BÁO CÁO KHOA HỌC: "BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETAGALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21" ppt

BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETA-
GALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA
COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21

Trần Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Lịch, Trương Nam
Hải.
Viện công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.
Ngô Tiến Hiển
Viện Công nghiệp thực phẩm.

ĐẶT VẤN ĐỀ

-Galactosidaza (-D-galactosidase galactohydrolase,
EC3.2.1.32) xúc tác quá trình thuỷ phân galactosyl ở vị trí
tận cùng của hydratcacbon, glycoprotein và galactolipit [1].
-Galactosidaza thuỷ phân cơ chất từ đầu không khử, tại vị
trí -D-galactosyl tận cùng của -D-galactosizit [2, 3] để
chuyển hóa lactoza thành galactoza và glucoza [3, 4]. -
Galactosidaza có mặt phổ biến trong giới động vật, thực
vật, nấm và vi sinh vật. Ở vi khuẩn, cấu trúc và khối lượng
phân tử của -galactosidaza rất khác nhau. Enzym này có
thể tồn tại dưới dạng một tiểu phần như -galactosidaza của
Thermus sp.A4 (khối lượng phân tử 75 kDa), và dạng nhiều
tiểu phần như -galactosidaza của T. aquaticus (khối lượng
phân tử lớn hơn 700 kDa). -galactosidaza của E. coli tồn
tại dưới dạng một protein gồm 4 tiểu phần giống nhau,
chức năng hoạt động của mỗi tiểu phần độc lập với nhau và
có khối lượng phân tử là 116,353 kDa [2].

-Galactosidaza được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp. Trong công nghiệp thực phẩm, -

galactosidaza được bổ sung vào quá trình lên men từ bơ sữa
như kem, sữa chua để tránh sự kết tinh lactoza. Trong quy
trình sản xuất sữa, -galactosidaza được bổ sung để thuỷ
phân lactoza, làm tăng độ ngọt của sữa [1, 4]. Trong ngành
y học, -galactosidaza được điều chế làm thuốc trợ tiêu hoá
[4]. Trong kỹ thuật ADN tái tổ hợp, -galactosidaza đóng
vai trò dấu chuẩn trong quá trình tách và chọn dòng phân tử
nhờ hiện tượng bất hoạt enzym trên các vectơ có chèn gen
tái tổ hợp.

Trong bài báo này, chúng tôi sẽ trình bày các phương pháp
đã tiến hành để tạo chủng vi khuẩn tái tổ hợp có khả năng
tổng hợp -galactosidaza cao. Gen lacZ từ chủng E. coli
ATCC 11105 được nhân lên bằng kỹ thuật PCR và đưa vào
vectơ biểu hiện pET-22b(+) để tạo vectơ pET-22bLacZ.
Sau đó vectơ này được biến nạp vào chủng biểu hiện E.
coli BL21 để tổng hợp -galactosidaza.

I. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

I.1. Nguyên liệu

- Plasmit pET-22b(+) (5493bp) do hãng Novagen cung cấp
được sử dụng làm vectơ biểu hiện gen LacZ. Cặp mồi dùng
nhân gen LacZ do hãng GENSET Singapore Biotech.Pte
Ltd tổng hợp. Enzym hạn chế sử dụng của hãng Bio-Lab.
Hoá chất sử dụng trong nghiên cứu của hãng Sigma (Mỹ),
Prolabo (Pháp), BDH (Đức), Meck (Đức), Fluka (Đức).

- Các thiết bị máy móc cần thiết cho nghiên cứu chuyển

gen của các hãng Perkin Elmer (Mỹ), Eppendorf (Đức),
Binder (Đức), Infors (Thuỵ Sỹ), Toledo (Thuỵ Sỹ),
Phamacia (Thuỵ Điển), Bio Rad (Mỹ), Sovall (Mỹ), MJ –
Research (Mỹ).

I.2. Chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E. coli ATCC11105 là chủng cung cấp
nguồn gen LacZ mã hoá cho -galactosidaza.

