BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID GEN 16S-ARN RIBOSOM" ppsx

PHÂN LOẠI CHỦNG VI KHUẨN PS7-1 CÓ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG FUSARIUM OXYSPORUM
TRÊN CƠ SỞ PHÂN TÍCH TRÌNH TỰ NUCLEOTID
GEN 16S-ARN RIBOSOM

Nguyễn Thị Tuyết Nhung, Nguyễn Minh Anh, Lê
Thanh Hòa, Nguyễn Ngọc Dũng
Viện Công nghệ Sinh học.

Cây lúa nước đã, đang và mãi là cây trồng số một ở Việt
Nam. Chiến lược hướng tới một nền nông nghiệp bền vững
sinh thái ở Việt nam đã được thiết lập. Để góp phần thực
hiện chiến lược này, các vi khuẩn có ích cho cây lúa ở đồng
bằng sông Hồng được quan tâm nghiên cứu trong những
năm qua (Nguyễn Ngọc Dũng và cộng sự, 2000). Một trong
những nhóm vi khuẩn hữu ích cho cây lúa cần được khai
thác là vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh quang bởi chúng
được coi là tác nhân sinh học tiềm năng trong phòng chống
vi nấm gây bệnh cây trồng (O,Sullivan và cộng sự, 1992,
Berg và cộng sự, 2000). Các chủng pseudomonad sinh
huỳnh quang vùng rễ cây lúa đã được phân lập và chọn lọc
theo khả năng đối kháng Fusarium oxysporum, tác nhân
gây bệnh khô vằn cây lúa (Nguyễn Thị Tuyết Nhung và
cộng sự, đang in).

Do có những đặc điểm riêng hình thành trong suốt qúa
trình tiến hoá nên các gen sao mã các axit ARN ribosom
(ARNr) ở vi sinh vật nhân sơ, đặc biệt các gen 16S- và 23
S-ARNr, được sử dụng như một công cụ trong việc phân
loại và xác định mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi
khuẩn ( Woese, 1987). Theo Ludwig và Schleifer ( 2000)

đã có tới hơn 16000 gen 16S-ARNr từ các chủng vi khuẩn
đã được xác định trình tự nucleotid.

Trong bài báo này, vị trí phân loại của chủng Ps7-1 sẽ
được trình bày trên cơ sở phân tích trình tự nucleotid gen
16S-ARN ribosom (16S-ARNr).

I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Vi sinh vật:

Chủng phân lập Ps7-1 có nguồn gốc từ đất bám rễ cây
lúa ở Kim Chung, Đông Anh, Hà Nội và cho khả năng đối
kháng F. oxysporium cao trong điều kiện in vitro (Nguyễn
Thị Tuyết Nhung và cộng sự, đang in) và chủng E. coli
DH5 đã được sử dụng.

2. Các phương pháp phân loại:

a. Phương pháp phân loại theo kiểu hình:

Phương pháp phân loại vi khuẩn được chuẩn hoá API
20NE (BioMerieux Marcy, Pháp) đã được sử dụng. Theo
nhà cung cấp, hệ thống API 20NE chỉ dùng để phân loại
các nhóm vi khuẩn hình que, Gram âm, không thuộc Họ
Enterobactieraceae. Ngoài các đặc tính theo API 20NE,
các đặc điểm kỵ khí không bắt buộc và kháng tetraxyclin
đã được xác định. Đặc điểm kỵ khí không bắt buộc được
tiến hành theo phương pháp cấy thẳng đứng vào môi
trường LB rắn có chiều cao 10 cm trong ống nghiệm; mẫu

được ủ ở 30
o
C và đọc kết quả sinh trưởng sau 24 và 48 giờ
ủ. Tính mẫn cảm đối với tetraxyclin (30g/ml) được tiến
hành theo phương pháp Krieg và Doebereiner (1984). Theo
đó, tế bào Ps7-1 nuôi qua đêm được ria trên môi trường LB
rắn, sau đó đặt đĩa giấy ( : 5 mm) thấm đậm dung dịch
tetraxyclin lên trên. Chủng E. coli DH5 được sử dụng làm
đối chứng. Quan sát sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh
đĩa giấy thấm sau 24 giờ ủ.

b. Phương pháp phân loại theo kiểu gen:

-Thu ADN tổng số:

ADN tổng số được tách chiết theo phương pháp Masterson
và cộng sự (1985).

