6, sau đó cảm ứng với 200 (l IPTG (100
mM). Dịch nuôi cấy được ủ ở 37°C, 220 rpm trong 3 giờ
cảm ứng. Tế bào tươi được thu nhận bằng ly tâm ở 6,000
rpm trong 10 phút ở 4°C, được sử dụng tinh sạch protein
hoặc bảo quản ở -20°C để tinh sạch sau.

Chaperone (LipBhis được biểu hiện ở E. coli pELipB dưới
dạng hòa mang đuôi 6-his được tinh sạch bằng kit Ni-NTA
(QIAGEN).

Lipase LipA được biểu hiện dưới dạng thể vùi. Để tinh
sạch LipA, tủa 50 ml dịnh nuôi cấy được siêu âm (3x 1
phút, nghỉ 1 phút) trong 1 ml đệm 5 mM imidazole (pH
8,0) và dịch tế bào được ly tâm 15 phút ở 4(C tại 12,000
rpm. Qui trình được lặp lại tối thiểu 5 lần cho tới khi tủa tế
bào đồng nhất với một pha trắng. Tủa trắng đồng nhất được
hòa lại vào 1 ml đệm 8 M urea (pH 8,0) và lắc ít nhất một
giờ ở nhiệt độ phòng. Dịch LipA được sử dụng để hoạt hóa.

Hàm lượng protein được xác định theo phương pháp
Bradford với Bio-Rad protein assay kit.

Điện di SDS gel 12,5% (w/v) polyacrylamide (SDS-PAGE)
được thực hiện theo phương pháp Laemmli [15] với thiết bị
Bio-Rad.
Hoạt hóa lipase được thực hiện như công bố trước đây [12].
Hai trăm (g lipase LipA tinh sạch được hoạt hóa trong 10
ml nước cất với 220 (g (tỷ lệ phân tử 1:1) chaperone
(LipBhis. Sau 24 giờ ở 4°C, dịch nổi lipase được sử dụng
để xác định tính chất.

Hoạt tính lipase được xác định theo phương pháp pH-stat
(pH-stat 718, Metrohm, Thụy sỹ) dùng cơ chất dầu olive
như đã mô tả [16]. Một đơn vị hoạt tính được tính là hàm
lượng enzyme giải phóng ra 1 (mol acid béo mỗi phút.

Để tối ưu nhiệt độ phản ứng, hoạt tính lipase được xác định
với pH 8,0 và ở nhiệt độ khác nhau 25 - 75°C. Đối với tối
ưu pH phản ứng, hoạt tính enzyme được đo ở 55°C với các
giá trị pH khác nhau từ 7,0 đến 11,5. Để khảo sát ảnh
hưởng của nhiệt độ lên độ bền, một lượng lipase được ủ 30
phút [16] trong đệm 0,1 M Tris pH 8,0 ở các nhiệt độ khác
nhau 25 - 80°C. Đỗi với ảnh hưởng của pH lên độ bền, một
lượng lipase được ủ 30 phút ở 30°C trong đệm 0,1 M
(acetate, phosphate, Tris-HCl, glycine/HCl, hoặc
phosphate/KOH) với các giá trị pH khác nhau. Hoạt tính
còn lại được xác định ở 55°C pH 9,0. Mọi xác định đều
được thực hiện 3 lần và lấy giá trị trung bình.


KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Biểu hiện lipase và chaperone

Lipase LipA được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipAB với
năng suất cao 70 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh
3) và được tinh sạch theo phương pháp đơn giản nhiều
bước ly tâm - siêu âm. SDS-PAGE biểu thị một băng duy
nhất sau khi tinh sạch (Hình 2, kênh 4).

Chaperone được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipB với mức
độ cao 12 mg protein/gram tế bào tươi (Hình 2, kênh 1).
(LipABis tinh sạch cho một băng protein trên SDS-PAGE
(Hình 2, kênh 2).



Hình 2. SDS-PAGE của lipase LipA và chaperone LipB
tinh sạch bằng Ni-NTA biểu hiện cao ở E. coli BL21.
Nhuộm Coomassie Brilliant Blue. Kênh M, thang trọng
lượng phân tử chuẩn kDa; Kênh 1, dịch tế bào E. coli
pELipB sau khi cảm ứng IPTG; Kênh 2, chaperone
LipBhis tinh sạch bằng Ni-NTA (từ dịch E. coli pELipB);
Kênh 3, dịch tế bào E. coli pELipAB sau khi cảm ứng
IPTG; Kênh 4, lipase LipA tinh sạch (dịch tế bào E. coli
pELipAB).



Nhiệt độ tối ưu và độ bền với nhiệt

Nhiệt độ tối ưu của LipA là 55°C (Hình 3). Hoạt tính lipase

tăng dần từ 20% (25°C) lên tối đa 100% (55°C) và sau đó
giảm mạnh xuống 69% (60°C). Từ 60 - 75°C, hoạt tính
giảm rất chậm từ 69% xuống 57%. Lipase này là enzyme
ưa nhiệt.