- Chủng vi khuẩn E. coli BL 21[E omp hsd SB(rBmB)gal
dcm (DE3) plysS(Caml)] được sử dụng làm vật chủ cho
biểu hiện dòng gen.

I.3. Nhân gen LacZ mã hoá

-galactosidaza bằng kỹ
thuật PCR

Dựa vào trình tự gen LacZ của E. coli trong ngân hàng gen
quốc tế (gi:7428187), cặp mồi LacZF1-Nco I và LacZR2-
Xho I được thiết để dùng cho PCR (hãng GENSET
Singapore Biotech.Pte Ltd tổng hợp). PCR được tiến hành
như sau: Biến tính ADN ở 94
0
C trong 3 phút; nhân ADN
bằng 25 chu trình nhiệt với các bước sau: 94
0
C trong 1
phút, 55

0
C 1 phút, 72
0
C trong 1 phút 30 giây. Phản ứng
nhân ADN kết thúc ở 72
0
C trong 8 phút. ADN được giữ ở
4
0
C sau khi kết thúc PCR.

I.4. Đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+)

Để đưa gen LacZ vào vectơ pET-22b(+) tại vị trí Nco I và
Xho I trong vùng đa nối, sản phẩm PCR và vectơ pET-
22b(+) được xử lý bằng hai enzym hạn chế Nco I và Xho I.
Đoạn gen LacZ và plasmit sau khi xử lý có kích thước
tương ứng ~ 3 kb và ~ 5,4 kb, được nối lại với nhau bằng
ADN ligaza. Sản phẩm phản ứng nối ghép được biến nạp
vào tế bào E. coli BL 21.

I.5. Điều kiện môi trường cảm ứng

Cấy chuyển từ khuẩn lạc đơn, dòng tế bào E. coli BL 21
mang vectơ biểu hiện pET-22bLacZ sang 5 ml môi trường
lỏng LB + Amp, nuôi lắc 37
0
C qua đêm đến pha ổn định.
Từ dịch nuôi cấy qua đêm cấy chuyển 1ml sang bình 500
ml chứa 100 ml LB lỏng + Amp, nuôi lắc 37

0
C, sau 2 giờ
(OD
600nm
= 0.6), môi trường được bổ sung chất cảm ứng
IPTG (nồng độ cuối cùng 1mM) và tiếp tục nuôi lắc 200
v/phút ở nhiệt độ 20
0
C. Tế bào được thu sau 12 giờ cảm
ứng.

I.6. Tinh sạch

-galactosidaza

Chuẩn bị cột 1.5x15 cm. Chuyển 4 ml dịch Talon Resin lên
cột. Cân bằng cột bằng đệm: 50 mM sodium phosphat; 300
mM NaCl, pH 7,4. Tinh chế mẫu qua cột ái lực: ly tâm thu
tế bào sau cảm ứng ở điều kiện 5000 v/phút trong 10 phút ở
4
0
C. Hoà tế bào E. coli trong 10 ml đệm Tris 10 mM pH 8;
0,2 phenylmethylsulphonyl fluoride. Tế bào được phá bằng
lyzozyme khi ủ ở 30
0
C, 60 phút. Dịch sau khi phá được li
tâm ở 13.000 v/phút trong 10 phút. Enzym từ dịch nổi được
tinh chế nhờ cột ái lực chứa các hạt sepharose gắn Co
2+
.

Sau khi qua cột các protein không có đuôi Histidin sẽ bị rửa
trôi bằng đệm photphat pH 7,4 còn -galactosidaza tái tổ
hợp có gắn thêm 6 axit amin Histidin được giữ lại trên cột
và được tách ra khỏi cột bằng đệm chiết: 50 mM sodium
acetat, 300 mM NaCl, pH 5,0 [5]. Quá trình tinh sạch
protein được tiến hành ở 4
0
C.

I.7. Định lượng protein

Protein được định lượng bằng phương pháp Bradfrod.
Đường chuẩn được xây dựng từ các nồng độ BSA khác
nhau ( 2,5g, 5g, 7,5g, 10g, 12,5g, 15g, 17,5g,
20g). Dựa vào đường chuẩn BSA ta có thể định lượng
được hàm lượng -galactosidaza [6].

I.8. Nghiên cứu hoạt tính riêng của

-galactosidaza

Hoạt tính -galactosidaza được xác định bằng cách cho
enzym phản ứng với cơ chất tổng hợp o-nitrophenyl--D-
galactose (ONPG). Dưới tác dụng của enzym ONPG sẽ
thủy phân thành galactoza và o-nitrophenol. o-Nitrophenil
khi giải phóng sẽ chuyển hỗn hợp phản ứng sang màu vàng
và hấp thụ ở bước sóng 420nm. Từ đây, ta có thể xác định
được hoạt độ enzym khi đo hỗn hợp phản ứng giữa -
galactosidaza và ONPG. Một đơn vị hoạt tính (U) -
galactosidaza là lượng enzym cần thiết để giải phóng

1mol o-nitrophenil trong 1 phút ở 30
0
C theo điều kiện thí
nghiệm.

I.9. Động học enzym

Phân tích động học của -galactosidaza được thực hiện với
các nồng độ cơ chất khác nhau: 0,02 mg, 0,04 mg, 0,06mg,
0,08 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3mg, 0,4mg, 0,5 mg với lượng
enzym cho phản ứng là 300 ng. Tổng thể tích cho mỗi phản
ứng là 1ml hỗn hợp, phản ứng diễn ra ở 300C trong 5 phút.
Dừng phản ứng bằng 0,5 ml Na
2
CO
3
và OD được đo ở
bước sóng 420 nm. Kết quả được xử lý bằng chương trình
toán học trên máy tính. Từ đó, các thông số động học của
enzym K
m
và k
cat
được xác định [7].

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Nhân gen LacZ bằng PCR

Trong kỹ thuật PCR, hai đoạn mồi được chọn nhằm giới

hạn hai đầu của đoạn ADN cần nhân lên. Theo dự định,
đoạn gen LacZ mã hoá cho -galactosidaza tái tổ hợp sẽ sử
dụng tín hiệu tiết pelB đã được thiết kế sẵn trong pET-
22b(+). Đoạn mồi xuôi (đầu 5’) có chiều dài 25 nucleotit
mang điểm cắt nhân tạo của enzym hạn chế Nco I. Đoạn
mồi ngược chiều (đầu 3’) có chiều dài 27 nucleotit mang
điểm cắt nhân tạo của enzym hạn chế Xho I.

- Trình tự nucleotit đoạn mồi xuôi: LacZF1-Nco I: 5’–
GCCATGGTGACCATGATTACGGATT- 3’
- Trình tự nucleotit đoạn mồi ngược: LacZR2-Xho I: 5’–
CCGCTCGAGTTTTTGACACCAGACCAA- 3’

Đoạn gen LacZ được nhân lên bằng PCR với hai cặp mồi
được thiết kế như ở trên. Dự tính đoạn gen nhân lên có
chiều dài khoảng 3000 bp. Sản phẩm PCR được kiểm tra
bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Ảnh 1)

Ảnh 1: Kiểm tra sản phẩm PCR nhân đoạn gien LacZ trên
gel agarose 0,8%.

Đường chạy số 1: thang ADN chuẩn.
Đường chạy số 2: sản phẩm PCR.

Trên gel điện di, sản phẩm PCR là một băng đặc hiệu,
tương ứng với trọng lượng phân tử khoảng 3000 bp như
theo dự tính. Như vậy trình tự cặp mồi như đã thiết kế và
điều kiện chạy PCR là phù hợp để nhân đoạn gen LacZ mã
hoá cho -galactosidaza của chủng E. coli ATCC
11105.

