BÁO CÁO KHOA HỌC: "TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS MONODON)" ppsx

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA
PROTEIN VỎ VP19 CỦA VI RÚT WSSV GÂY HỘI
CHỨNG ĐỐM TRẮNG TRÊN TÔM SÚ (PENAEUS
MONODON)

Nguyễn Quỳnh Anh (1), Nguyễn Đức Hoàng (2), Trần
Linh Thước (1,2)
(1) Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học,Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM
(2) Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử,Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, ĐH Quốc gia Tp.HCM

MỞ ĐẦU

Ngành công nghiệp thủy hải sản nói chung, ngành công
nghiệp nuôi tôm nói riêng phát triển mạnh mẽ trên khắp thế
giới đã mang lại nguồn thu nhập đáng kể cho nhiều quốc
gia trong đó có Việt Nam. Tuy nhiên, sự gia tăng trong hoạt
động nuôi trồng lại dẫn tới sự bùng nổ các bệnh gây ra bởi
vi khuẩn và vi rút. Dù xuất hiện muộn nhưng hội chứng
đốm trắng đã nhanh chóng lan rộng khắp nơi với những
thiệt hại ước tính khoảng 1 tỉ USD mỗi năm trên phạm vi
toàn thế giới. Trước tình hình đó, việc phát hiện bệnh sớm
để có các biện pháp xử lý thích hợp đã trở nên ngày càng
cấp thiết [1].

Các phương pháp được dùng để phát hiện bệnh là mô học,
phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction), phương
pháp lai và phương pháp miễn dịch [1]. Với thế mạnh là có
thể dùng để phát hiện bệnh ngoài phòng thí nghiệm,
phương pháp miễn dịch có thể được các hộ nuôi trồng sử

dụng trực tiếp tại nơi sản xuất để phát hiện bệnh nhanh ở
tôm nuôi mà không cần phải gửi mẫu tới các phòng thí
nghiệm. Do đó, có thể nhanh chóng có những biện pháp đối
phó thích hợp, giảm thiểu được các tổn thất.

Trong phương pháp miễn dịch phát hiện bệnh, kháng thể
được sử dụng để phát hiện nhanh kháng nguyên có nguồn
gốc từ bệnh (như bản thân vi rút, một loại protein vỏ nào đó
của vi rút). Nhiệm vụ của các nhà khoa học là phải tìm
được đúng loại kháng thể thích hợp. Hiện nay, có một điều
bất lợi là chưa nuôi được tế bào tôm để nhân vi rút dùng
làm kháng nguyên để tạo kháng thể, do đó phương pháp
khả thi hơn là ứng dụng các kỹ thuật di truyền để thu nhận
protein vỏ của vi rút làm kháng nguyên để tạo kháng thể.

Các nghiên cứu trước đây cho biết vi rút WSSV gây hội
chứng đốm trắng không chỉ ở tôm mà còn trên nhiều loài
giáp xác khác. Vi rút này có kích thước khá lớn với ADN
bộ gen vòng, mạch đôi kích thước khoảng gần 300kb [2, 3].
Virion WSSV có 5 protein cấu trúc chính, được gọi tên
theo trọng lượng phân tử khi điện di SDS-PAGE, trong đó
có 2 loại protein hiện diện tại vỏ của vi rút là VP19
(19kDa) và VP28 (28kDa) [4, 5, 6, 7].

Trong phạm vi bài báo này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và
biểu hiện gen mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút
WSSV (White Spot Syndrome Virus) trong Escherichia
coli để phục vụ mục tiêu tạo kháng thể sử dụng trong
phương pháp miễn dịch phát hiện nhanh WSSV.

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Chủng giống vi sinh vật. Escherichia coli DH5 [F-
endA1 hsdR17 (rk-/mk-) supE44 thi l- recA1 gyrA96 D
lacU169 (f80 lacZ DM15)] được sử dụng để tạo dòng các
plasmid mang đoạn gen VP19; Escherichia coli HB101
[sup E44 hsdS20 (rB-/mB-) recA13 ara14 proA2 lacY1
gaIK2 rpsL20 xyl5 mH1] được dùng làm tế bào chủ để biểu
hiện gen mã hóa protein VP19 bằng vector biểu hiện pEZZ
18 (Genbank M74186) [8]. E. coli được nuôi cấy trong môi
trường Luria-Bertani (LB) [1% tryptone, 0,5% yeast extract
và 1% NaCl] có bổ sung 100g/ml ampicillin (khi cần) để
làm nhân tố chọn lọc.