Nhiệt độ ủ khác nhau 25 - 80°C ảnh hưởng rất rõ ràng tới
độ bền lipase trong đệm 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 trong 30
phút. Hoạt tính tương đối không xử lý nhiệt (mẫu đối
chứng) được định là 100%. Hoạt tính lipase còn lại tỷ lệ
nghịch với nhiệt độ ñ. Nó tăng lên 117% khi được ủ ở nhiệt
độ thấp (25 - 40°C) (Hình 3). ở nhiệt độ ủ 45°C hoạt tính
giữ được 84%. Sau đó, hoạt tính giảm mạnh xuống 3% ở
60°C. Lipase bị bất hoạt (<3%) ở dải nhiệt độ 60 - 80°C
(Hình 3).


Hình 3. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lipase (

)
và độ bền (

). Đối với tối ưu nhiệt độ, hoạt tính của 1 g
lipase hoạt hóa được đo bằng phương pháp pH-stat với
1% dầu olive làm cơ chất ở pH 8,0 và nhiệt độ khác nhau
25 - 75C. Đối với độ bền nhiệt, 1 g lipase được ủ trong
đệm 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, trong 30 phút, ở nhiệt độ
khác nhau 25 - 80°C, và hoạt tính được xác định bằng
phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH
9,0 và 55°C.

pH tối ưu và độ bền pH

Hoạt tính tối ưu của LipA được khảo sát ở 55°C với dải pH
7,0 - 11,5 (Hình 4). Lipase biểu thị hoạt tính tối ưu ở pH
10,75. Hoạt tính tương đối tăng chậm và dần dần từ 0,4% ở
pH 7,0 lên 14,1% ở pH 8,5 sau đó không thay đổi nhiều
13,7 - 15,5% trong dải pH 8,5 - 9,75. Hoạt tính còn lại tăng
mạnh từ 15,5% ở pH 9,75 lên hoạt tính tối đa 100% ở 10,75
cũng như giảm mạnh sau tối đa. Tại pH 11,5 lipase mất
hoạt tính. Lipase này rất kiềm.
pH khác nhau của đệm ủ 0,1 M ảnh hưởng rõ rệt lên độ bền
lipase sau 30 phút ủ ở 30°C. Hoạt tính tương đối lipase
không ủ (4°C) làm đối chứng được định là 100%.

Hình 4. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính lipase (

) và đ
ộ
bền (

). Để tối ưu pH, hoạt tính của 1 g lipase được đo
bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất
ở 55°C và pH khác nhau pH 7,0 - 11,0. Đo độ bền pH, 1 g
enzyme được xử lý trong đệm 0,1 M với pH khác nhau
pH 4,0 - 12,5 ở 30°C trong 30 phút và hoạt tính lipase
được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu
olive làm cơ chất ở 55°C và pH 9,0.

Độ bền LipA rất thấp ở dải pH 4,0 - 6,0, hoạt tính còn lại
tăng dần từ 5% (pH 4,0) lên 45% (pH 6,0) (Hình 4). Hoạt
tính lipase còn lại một nửa (45 - 55%) ở pH 6,0 - 8,0 và
tăng mạnh tới tối đa ở pH 9,0 (112% hoặc 131% lần lượt
đối với đệm Tris-HCl hoặc glycine/KOH). Khi pH tăng lên
10, hoạt tính lipase tương đối là 88%. Sau đó hoạt tính
giảm mạnh xuống 9% ở pH 11,0. ở pH 11,0 - 12,5, LipA
biểu thị độ bền thấp (8 - 9%).


KẾT LUẬN

Lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 được biểu
hiện cao trong E. coli BL21 với mức lần lượt là 70 và 12
mg/g tế bào tươi. Lipase sau khi hoạt hóa hoạt động ở nhiệt
độ và pH tối ưu 55°C và 10,75. Đây là một enzyme kiềm
và chịu nhiệt. Độ bền nhiệt tới 45°C, trong môi trường
kiềm pH 8,5 - 10,0.


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Marinelle, M., M. Holmquist and K. Hult, 1995. In the
interfacial activitation of Candida antarctica lipase A and B
as compared with with Humicola lanuginosa lipase.
Biochim. Biocphys. Acta 1258: 272-276.
2. Jaeger, K E. and T. Eggert, 2002. Lipases for
biotechnology. Curr. Opinion in Biotech. 13: 390-397.
3. Chihara-Siomi, M., K. Yoshikawa, N. Oshima-
Hirayama, K. Yamamoto, Y. Sogabe, T. Nakatani, T.