-Thu nhận gen 16S-ARNr:

Gen 16S-ARNr được thu nhận bằng phản ứng nhân bản
gen (PCR) với cặp mồi có trình tự như sau. Mồi thuận
chiều Prf: 5,-GAGTTTGATCATGGCTAA-3,., tương ứng
với các vị trí nucleotid 7-26 của gen 16S-ARNr từ E. coli;
mồi nghịch chiều Prr: 5,- AGGAGGTGATCCAGCC-3,,
tương ứng với các vị trí 1540-1524 từ E. coli, do Genset-
Oligos Singapore, cung cấp. Hỗn hợp phản ứng nhân bản
gen có thể tích 25 l với thành phần: 16,7 l nước sạch ion,
2,5 l đệm Taq(10x), 2,5 l dung dịch dNTP (10mM), 1,0
l dịch mồi Prf (10mM), 1,0 l dịch mồi Prr (10mM), 1,0

l dịch ADN khuôn và 0,3 l Taq Polymerase. Phản ứng
được thực hiện với chu trình nhiệt như sau: Giai đoạn đầu,
ADN được biến tính ở 95
o
C trong 1 phút 30 giây, tiếp tục
biến tính ở 94
0
C trong 1 phút, kế tiếp mồi được gắn ở nhiệt
độ 52
0
C và phản ứng kéo dài chuỗi ở 72
0
C trong 1 phút 20
giây. Giai đoạn chính được lặp lại 30 lần chu kỳ nhiệt cơ
bản giống ở giai đoạn đầu, chỉ khác ở chỗ ADN được biến
tính một lần ngay ở nhiệt độ 94
0
C trong 1 phút, tiếp sau
pha cuối cùng phản ứng kéo dài chuỗi được duy trì ở 72
0
C
trong 10 phút và sản phẩm được bảo quản ở 4
0
C. Kết quả
phản ứng được kiểm tra bằng điện di agarose 0,8%. Sản
phẩm nhân bản gen được gắn vào vectơ pCR2.1 theo chỉ
dẫn của nhà cung cấp TA Cloning Kit, Invitrogen. Vectơ
pCR2.1 tiếp nhận sản phẩm PCR được chuyển nạp vào
dòng tế bào INVaF’ và chọn lọc khuẩn lạc theo phương
pháp kháng sinh và chỉ thị màu (SAMBROOK và

RUSSELL, 2001). ADN plasmid tái tổ hợp được tách chiết
với bộ hoá chất QIAprep Spin Plasmid Extraction Kit
(QIAGEN Inc.). Độ dài sản phẩm dòng hoá được kiểm tra
trên thạch agarose 0.8%, sau khi cắt ADN của plasmid tái
tổ hợp bằng enzym giới hạn EcoRI.

3. Giải trình trình tự chuỗi nucleotit và xử lý số liệu:

Chuỗi ADN chứa gen 16S- ARNr và nột phần plasmid
được giải trình tự trên máy giải trình tự tự động ABI 377
PRISM (Perkin- Elmer). Mồi xuôi M13F
(5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’) và mồi ngược M13R
(5’CAGGAAACAGCTATGAC3’) dùng trong giải trình tự
là các chuỗi cố định của vectơ và nằm gần hai đầu biên của
ADN tái tổ hợp cần giải trình. Trong quá trình giải trình,
một mồi khác ký hiệu là Seq16SF
(5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3') nằm cách đầu 5’
của đoạn gen 16S ARNr nghiên cứu khoảng 300-320
nucleotit đã được thiết kế bởi máy không có khả năng đọc
một lần hết chiều dài chuỗi. Giải trình được thực hiện nhiều
lần với số lượng nhiều plasmid tái tổ hợp nhằm thu được
kết quả chính xác.

Chuỗi được xứ lý nucleotit bằng chương trình SeqEd1.0.3;
sắp xếp, đối chiếu trình tự tương ứng của đoạn gen bằng hệ
chương trình máy tính AsemblyLIGN 1.9; MacVector 6.5.3
(Oxford Molecular Inc.) và chương trình GENDOC 2.5
(Karl Nicholas, 1997). Giám định các chủng được thực
hiện bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen thông qua
chương trình BLASTn có tại

().

4. Chọn chuỗi so sánh:

Các chuỗi nucleotit 16S ARNr của một số chủng có trình tự
tương ứng từ Pseudomonas spp. tại Ngân hàng Gen được
thu nhận bằng cách truy cập Ngân hàng Gen thông qua số
thư mục ngân hàng và được sử dụng để so sánh đối chiếu
với trình tự nucleotid từ chủng Ps7-1 (Bảng 1).
Bảng 1 Các chủng Pseudomonas spp. được dùng để so sánh




5. Địa điểm tiến hành nghiên cứu:

Công việc tách chiết ADN tổng số, PCR, dòng hoá sản
phẩm và một phần phân tích số liệu được thực hiện tại
phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất và Phòng máy, Viện Công
nghệ Sinh học (Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).