Nguồn ADN. Mẫu tôm bệnh có nguồn gốc từ Sóc Trăng.
Tách chiết ADN từ mẫu tôm và kiểm bằng PCR nhờ bộ kit
phát hiện vi rút gây bệnh đốm trắng của Phòng thí nghiệm
Công nghệ sinh học phân tử, Trường ĐH Khoa học tự
nhiên, Đại học quốc gia TP. HCM. Mẫu ADN dương tính
được sử dụng làm ADN khuôn để nhân bản và thu nhận
đoạn gen VP19 bằng phản ứng PCR.

Thiết kế plasmid. Với mục đích biểu hiện protein vỏ VP19
của vi rút WSSV dưới dạng protein dung hợp Protein A-
VP19, plasmid pZ-VP19 được thiết kế như sau. Đoạn gen
VP19 được khuếch đại và thu nhận bằng phản ứng PCR sử
dụng ADN bản mẫu được tách chiết từ mẫu tôm bệnh và
cặp mồi VP19-2f, 5’ -ACAGGGATCCAATGGCCACC-
ACG-3 để tạo vị trí cắt BamHI và VP19-2r, 5’ -
TTCTAAGCTTTTACT-GCCTCCTCTTGG-3 để tạo vị trí

cắt HindIII. Thành phần phản ứng PCR gồm nước cất, đệm
10X, dNTP 10X (2mM mỗi loại), ADN bản mẫu (50ng/l),
mồi xuôi và mồi ngược (10pmole/l), Pfu ADN
polymerase (3U/l). Tinh chế sản phẩm PCR thu được và
cắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn gen VP19
BamHI/HindIII được nối vào plasmid pEZZ 18 tại BamHI
và HindIII nhờ T4 ADN ligase. Thành phần phản ứng nối
gồm plasmid pEZZ 18, đoạn gen VP19, PEG 6000 30%,
đệm 10X và enzym nối T4 ADN ligase. Sản phẩm nối sau
đó được biến nạp vào E. coli DH5.

Các phương pháp tuyển chọn và kiểm tra dòng mang gen
mục tiêu. Sản phẩm nối sau khi được biến nạp vào E. coli
DH5 sẽ được chọn lọc sơ bộ dựa trên kiểu hình kháng
ampicillin và màu sắc xanh trắng của khuẩn lạc. Các khuẩn
lạc dự tuyển được kiểm chứng bằng phương pháp PCR
khuẩn lạc sử dụng cặp mồi của gen VP19-2f/VP19-2r.
Phương pháp bản đồ cắt hạn chế cũng được sử dụng để
kiểm tra plasmid thu được [9]. Sau khi được tạo dòng, gen
VP19 được giải trình tự trên máy giải trình tự ALF express
II, Amersham Biosciences và phân tích, so sánh kết quả
bằng chương trình Jellyfish (Biowife).
Điện di phân tích protein bằng phương pháp SDS - PAGE.
Plasmid pZ-VP19 được tách chiết từ E. coli DH5 bằng
phương pháp SDS - kiềm, đo nồng độ và độ tinh sạch bằng
quang phổ kế. Biến nạp pZ-VP19 vào E. coli HB101, nuôi
cấy trong môi trường LB lỏng chứa 100g/ml ampicillin
đến khi đạt tới pha ổn định. Protein dung hợp được tổng
hợp và tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu tiết có
trên pZ-VP19 [8]. Tủa protein bằng muối amonium sulfat

bão hòa và điện di phân tích protein trên gel polyacrylamid
với sự hiện diện của Sodium Dodecyl Sulfate[9] cùng với
thang chuẩn protein và mẫu đối chứng là protein thu từ môi
trường nuôi cấy E. coli HB101 chứa plasmid pEZZ 18
không có đoạn chèn để xác định sự hiện diện của protein
dung hợp Protein A-VP19 trong môi trường nuôi cấy.

KẾT QUẢ

Thu nhận gen mã hóa protein vỏ VP19. Khảo sát 30 mẫu
ADN bị nghi nhiễm bệnh WSSV, kết quả cho thấy có 25
mẫu bị nhiễm WSSV khi được kiểm tra bằng PCR với cặp
mồi theo bộ kít của Phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học
phân tử, Trường ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia
TP. HCM. Khi thực hiện phản ứng PCR dựa vào khuôn
ADN trên với cặp mồi VP19-2f/VP19-2r, kết quả cho thấy
chỉ có những mẫu tôm bị nhiễm WSSV thì mới cho sản
phẩm khuếch đại của gen VP19.