Nishioka and J. Oda, 1992. Purification, molecular cloning,
and expression of lipase from Pseudomonas aeruginosa.
Arch. Biochem. Biophys. 296: 505-513.
4. Wohlfarth, S., C. Hoesche, C. Strunk and U. K. Winkler,
1992. Molecular genetics of the extracellular lipase of
Pseudomonas aeruginosa PAO1. J. Gen. Microbiol. 138:
1325-35.
5. Sullivan, E. R., J. G. Leahy and R. R. Colwell, 1999.
Cloning and sequence analysis of the lipase and lipase
chaperone-encoding genes from Acinetobacter
calcoaceticus RAG-1, and redefinition of a proteobacterial
lipase family and an analogous lipase chaperone family.
Gene 230: 277-286.
6. Kok, R. G., J. J. v. Thor, I. M. Nugteren-Roodzant, B.
Vosman and K. J. Hellingwerf, 1995. Characterization of
lipase-deficient mutants of Acinetobacter calcoaceticus
BD413: identification of a periplasmic lipase chaperone
essential for the production of extracellular lipase. J.
Bacteriol. 177: 3295-3307.
7. Aoyama, S., N. Yoshida and S. Inouye, 1988. Cloning,
sequencing and expression of the lipase gene from
Pseudomonas fragi IFO-12049 in E. coli. FEBS Lett. 242:
36-40.
8. Frenken, L. G., M. R. Egmond, A. M. Batenburg, J. W.
Bos, C. Visser and C. T. Verrips, 1992. Cloning of the
Pseudomonas glumae lipase gene and determination of the
active site residues. Appl. Environ. Microbiol. 58: 3787-
3791.
9. Jorgensen, S., K. W. Skov and B. Diderichsen, 1991.
Cloning, sequence, and expression of a lipase gene from

Pseudomonas cepacia: lipase production in heterologous
hosts requires two Pseudomonas genes. J. Bacteriol. 173:
559-567.
10. Taipa, M. A., K. Liebeton, J. V. Costa, J. M. Cabral and
K. E. Jaeger, 1995. Lipase from Chromobacterium
viscosum: biochemical characterization indicating
homology to the lipase from Pseudomonas glumae.
Biochim. Biophys. Acta 1256: 396-402.
11. Litthauer, D., A. Ginster and E. Skein, 2002.
Pseudomonas luteola lipase: a new member of the 320-
residue Pseudomonas lipase family. J. Enzyme Microb.
Technol. 30: 209-215.
12. Quyen, D. T., T. T. Nguyen, T. T. G. Le, H. K. Kim, T.
K. Oh and J. K. Lee, 2004. A novel subfamily I.2 lipase
and its chaperone from Ralstonia sp. M1 with new
effectively refolding ratio of lipase:chaperone and an
evidence for genome deletions of these genes in Ralstonia
solanacearum species. Submitted to Gene.
13. Arpigny, J. L. and K. E. Jaeger, 1999. Bacterial
lipolytic enzymes: classification and properties. Biochem.
J. 343: 177-183.
14. Frenken, L. G., J. W. Bos, C. Visser, W. Muller, J.
Tommassen and C. T. Verrips, 1993. An accessory gene,
lipB, required for the production of active Pseudomonas
glumae lipase. Mol. Microbiol. 9: 579-589.
15. Laemmli, U. K., 1970. Cleavage of structure proteins
during the assembly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227: 680-685.
16. Quyen, D. T., C. Schmidt-Dannert and R. D. Schmid,
2003. High-level expression of a lipase from Bacillus

thermocatenulatus BTL2 in Pichia pastoris and some
properties of the recombinant lipase. Protein Expr. Purif.
28: 102-110.


Lời cám ơn:
Công trình này được thực hiện nhờ sự tài trợ kinh phí của
Chương trình Nghiên cứu Cơ bản trong lĩnh vực Khoa học
Tự nhiên năm 2004-2005.


SUMMARY

Overexpression of a alkaline and thermophilic lipase
from Ralstonia sp. M1 in E. coli

Quyen Dinh Thi, Le Thi Thu Giang, Nguyen Thi Thao
Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science
and Technology
Jung Kee Lee, Tae-Kwang Oh
Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology,
Korea


The mature lipase LipA and its 56aa-truncated chaperone
LipBhis (with 6xhis-tag) from Ralstonia sp. M1 were
over-expressed in E. coli BL21 under the control of T7
promoter with a high level of 70 mg and 12 mg protein per
gram of wet cells, respectively. The simply purified lipase
LipA was effectively refolded with its by Ni-NTA purified

chaperone LipBhis in molar ratio 1:1 at 4°C for 24 hours
in H
2
O. The in vitro refolded lipase LipA had an optimal
activity in the temperature range of 50 - 55°C and was
stable up to 45°C with more than 84% activity retention.
The maximal activity was observed at pH 10.75 for
hydrolysis of olive oil and found to be stable over alkaline
pH range 8.0 - 10.5 with more than 52% activity retention.

Người thẩm định khoa học: PGS. TS. Nguyễn Thị Ngọc
Dao, Phòng Enzyme học, Viện Công nghệ Sinh học.