2. Đưa gen LacZ vào vectơ biểu hiện pET22b(+)

Vectơ pET được Studier và cộng sự thiết kế dựa trên hệ
điều khiển promotơ mạnh có nguồn gốc từ phage T7. Hiện
nay, có hơn 42 dạng vectơ pET được sử dụng cho biểu hiện
trong 15 vật chủ khác nhau. Vectơ pET-22b(+) có chiều dài
5493 bp , được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện
gen tái tổ hợp trong E. coli. pET-22b(+) mang gen lac I mã
hoá cho protein repressơ, can thiệp vào quá trình điều hoà
hoạt động của promotơ trên vectơ và được cảm ứng bằng
cơ chất tổng hợp IPTG. Gen pelB mã hoá cho peptit tín
hiệu dẫn của các protein tiết tái tổ hợp ra bên ngoài màng tế
bào [Cat. No 69744-3]. Vectơ biểu hiện pET-22bLacZ
được thiết kế theo sơ đồ 1.

Sơ đồ 1: Thiết kế vectơ biểu hiện pET-22bLacZ mang gien
mã hoá cho -galactosidaza của chủng vi khuẩn E. coli
ATCC 11105


Đoạn gen LacZ được nhân lên bằng PCR của chủng E. coli
ATCC 11105, mục đích đoạn gen này đưa vào vectơ pET-
22b(+) tại hai điểm cắt Nco I và Xho I ở trong vùng đa nối.
Để đưa đoạn LacZ vào vectơ thì sản phẩm PCR và ADN
plasmit phải được cắt triệt để bằng hai enzym hạn chế Nco
I và Xho I. Đoạn gen lacZ và plasmit sau khi cắt được nối
với nhau bằng ADN-ligaza. Sản phẩm nối ghép được biến
nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp xung điện. Sau khi
chọn lọc và kiểm tra các thể biến nạp chúng tôi đã chọn

được thể tái tổ hợp mang hệ gen mã hoá -galactosidaza
được đặt tên pET-22bLacZ.

3. Biểu hiện gen LacZ mã hoá

-galactosidaza trong
chủng tái tổ hợp E. coli BL21 trên môi trường thạch đĩa

Khi trong môi trường nuôi cấy có mặt chất cảm ứng IPTG,
lập tức phân tử IPTG liên kết ái lực với protein repressơ,
làm thay đổi cấu trúc không gian của protein này. Vùng
promotơ trên vectơ được giải phóng và được T7 ARN
polymeraza nhận biết. Lúc này hệ pET-22bLacZ trong E.
coli BL21 chuyển sang quá trình phiên mã và dịch mã. Để
định tính sự biểu hiện -galactosidaza trong E. coli BL21,
chọn hai dòng tế bào cấy vạch lên môi trường thạch LB +
Amp + IPTG + X-gal: một dòng tế bào E. coli BL21 mang
hệ pET-22bLacZ và một dòng tế bào đối chứng E. coli
BL21 mang pET-22b(+) không mang gen LacZ. Đĩa sau
khi cấy được ủ ở 30
0
C qua đêm (ảnh 2).

Ảnh 2: kiểm tra hệ biểu hiện pET-22bLacZ trong E. coli
BL21 trên môi trường thạch đĩa LB chứa IPTG và X-Gal.

* Số 1: vạch khuẩn lạc mầu xanh đậm là dòng tế bào E. coli
BL21 chứa vectơ biểu hiện pET-22bLacZ.
* Số 2: vạch khuẩn lạc mầu trắng đục là dòng tế bào E. coli
BL21 chứa vector pET-22b(+).

Kết quả là trên đĩa có một vạch khuẩn lạc mầu xanh và một
vạch khuẩn lạc mầu trắng. Vạch khuẩn lạc mầu xanh đậm
(do -galactosidaza thuỷ phân X-gal tạo màu xanh) là
những tế bào chứa vectơ pET-22bLacZ đã được biểu hiện.
Vậy -galactosidaza tái tổ hợp đã được biểu hiện trên môi
trường thạch đĩa LB + Amp + IPTG + X-gal.