Công việc giải trình trình tự và xử lý số liệu giám định
phân tử được tiến hành tại Viện nghiên cứu Y học
Queensland (Australia).

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Phân loại theo kiểu hình:

Như đã nêu, hệ thống phân loại vi khuẩn được chuẩn

hóa API 20NE là tập hợp của 21 phản ứng sinh lý sinh hoá
dùng để xác định vi khuẩn hình que, gram âm, không có
nhu cầu dinh dưỡng đặc biệt, không thuộc Họ
Enterobacteriaceae. Kết quả phân loại chủng Ps7-1 theo hệ
thống API 20NE cho thấy, đối với nhóm 8 phản ứng cơ
bản, chủng này cho kết quả âm tính với khử nitrat, tạo
indol, tổng hợp urease, thủy phân esculin và tổng hợp -
galactosidase; và cho 3 kết quả dương tính là lên men
glucose, thủy phân gelatin và tổng hợp arginin dihydrolase.
Trong tổng số 12 hợp chất cácbon đã cho, chủng Ps7-1
không có khả năng sử dụng arabinose, maltose,, malat,
citrat và phenol-axetat. Với những kết quả như vậy, chủng
Ps7-1 được xác định bởi mã số 4156534. Đối chiếu Bảng
chỉ số Analytical Profile Index, 5
th
edition, BioMerieux
S.A, 1992, mã số 4156534 không tồn tại. Tuy vậy, căn cứ
vào các chứ số đầu tiên của mã số có trong bản chỉ dẫn,
chủng Ps7-1 có thể được xếp vào vị trí phân loại thuộc
giống Chromobacterium bởi mã số của các chủng có chữ số
ban đầu từ 4150 tới 4156 đều được xếp vào loài Ch.
violaceum. Theo Sneath (1984), một trong những đặc điểm
cơ bản của giống Chromobacterium là kỵ khí không bắt
buộc và mẫn cảm với tetraxyclin (30g/ml. Kết quả xác
định những đặc tính này đối với chủng Ps7-1 cho thấy,
chủng này là hiếu khí bắt buộc và có khả năng kháng
tetraxyclin ở nồng độ đã nêu. Theo Norberto và Palleroni
(1984), đây là những đặc tính cơ bản của vi khuẩn Chi
Pseudomonas. Ngoài ra, như đã nêu, chủng Ps7-1 được
phân lập trên môi trường S1, một môi trường thể hiện tính

chọn lọc cao đối với vi khuẩn pseudomonad sinh huỳnh
quang (Gould và cộng sự, 1985). Chính vì vậy, đến đây có
thể tạm thời kết luận, chủng Ps7-1 khó có thể là một chủng
Chromobacterium.

2. Phân loại theo kiểu gen:

Gen 16S-ARNr từ chủng Ps7-1 đã được thu nhận
bằng phản ứng nhân bản gen PCR; trình tự của nó cũng đã
được xác định và đăng ký trong ngân hàng gen quốc tế với
số thư mục AF521651. Một phần của kết quả giám định
chủng Ps7-1 bằng phương pháp truy cập Ngân hàng Gen
thông qua chương trình BLASTn cho thấy chủng Ps7-1 có
đọ tương đồng cao nhất với 332 chủng thuộc Pseudomonas
và một phần kết quả này được trình bày trong bảng 2.
Bảng 2 Mức độ tương đồng trình tự nucleotid gen 16S-
ARNr của chủng Ps7-1 với một số chủng Pseudomonas
spp.




Căn cứ vào các kết quả giám định nhận được từ ngân hàng
gen có thể khẳng định rằng chủng Ps7-1 là một chủng
thuộc Chi Pseudomonas, bởi sự so sánh chuỗi trình tự
nucleotid của gen 16S-rARN từ chủng này với trình tự từ
các chủng vi khuẩn có trong ngân hàng gen cho giá trị tin
cậy cao nhất thuộc về các chủng của Chi Pseudomonas. Để
làm sáng tỏ hơn về vị trí phân loại của chủng Ps7-1, mối
quan hệ di truyền của chủng này được xác định dựa trên sự

thiết lập cây phả hệ với một số chủng Pseudomonas đặc
trưng bằng hệ chương trình máy tính MEGA 2.1 ( Hình 1 ).