Chọn một mẫu ADN có kết quả dương tính ở trên làm
khuôn để thu nhận đoạn gen VP19 bằng Pfu ADN
polymerase. Sản phẩm PCR có kích thước 387bp (Hình 1,
giếng 1) được cắt bằng BamHI và HindIII. Đoạn ADN này
sau đó được tinh chế qua gel agarose để dùng cho phản ứng
nối nhằm tạo plasmid pZ-VP19.

Tạo dòng gen VP19 vào vector biểu hiện pEZZ 18. Sản
phẩm nối của gen VP19 và plasmid pEZZ 18 được biến nạp
vào E. coli DH5 nhằm nhân bản với số lượng lớn bản sao
đồng thời có thể tuyển chọn sơ bộ thể biến nạp dựa trên

kiểu hình kháng ampicillin và màu sắc xanh trắng của
khuẩn lạc. Những khuẩn lạc xanh là thể biến nạp mang
plasmid pEZZ 18 không có gen chèn; những khuẩn lạc
trắng là những thể biến nạp dự kiến có mang gen VP19
(Hình 3). Để kiểm tra thể biến nạp mang gen VP19 đã qua
sơ tuyển, phương pháp PCR khuẩn lạc được sử dụng với
cặp mồi VP19-2f/VP19-2r. Chỉ những mẫu có mang gen
VP19 mới cho ra sản phẩm PCR kích thước 387bp trên
bảng điện di (Hình 2, giếng 2). Những mẫu dương tính sau
kiểm tra bằng PCR khuẩn lạc sẽ được tách chiết plasmid.
Plasmid sau đó được cắt bởi hai enzym HindIII, BamHI và
điện di trên gel agarose (Hình 4, giếng 3), so sánh với
pEZZ 18 cũng được xử lý bởi hai enzym trên và gen VP19
sản phẩm PCR. Khi đó, plasmid có mang gen chèn sẽ bị cắt
tạo thành hai đoạn ADN, một có kích thước tương đương
gen VP19 - sản phẩm PCR, đoạn còn lại có kích thước
tương ứng với pEZZ 18 (Hình 4, giếng 3). Sơ đồ plasmid
pZ-VP19 được khái quát như trong Hình 5.

Hình 1. Thu nhận gen VP19.

1, Sản phẩm PCR gen VP19
2, Thang DNA 100bp

Hình 2. PCR khuẩn lạc kiểm tra thể biến nạp.

1, Thang DNA 100bp; 2, Sản phẩm PCR khuẩn lạc - mẫu
mang gen VP19; 3, Sản phẩm PCR khuẩn lạc - kết quả âm
tính, mẫu không mang gen VP19

Hình 3. Kết quả biến nạp pZ-VP19 vào E. coli.


Hình 4. Kiểm tra plasmid pZ-VP19.

1, pEZZ 18 được cắt bởi HindIII và BamHI
2, Sản phẩm PCR đoạn gen VP19
3, pZ-VP19 đư ợc cắt bởi HindIII và BamHI

Giải trình tự gen mã hóa protein VP19. Đoạn gen VP19
trong plasmid pZ-VP19 được giải trình tự, kiểm tra sự đồng
khuôn với gen mã hoá protein A có sẵn trong plasmid
pEZZ18. Trình tự gen VP19 ở WSSV trên mẫu tôm bệnh
tại Việt Nam do chúng tôi tạo dòng và giải trình tự được
công bố trên ngân hàng gen với mã số AY160771. So sánh
trình tự VP19 này với các trình tự sẵn có trên ngân hàng
gen.(Hình 6) cho thấy trình tự gen VP19 ở WSSV tại Việt
Nam có sự sai khác một axit nucleic tại vị trí 212 so với
trình tự AY220744 và một tại vị trí 218 so với trình tự
AF369029.

Biểu hiện gen mã hóa protein VP19 trong E. coli HB101.
Biến nạp plasmid pZ-VP19 được chiết tách từ E. coli
DH5 vào E. coli HB101. Sự biểu hiện của gen VP19 trong
plasmid này được kiểm soát bởi promoter lacUV5 và
promoter của protein A mà không cần phải cảm ứng.
Protein được biểu hiện (ở dạng protein dung hợp Protein A-
VP19) được tiết ra ngoài môi trường nhờ trình tự tín hiệu
tiết có trên plasmid. Trọng lượng phân tử của protein dung
hợp khoảng 33kDa (trong đó protein A khoảng 14kDa và

protein vỏ VP19 là 19kDa). Khi phân tích bằng phương
pháp SDS-PAGE (Hình 7, giếng 2, 3), protein này thể hiện
bằng vạch 30kDa.

Hình 5. Sơ đồ plasmid pZ-VP19.


Hình 6. So sánh trình tự gen VP19 từ tôm bị bệnh WSSV
tại Việt Nam (AY160771) với các trình tự gen từ ngân
hàng gen (AF369029 và AY220744).