4. Tinh sạch

-galactosidaza bằng cột sắc kí ái lực

* Kiểm tra lượng

-galactosidaza ở dạng tan

-galactosidaza tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli được tổng
hợp lượng khá lớn khi có mặt chất cảm ứng mạnh IPTG.
Quá trình tổng hợp -galactosidaza tái tổ hợp quá mạnh
nên dễ dẫn tới hiện tượng lỗi trong quá trình hình thành cấu
trúc hoạt động của enzym. Các protein bị lỗi thường tồn tại
ở dạng không tan, thể vùi và không có hoạt tính. Khi cảm
ứng cho biểu hiện ở 37
0
C -galactosidaza hầu như tồn tại
dưới dạng không tan. Để khắc phục hiện tượng này, cần
phải thay đổi một số điều kiện khi cảm ứng sao cho tế bào
tổng hợp -galactosidaza chậm hơn. Khi nuôi cảm ứng ở
nhiệt độ thấp hơn: 30
0

C, 25
0
C, 20
0
C thì enzym được tổng
hợp dưới dạng tan nhiều hơn, như ở 20
0
C có khoảng 30-
40% sau tổng hợp ở dưới dạng tan.
* Tinh sạch

-galactosidaza

Trong vectơ biểu hiện pET-22b(+) đã được thiết kế sẵn một
đoạn Histidin về phía đầu 3’ đoạn gen cấu trúc khi chèn
vào vùng đa nối trên vectơ. Nhờ vậy khi tổng hợp, enzym
được gắn thêm đuôi Histidin và chính đuôi Histidin này có
ái lực đặc hiệu với cột ái lực Resin giúp tinh sạch enzym -
galactosidaza tái tổ hợp dễ dàng. Sản phẩm -galactosidaza
sau khi tinh sạch được kiểm tra trên gel SDS -
popyacrylamit 12 % (ảnh 4).

Ảnh 4: Kiểm tra sản phẩm sau tinh sạch trên gel điện di
SDS - polyacrylamid 12%.
Đ/ C 1: Protein của dịch chiết thô trước khi cho lên cột.

Đ/ C 2: Protein không đặc hiệu khi cho qua cột ái lực.
Đ/C 3: mẫu protein lên cột sau khi rửa 10 lần thể tích cột
bằng đệm photphat.
Đ/C 4: -galactosidaza được tách ra khỏi cột.

Đ/C 5: Thang protein chuẩn.

Ảnh trên cho thấy, -galactosidaza được thu lại dưới dạng
tinh sạch, trọng lượng khoảng 116 kDa.

4. Xác định hoạt tính

-galactosidaza bằng cơ chất
ONPG
Hàm lượng -galactosidaza được tính theo phương pháp
Bradford là 0,05 mg/ml. Hoạt tính riêng -galactosidaza
được xác định khi cho phản ứng thuỷ phân cơ chất tổng
hợp ONPG (o-nitrophenyl -D- galactopyranoside). Phản
ứng enzym được tiến hành với các nồng độ cơ chất ONPG
khác nhau, phản ứng được ủ ở 30
0
C trong 5 phút. Khi hỗn
hợp phản ứng chuyển sang mầu vàng thì dừng phản ứng
bằng 0,5 ml Na
2
CO
3
1M. Hoạt tính enzym được xác định
bằng cách đo độ hấp phụ của hỗn hợp sau phản ứng ở OD
420 nm
. Từ đó các thông số K
m
, k
cat
được xác định như trong

bảng dưới đây.


Như trong bảng đơn vị hoạt tính của enzym 157,6 U/mg.
Với giá trị K
m
= 0,664 mM ái lực giữa -galactosidaza và
cơ chất tổng hợp ONPG tương đối mạnh trong điều kiện
phản ứng thừa cơ chất. Giá trị k
cat
= 86467 là hiệu lực của
enzym, số vòng quay của một phân tử enzym với các phân
tử cơ chất. Ta thấy tốc độ phản ứng xảy khá nhanh trong
một giây một phân tử enzym có khả năng thuỷ phân 86467
phân tử cơ chất.

III. KẾT LUẬN

- Chúng tôi đã tạo thành công được chủng biểu hiện vi
khuẩn E. coli BL21tái tổ hợp mang hệ biểu hiện pET-
22bLacZ chứa gen LacZ mã hóa cho -galactosidaza của
chủng E. coli ATCC 11105 có khả năng tổng hợp cao -
galactosidaza.