Hình 1: Cây phả hệ ( không có rễ ) của các chủng
Pseudomonas được thiết lập theo chương trình MEGA 2.1.
Pficu: P. ficuserectae JCM 2400T, Psyr+gly: P. syringae
pv glycinea MAFF 302260,
Pmeli: P. meliae MAFF 301463T, Psyr+pha: P. syringae
pv. phaseolicola MAFF 302282,
Pchlor: P. chlororaphis DSM 50083T, Pcost: P. costantinii
CFBP 5705,
Pman: P. mandelii CIP 105273, PfluoATCC: P. fluorescens
ATCC 17386, Pfluor: P. fluorescens CHAO.


Cây phả hệ cho thấy, chủng Ps7-1 cùng với 2 chủng P.
fluorescent lập nên một nhóm riêng, trong khi đó giữa các
chủng còn lại thuộc các loài Pseudomonas khác đều cho
những khoảng cách nhất định. Điều này nói lên rằng chủng
Ps7-1 có họ hàng gẫn gũi nhất vỡi loài P. fluorescent.

Việc xác định một chủng vi khuẩn dựa trên hệ thống
API 20NE và phân tích trình tự gen 16S-ARNr cho kết quả
phân loại khác nhau cũng đã được đề cập trong báo cáo
khoa học, ví dụ như chủng QC14-3-8 được xác định thuộc
loài P. aeruginosa (91,8%) theo hệ thống API 20NE,
nhưng theo phương pháp phân tích gen 16S-ARNr thì
chủng này thuộc loài P. putida (99%) (Lottmann và cộng sự
, 2000). Như vậy, ở đây sự khác nhau chỉ thể hiện ở mức độ
loài, không xẩy ra ở định loại chi. Nhưng, như đã nêu,

trong trường hợp phân loại chủng Ps7-1 theo hệ thống API
20NE cho kết quả cách biệt khá lớn, nếu không nói hoàn
toàn khác, so với phương pháp phân loại tự nhiên dựa vào
trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr, mặc dù theo
nhà cung cấp dịch vụ API 20NE, các chủng thuộc Chi
Pseudomonas là một trong nhũng đối tượng phù hợp của hệ
thống xác định được chuẩn hoá này.

Tóm lại, cùng với những đặc tính phân lập có chọn lọc,
hiếu khí bắt buộc và kháng tetraxyclin, kết quả phân tích
trình tự chuỗi nucleotid của gen 16S-ARNr cho thấy chủng
Ps7-1 là một chủng Pseudomonas, chứ không thuộc chi
Chromobacterium và có quan hệ họ hàng gần nhất với loài
P. fluorescens, cùng các chủng P. fluorescens ATCC 17386
và chủng P. fluorescens CHAO lập nên một nhóm riêng.

Công trình này được tài trợ bởi Viện Công nghệ Sinh học,
Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và hỗ trợ bởi Hội
đồng Khoa học Tự nhiên, Bộ Khoa học Công nghệ & Môi
trường, tài khóa 2002.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Anzai,Y., Kim,H., Park,J.Y., Wakabayashi,H. and
Oyaizu,H. (2000). Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50,
1563-1589
2. Berg, G., Kurze, S., Buchner, A., Wellington, E.M. and
Smalla, K., 2000. Successful
strategy for the selection of new strawberry-associated
rhizobacteria antagonistic

to Verticillum wilt. Can. J. Microbil., 46, p. 1128-1137.
3. Galdzicka, M., Plassmeyer,M.L., Blaine,L.D.,
Pienta,P.A. and Gillevet, P.M.
(Chưa công bố).
4. Gould, W.D., Hagedorn, C., Bardinelli, T.R. and R.M.
Zablotowicz, 1985. New selective media for Enummeration
and recovery of fluorescent Pseudomonads from
Various Habitats. Appl. Env. Microbiol., 49, p. 28-32.
5. Krieg, N.R. and Doebereiner,J., 1984. Genus
Azospirillum. In: Krieg, N.R.,
& Holt, J.G. (eds): Bergey, s Manual of Systematic
Bacteriology. The Williams
and Wilkin Co., Baltimore.
6. Lottmann, J., Heuer, H., Vries, J., Mahn, A., Duering,
K., Wackernagel, W., Smalla, K.,
Berg, G., 2000. Establishment of introduced
antagonistic bacteria in the
rhizosphere of transgewnic potatoes and their effect on
the bacterial community.
EFMS Microbiol., Ecol., 33, 41-49.
7. Ludwig, W. and Schleifer, K.H., 2000. Phylogeny of
Bacteria beyond the 16S-rRNA
Standerd. Vermicon. http:w.w.w.
ermicon.de/english/news/Science/khs99111.htm
8. Masterson, R.V., Prakash, R.K. and Arthely, A.G., 1985.
Conservation of symbiotic
nitrogen fixation gene sequences in Rhizobium
japonicum and Bradyrhizobium
japonicum. J. Bacteriol., 163, 2-25.
9. Moore, E.R.B., Mau,M., Arnscheidt,A., Boettger,E.C.,

