BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM" pot

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR KHẢO SÁT SƠ BỘ
TẦN SUẤT PHÂN BỐ CÁC ALEN CỦA LOCUS
D7S820 Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,Lương Thị Yến,
Lê thị Bích Trâm.
Cục Kỹ thuật Hóa-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ, Tổng cục
KHKT & CN- Bộ Công an

Nhận dạng cá thể bằng kỹ thuật phân tích ADN trong công
tác hình sự là một phương pháp được quan tâm và đi sâu
nghiên cứu từ nhiều năm nay bởi các nhà khoa học ở nhiều
nước trên thế giới. So với các phương pháp trước đây,
phương pháp này có nhiều ưu điểm nổi bật như khắc phục
được tình trạng số lượng mẫu quá ít, mẫu bị suy giảm
nghiêm trọng do tác động của môi trường và sự che dấu của
thủ phạm. Mặt khác, phương pháp phân tích ADN còn cho
kết quả với độ chính xác cao, nếu sử dụng từ 6 đến 9 đoạn
gen sẽ cho một kết quả gần như tuyệt đối [9].

Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu về các locus gen đa
hình như D1S80 [1], TH01 [1,4], TPOX [3], D17S5 và
ApoB [1] Trên thế giới, khoảng 12 locus đã được sử dụng
rộng rãi trong y học hình sự như TH01, TPOX, D5S818,
D7S820 Các locus được lựa chọn này đều mang các alen
có trình tự lặp lại ngắn (kích thước cách nhau 4bp). So với
các đoạn ADN có trình tự lặp lại dài, đoạn lặp lại ngắn có
khả năng ít bị biến tính nên rất có ích lợi trong công tác
giám định.

Tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử - Cục Kỹ thuật

Hoá-Sinh và Tài liệu nghiệp vụ-Tổng cục VI-Bộ Công an,
chúng tôi tiến hành nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR
khảo sát sơ bộ tần suất phân bố các alen của locus D7S820
ở một nhóm cá thể người Việt Nam phục vụ công tác nhận
dạng cá thể.

I. Phương pháp nghiên cứu

1. Nguyên liệu:

- Máu tươi của những người khoẻ mạnh không có cùng
quan hệ huyết thống do Viện Quân y 108 cung cấp.

- Hoá chất: Hoá chất cho tách chiết ADN (hãng Sigma);
hoá chất dùng cho quá trình PCR đối với locus D7S820
(mồi đặc hiệu cho locus D7S820 của hãng Pharmacia-Thuỵ
Điển; Taq ADN polymeraza-của Viện Sốt rét Ký sinh trùng
và Côn trùng Trung ương); hoá chất dùng cho điện di và
nhuộm băng ADN (của các hãng Promega, Pharmacia,
Sigma, MERCK).

2. Phương pháp:

a. Tách ADN:

ADN từ máu được tách chiết theo phương pháp chuẩn dùng
phenol và chloroform để tinh sạch [4]. Kết quả tách chiết
thu được ADN có độ tinh sạch khá cao với OD trung bình
1,75 và hàm lượng >50ng/l.

b. Kỹ thuật PCR:

Quá trình PCR với các giai đoạn cơ bản: biến tính, gắn mồi
và tổng hợp. Quá trình được thực hiện với các nhiệt độ gắn
mồi khác nhau được lựa chọn từ 50
o
C đến 58
o
C. Sản phẩm
PCR sau đó được kiểm tra trên gel agaroza 2%, nhuộm
ethidium bromide (25g/ml).

c. Kỹ thuật điện di:

Các mẫu sau khi thực hiện quá trình PCR đã được kiểm tra
trên gel agaroza 2% sau đó được điện di trên gel
polyacrylamide 6% sử dụng ure 7M. Băng ADN được phát
hiện bằng phương pháp nhuộm bạc của Bassam, 1991 [6].

d. Phương pháp chọn lọc và xây dựng thang alen

* Đánh số alen theo quy ước riêng: Dựa vào các alen
quan sát được của các mẫu khác nhau trên bản điện di,
chúng tôi chọn ra các mẫu mang các alen khác nhau và
đánh số alen theo thứ tự từ dưới lên trên (đánh số alen từ
băng ADN có trọng lượng phân tử thấp nhất đến băng
ADN có trọng lượng phân tử cao nhất). Việc đánh số ở đây
chỉ mang tính quy ước sao cho mỗi alen xác định được có
ký hiệu riêng, vì đây là quá trình khảo sát ban đầu chưa có
thang alen chuẩn để so sánh.

* Xây dựng thang alen: Trong quá trình đánh số, chúng tôi
đồng thời chọn ra những mẫu mang những alen khác nhau
tập hợp lại để tạo thang alen. Thang alen được tạo bằng
phương pháp trộn mẫu.

* Chuẩn thang alen: ký hiệu lại các alen đã khảo sát
được theo quy ước quốc tế. Alen của locus D7S820 được
ký hiệu từ 6 đến 14 căn cứ vào số đoạn lặp của mỗi alen.

Chúng tôi tiến hành chuẩn thang alen như sau: lấy kết
quả tần suất alen tính được so sánh với tần suất alen đã
khảo sát bằng thang alen chuẩn ở một nhóm người Đông
Nam Á. Chuẩn trước hai alen theo tần suất tương đương
(thường chọn alen có tần suất lớn nhất và nhỏ nhất), từ đó
ký hiệu lại các alen khác theo alen đã chuẩn.

II. Kết quả và bàn luận

1. Kết quả tối ưu nhiệt độ gắn mồi quá trình PCR :

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR ở các nhiệt độ gắn
mồi khác nhau cho thấy: ở tất cả các điều kiện nhiệt độ gắn
mồi từ 50
o
C đến 58
o
C đều có sự hình thành sản phẩm PCR
thể hiện ở sự có mặt của các băng ADN trên bản gel
agaroza. Tuy nhiên, ở nhiệt độ gắn mồi 50

o
C, 52
o
C, 54
o
C
và 56
o
C băng ADN xuất hiện mờ hơn hẳn so với ở nhiệt độ
gắn mồi 58
o
C. Điều này chứng tỏ ở nhiệt độ gắn mồi 58
o
C,
quá trình PCR là tối ưu nhất (sản phẩm tạo ra nhiều nhất so
với các nhiệt độ gắn mồi còn lại). Vì vậy, điều kiện đã tối
ưu này được chúng tôi sử dụng để thực hiện quá trình PCR
đối với các mẫu nghiên cứu (hình 1).

Hình 1. Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR ở một số mẫu trên
gel agaroza theo điều kiện nhiệt độ gắn mồi 58
o
C


2. Kết quả chọn lọc alen và tạo thang alen :

Sử dụng các phương pháp đã nêu chúng tôi đã tạo được
thang alen chuẩn cho locus D7S820. Thang alen này (ký
hiệu L) bao gồm 7 alen khác nhau (hình2) được ký hiệu từ

alen số 1 đến alen số 7.

Hình 2. Thang alen chuẩn của locus D7S820 với 7 alen
khác nhau được phân tách bằng kỹ thuật điện trên gel PA
biến tính.



3. Kết quả tính tần suất alen của locus D7S820:

Căn cứ vào thang alen đã tạo được ở trên, chúng tôi đã xác
định và tính tần suất alen của 64 mẫu ADN khác nhau.
Đồng thời, chúng tôi cũng so sánh tần suất tính được với
tần suất tương đương của người Việt Nam đã được khảo sát
[1].

* Kết quả tính toán và so sánh tần suất và chuẩn alen như
sau:


Trong số 64 mẫu chúng tôi đã khảo sát, có 61 mẫu đã xác
định được alen, trong đó:
- Số cá thể đồng hợp tử : 16 (chiếm 26,2%)

- Số các thể dị hợp tử : 45 (73,8%)

- Số alen xác định được : 7 alen (ký hiệu từ alen số 7 đến
alen số 13).

- Alen có tần suất cao nhất là alen số 11 (32%)

- Alen có tần suất thấp nhất là alen số 7 (0,8%).

- Chưa phát hiện thấy alen số 14. Số mẫu mà chúng tôi
khảo sát bước đầu còn ít nên có thể chưa phát hiện được
alen này.

Với tần số khảo sát alen số 7 là 0,8% và chưa phát hiện
thấy alen số 14 trong số 122 alen, có thể coi alen số 7 và 14
là các alen hiếm của locus D7S820 ở người Việt Nam.

III. Kết luận

1. Đã tối ưu được điều kiện PCR đối với locus D7S820 với
điều kiện nhiệt độ gắn mồi là 58
o
C.

2. Đã xây dựng được thang alen cho locus di truyền
D7S820 với 7 alen khác nhau.

4. Đã khảo sát sơ bộ tần suất alen của locus D7S820 ở 64
mẫu ADN người Việt Nam dựa vào thang alen tạo được.
Tần suất khảo sát thu được cao nhất ở alen số 11 và thấp
nhất ở alen số 7. Alen số 14 chưa thấy xuất hiện trong số
mẫu đã khảo sát.

Kết quả khảo sát tần suất của locus D7S820 sẽ góp phần
phục vụ công tác nhận dạng cá thể người và tiến tới làm
tàng thư ADN ở người Việt nam.