- Đã xác định được đơn vị hoạt tính và các giá trị động học
K
m
, k
cat
của -galactosidaza tái tổ hợp.

Lời cảm ơn

Công trình được thực hiện theo hợp đồng của đề tài KC –
04 – 07 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế
biến một số nông sản thực phẩm”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Obon J. M., Castellar M. R., Iborra J. L., Manjon A.,
2000, “-Galactosidase immobilization for milk lactose
hydrolysis: a simple experimental and modeling study of
batch and continuous reactors”, Biochemical Education, 28,
164-68.
2. Leahy M., Vaughan P., Fanning L., Fanning S.,
Sheehan D., 2001, “Purification and some characteristics of
a recombinant dimeric Rhizobium meliloti -galactosidase
expressed in Escherichia coli”, Enzyme and Microbial
technology, 28, 682-688.
3. Smith D. L, Gross K. C., 2000, “A Faminly of at Least
Seven -galactosidase Genes is Expressed during Tomato
Fruit Development”, Plant Physiology, 123, 1173-1183.
4. Kim C., Chung H., Lee M., Choi L., Kim M., 1999,
“Development of dried liposomes containing -
galactosidase for the digestion of lactose in milk”,
International Journal of Pharmaceutics, 183, 185-193.
5. “Talon Metal Affinity Resins User Manual PT1320
(PR16704)”, 2001, Clontech, 1-39.
6. Daniel M. Bollag., Michael D. Rozcki.,Stuartj. E.
delstein., 1996 Protein method, p. 63-67.

7. Christopher K. Mathews., K.E. Van Holde. , 1993,
Biochemistry,p. 360-406.


SUMMARY

Overexpression of LacZ encoding -galactosidase from
E. coli ATCC11105 in E. coli BL21

Tran Minh Tri, Nguyen Thi Thanh Lich, Truong Nam
Hai
Institute of biotechlonogy, Hanoi
Ngo Tien Hien
Food industry Research Institute, Vietnam

-Galactosidase (-D-galactoside-galactohydrolase, EC
3.2.1.23) is an enzyme responsible for hydrolysis of lactose
into glucose and galactose. Deficiency in galactosidase
activity causes GM1-gangliosidosis, and Morquio disease,
type B in human. It also has some important applications in
the fields of medicine for people of lactose intolerance , of
food to prevent lactose crystallization and increase
sweetening. In molecular biology, it is of great interest as
its use as reporter genes in various systems. Many -
galactosidases have been cloned and/or isolated from a
range of microbial sources. -Galactosidases are widely
distributed in nature, with high degree of diversity from
very small monomeric proteins to large oligomeric -
galactosidases showing important differences in substrate
specificity and catalytic properties. Many -galactosidases

have been cloned and/or isolated from a range of microbial
sources. One well-characterised -galactosidase is from E.
coli, which is a tetramer of identical 116 kDa subunits for
which the three-dimensional structure available. In this
research, we have been successful in cloning and over-
expressing of the gene encoding -galactosidase from E.
coli ATCC11105 in E. coli BL21. The whole coding
sequence for mature -galactosidase protein was PCR
amplified by a pair of primers containing restriction sites of
Nco I and Xho I in forward and reverse primer,
respectively. PCR product was cut by Xho I and Nco I and
ligated into Xho I - Nco I pre-cut pET22b(+) vector by
DNA T4 – ligase. Obtained recombinant vector was
transformed into E. coli BL21 for selection of -
galactosidase overexpressing under induction with 1mM
IPTG. First, desired clone was selected by blue colony
indication on agar medium containing IPTG and X-gal. It is
later confirmed by a big, clear protein band of around 116
kDa on SDS- PAGE of supernatant of SDS -treated cells.
Next, the enzyme was purified by affinity chromatography
(Talon Metal Affinity Resins). Finally, the concentration of
the enzyme were determined by standard Bradford of 0,05
mg/ml. The specific activity of the enzyme was determined
using ONPG as subtrate of 157.6 U/mg. This enzyme
kinetic has K
m
values for ONPG of approximately 0.664
mM and Kcat approximately 86467 s-1.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.