Hutson, R.A., Collins,M.D., Van de Peer,Y., De
Wachter,R. and Timmis,K.N.(1996). Syst. Appl. Microbiol.
19, 478-492.
10. Munsch, P., Alatossava,T., Marttinen,N., Meyer,J M.,
Christen,R. and Gardan,L. (2002). Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. đang in.
11. Nguyễn Ngọc Dũng, Hồ Thị Kim Anh, Vũ Thanh,
2000. Vi khuẩn cố định nitơ vi hiếu
khí khu trú trong rễ lúa ở một số địa điểm thuộc đồng
bằng sông Hồng. Tuyển tập
Những vấn đề Nghiên cứu cơ bản trong sinh học. Hội
Nghị Sinh học quốc gia,
Hà Nội, Nhà XB Đại học quốc gia Hà Nội.
12. Norberto, J. and Palleroni, 1984. Genus Pseudomonas.
In: Krieg, N.R. & Holt, J.G. (eds):
Bergey, s Manual of Systematic Bacteriology. The
Williams and Wilkin, Co.,
Baltimore.
13. O.Sullivan, D.J., O.Gara, F., 1992. Traits of fluorescent
Pseudomonas spp. involved in
suppression of plant root pathogens. Microbiol. Rev.,
56, 662-672
14. Ramette, A., Moenne-Loccoz,Y. and Defa go, G.
(2001). Mol. Plant Microbe Interact. 14 (5), 639-652
15. Sawada, H. (1997). Nộp trực tiếp vào Ngân hàng gen
16. Verhille,S., Baida,N., Dabboussi,F., Izard,D. and
Leclerc,H. (1999). Syst. Appl. Microbiol. 22, 45-58
17. Woese, C.R., 1987. Bacterial evolution. Microbiol.
Rev., 51, 221-271

SUMMARY

TAXONOMICAL POSITION OF THE ISOLATE PS7-
1 CAPABLE OF ANTAGONISM AGAINST
FUSARIUM OXYSPORUM BASED ON THE
ANALYSIS OF THE 16S-rRNA GENE NUCLEOTIDE
SEQUENCE.

NGUYEN THI TUYET NHUNG et al

To establishing the taxonomical position of the bacterial
strain Ps7-1 which was isolated from the rice rhizosphere
soil in Kim Chung, Dong Anh, Ha Noi on the selective
medium for fluorescent pseudomonad bacteria, being gram
-negative and possessed the great capable of antagonism to
the fungal phytopathogene F. oxysporum , the different
methods have been used. By the API 20NE system – a
phenotypically standardized micromethod combining 8
conventional tests and 12 assimilation tests for
identification of non-fastidious Gram-negative rods not
belong to the Enterobacteraceae, the train Ps7-1 was
positioned with the code number 4156534 which does not
be present in the catalog, nevertheles with a such code
number it also could be thought that this strain may be
belong to the group Chromobacterium. The genotypical
classification method based on the nucleotide sequence of
16s-rRNA gene has been applied to grouping the strain
Ps7-1. The 16S-rRNA gene from Ps7-1 has been obtained
by Polymerase Chain Reaction with primers Prf: 5,-
GAGTTTGATCATGGCTAA-3 and Prr: 5,-

AGGAGGTGATCCAGCC-3, cloned in Vector pCR2.1and
automatically sequenced by ABI 377 PRISM (Perkin-
Elmer); to sequencing 3 used primers are M13F
5’GTTTTCCCAGTCACGAC3’, M13R
5’CAGGAAACAGCTATGAC3’ and Seq16SF
5’CAGTGGGGAATATTGGACAAT 3'. The nucleotide
sequence of the 16s-rRNA gene from Ps7-1 has been
checked by the program SeqEd1.0.3 and registered in
GenBank with the accession number AF521651. This
sequence has been aligned with the registered sequences at
Genbank. Results of analyses showed that the isolate Ps7-1
possesses the highest homology with the P. fluorescens
(99%). Based on the nucleotid sequences of the 16s-rRNA
gene from the choosen strains of the known Pseudomonas
species, a dendogram was presented. Ps7-1 and the strains
P. fluorescens ATCC 17386 P. fluorescens CHAO built a
common group. Additionally, the isolate Ps7-1 is the
strictly aerobic one and resistant to tetracycline; those are
the main characteristics of genus Pseudomonas. With such
results it may be concluded that the Ps7-1 strain belongs to
P. fluorescens.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Trương Nam Hải.