5. Với kết quả trên, trong thời gian tiếp theo, chúng tôi
mong muốn:

- Nghiên cứu tạo thang alen bằng kỹ thuật PCR sử dụng
phương pháp trộn ADN khuôn.

- Tiến hành khảo sát bổ xung để xây dựng được bảng phân
bố tần suất các alen của locus D7S820 ở các mẫu ADN
người Việt Nam.

- Tiếp tục khảo sát tần suất các alen đối với các locus
ADN đa hình khác để tăng khả năng phân biệt cá thể ở
người Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Đình Lương. 2001. Nghiên cứu tính đặc trưng cá
thể và tần số phân bố các alen của ba lôcut VNTR (D1S80,
YNZ22 và ApoB) ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR. Di
truyền học & ứng dụng, số 4/2001.
2. Lê Đình Lương, Lưu Xuân Hoà, Nguyễn Xuân Hùng,
Trịnh Đức Anh. Nghiên cứu xác định dấu ADN ở người
Việt bằng các locut trên nhiễm sắc thể giới tính. Công trình
Hội nghị toàn quốc, Chương trình KHCB, Huế 7-2003.
3. Ngô Tiến Quý, Hà Quốc Khanh, Nghiêm Xuân Dũng,
Trần Minh Đôn, 2002: “Bước đầu khảo sát tần số phân bố
alen của gen TPOX”. Tạp chí Di truyền và ứng dụng 2002,
số đặc biệt chào mừng 100 năm trường Đại học Y – Hà
Nội. Trang 47-50.

4. Nguyễn Văn Lợi, Nguyễn Trọng Toàn, Nghiêm Xuân
Dũng, 2003: “Tối ưu hóa điều kiện PCR và khảo sát sơ bộ
tần suất alen locus TH01. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản
trong khoa học sự sống. Báo cáo khoa học hội nghị toàn
quốc lần thứ hai nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông
nghiệp, y học. Huế, 25-26/7/2003.; trang 952-955.
5. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. (1989),
Molecular cloning 1,2,3, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, USA.
6. Shimada I., Brinkmann B., Nguyễn Q.T, Hohoff C.
Allele frequency date for 16 STR loci in the Vietnamese
population. International Journal of legal Medicine 2002.
Short Communication (in press).
7. Westermeier R. (1997), Electrophoresis in Practice,
VCH A Wiley company, Federal Republic of Germany.
8. Technical manual (1999), Geneprint fluorescent STR
systems, Promega.

THE APPLICATION OF PCR TECHNIQUE FOR
THE PRELIMINARY CALCULATION OF ALLELE
FREQUENCY OF LOCUS D7S820 IN VIETNAMESE
POPULATION.

Nghiêm Xuân Dũng, Trần Minh Đôn,
Lương Thị Yến, Lê thị Bích Trâm.

Summary

The genetic variation among inviduals in higher at the
DNA level than at the protein level. Identity testing by

DNA analysis became a practical reality when Alec J.
Jeffreys identified the hypervariable “minisatellite” or
variable number of tandem repeat (VNTR) loci in the
human genome. “Microsatellite” or sort tandem repeats
(STR) provide another rich source of polymorphic markers
resulting from variations in the number of copies of the
repeated motif. PCR-based typing of STR loci become a
technique of growing importance in forensic analysis and
paternity testing.

D7S820 is one of many STR loci which located at
chromosome number 7 and has short repeat units of 4bp.
This locus has been investigated and used worldwide as
one of many important markers for forensic analyses and
paternity testing.

The aim of our study is to determine the allele frequency
distribution at D7S820 in Vietnamese population. Blood
samples were obtained from unrelated voluntary donors
from population in Vietnam. The DNA isolation from the
white blood cells was performed by phenol/chloroform
extraction/ ethanol precipitation method. PCR technique for
D7S820 was made at optimal annealing temperature of
58oC; then separation of PCR fragments was performed by
electrophoresis on the 6% denaturing polyacrylamide gel
and DNA bands were visualized by silver staining.

7 different alleles (from 7 to 13) was identified after the
electrophoresis. Allelic ladders of D7S820 were made by
mixing different PCR products. Base on the allelic ladders,

the allele frequency was calculated. Among 64 different
DNA samples, 61 sample had alleles identified in which:

- A highest frequency of 32% was found at allele No 11;
and a lowest frequency was 0,8% found at allele No 7.

- The frequency of allele No 14 hasn’t been observed.

- The percent of heterozygotes and homozygotes are
73,8% and 26,2% respectively.

- In comparison with another distribution of allele
frequency on a group of South-East Asian, this result was
quite equivalent.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Đức
Thành.