Hình 7. Phân tích protein bằng điện di SDS-PAGE.


KẾT LUẬN

Như vậy, chúng tôi đã thành công trong việc tạo dòng gen
mã hóa cho protein vỏ VP19 của vi rút WSSV gây hội
chứng đốm trắng ở tôm sú tại Việt Nam. Việc giải trình tự
gen này cho thấy gen vp19 này gồm 366bp mã hóa cho 122
axit amin. Gen vp19 trên WSSV gây bệnh trên tôm sú tại
Việt Nam có độ đồng nhất rất cao ở mức ADN và mức
protein với các gen vp19 khác đã công bố. Gen vp19 được
tái tạo dòng vào vector biểu hiện pEZZ 18 để biểu hiện
VP19 trong tế bào chủ E. coli HB101 dưới dạng protein
dung hợp Protein A-VP19 được tiết ra môi trường nuôi cấy.
Protein này đang được tinh chế để dùng làm nguyên liệu
tạo kháng nguyên phục vụ việc phát triển kháng thể kháng
VP19 và phát triển phương pháp phát hiện nhanh WSSV

trên tôm sú, góp phần trong việc giám sát, phòng ngừa dịch
bệnh do WSSV tại Việt Nam.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Richard Hodgson, Peter Warker (2001) Molecular
diagnostics training workshop for detection of WSSV
(white spot syndrome virus) in Vietnam, University of
Fisheries Nha Trang city Vietnam.
2. Van Hulten M. C., Witteveldt J., Peters S.,
Kloosterboer N., Tarchini R., Fiers M., Sandbrink H., Klein
Lankhorst R. and Vlak J.M. (2001), Virology 286: 7 - 22.
3. Yang F., He J., Lin X., Li Q., Pan D., Zhang X. and
Xu X. (2001), Journal of General Virology 75: 11811 -
11820.
4. Van Hulten M. C., Reijns M., Vermeesch A. M. G.,
Zandbergen F. and Vlak J. M. (2002), Journal of General
Virology 81: 257 - 265.
5. Van Hulten M. C., Westenberg M., Goodall S. D. and
Vlak J. M. (2000), Virology 266: 227 - 236.
6. Van Hulten M. C., Goldbach R. W and Vlak J.M.
(2000), Journal of General Virology 81: 2525 - 2529.
7. Zhang X., Huang C., Xu X. and Hew C. L. (2002),
Journal of General Virology 83: 1069 - 1074.
8. Lowenadler B., Jansson B., Paleus S., Holmgren E.,
Nilsson B., Moks T., Palm G., Josephson S., Philipson L.,
Uhlen M. (1987), Gene 58(1): 87 – 97.
9. Shambrook J. and Russell W. D. (2001) Molecular
cloning: a laboratory manual, Third edition, CSHL press,
Cold Spring Habor, NewYork.

SUMMARY

Cloning and expressing the vp19 envelope protein of
wssv virus causing the white spot syndrome disease on
black tiger shrimp (PENAEUS MONODON)

Nguyen Quynh Anh
(1)
, Nguyen Duc Hoang
(2)
, Tran
Linh Thuoc
(1,2)

(1) Center for Bioscience and Biotechnology, University of
Natural Sciences,
Vietnam National University - Ho Chi Minh City
(2) Laboratory of Molecular Biotechnology, University of
Natural Sciences,
Vietnam National University - Ho Chi Minh City

Thirty samples of black tiger shrimp with white spot
syndrome had been collected from Soc Trang province in
Vietnam and were tested for the presence of WSSV virus
(White Spot Syndrome Virus), which had been proved to
be the main viral pathogen of the disease in North and
Southeast Asia using a PCR protocol and chemicals
developed by the Laboratory of Molecular Biotechnology,
University of Natural Sciences, VNU-HCM Vietnam.

Positive sample was used to prepare the total DNA extract,
which was used as DNA frame for the preparative
amplification of vp19 gene with a primer pair containing
restriction sites of BamHI and HindIII. The gene was
subcloned into pEZZ 18 expression vector 18 at BamHI
and HindIII sites. The cloned vp19 gene was sequenced and
registered in GeneBank as AY160771. On alignment and
comparison with two reported sequences of vp19, the
cloned sequence of vp19 showed a very high homology on
DNA as well as on protein level. The recombinant vector
was transformed and expressed in E. coli HB101 as a
fusion protein of a 14kDa fragment of A protein from
pEZZ 18 and the 19kDa VP19 protein. The expression of
the fused gene was confirmed successfully by SDS-PAGE.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương.