BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY BÔNG (GOSSYPIUM HIRSUTUM) BẰNG CÁCH TẠO ĐA CHỒI" pptx

XÂY DỰNG QUY TRÌNH TÁI SINH CÂY BÔNG
(GOSSYPIUM HIRSUTUM) BẰNG CÁCH TẠO ĐA
CHỒI

Trương Thu Thủy, Đinh Thị Phòng, Lê thị muội, Lê
Trần Bình
Viện Công nghệ Sinh học (IBT)
Lê quang Quyến
Viện Nghiên cứu Cây Bông và Cây Có Sợi (RICFC)

1. GIỚI THIỆU

Cây bông (Gossypium hirsutum. L) là nguồn cung cấp sợi
may mặc quan trọng. Song năm 2000, Việt Nam mới chỉ
sản xuất được 8 ngàn tấn, đáp ứng được 10% nhu cầu.
Theo chương trình phát triển ngành dệt may, Việt Nam đến
năm 2005 phải sản xuất 150.000 tấn sợi các loại và đến
năm 2010 chỉ tiêu đó là 300.000 tấn [7, 9]. Nguyên nhân
làm sản lượng thấp chủ yếu là bông bị sâu bệnh và hạn hán.
Vì thế một trong những chiến lược để tăng sản lượng bông
là tạo ra những giống bông có khả năng kháng sâu và chịu
hạn. Chuyển gen là một phương pháp để tạo ra những
giống bông như vậy.

Hai phương pháp chuyển gen đang được sử dụng nhiều ở
thực vật nói chung và cây bông nói riêng là súng bắn gen
và Agrobacterium, song phương pháp chuyển gen thông
qua Agrobacterium là có hiệu quả nhất.

Tuy nhiên để chuyển được gen bằng súng bắn
gen/Agrobacterium thì trước tiên cần phải thiết lập và tối

ưu cho được hệ thống nuôi cấy và tái sinh cây in vitro. Khả
năng nuôi cấy và tái sinh cây tuỳ thuộc vào các kiểu gen
của từng loại đối tượng cây trồng. Cho đến nay, việc tái
sinh đối với cây bông còn rất hạn chế và mới chỉ thành
công ở một vài giống như Coker, Deltapine 15 và Jinmian
[2, 3, 10, 11, 12 ].

Như vậy, với mục tiêu tái sinh được cây và chuyển gen có
định hướng như kháng sâu bệnh và chịu han trực tiếp vào
những giống có năng suất cao, chất lượng sợi tốt và đang
trồng phổ biến, một phương pháp tái sinh hiệu quả và
không phụ thuộc vào nguồn gốc di truyền là rất cần thiết.
Đó là phương pháp tái sinh thông qua tạo đa chồi từ phôi
mà trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng được một
quy trình áp dụng cho giống bông 254, một giống có tuổi
đời trung bình, phẩm chất tốt và thường được dùng làm bố
mẹ trong các phép lai chọn giống.
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Khử trùng hạt và chuẩn bị nguyên liệu tái sinh cây

Giống bông 254 được Viện Nghiên cứu Cây Bông và Cây
Có Sợi cung cấp. Sau khi đã bóc vỏ cứng, hạt được khử
trùng bề mặt bằng cồn 70% trong 1 phút, tiếp theo lắc trong
dung dịch javen 60% (Hoá chất Việt Trì) trong 20 phút và
rửa 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng thấm khô hạt
bằng giấy lọc khử trùng. Tách bỏ lá mầm và thu lấy phôi
bao gồm cả đỉnh rễ và đỉnh chồi (hình 1A).

2.2. Cảm ứng đa chồi và tái sinh cây

Phôi được đặt lên các môi trường cảm ứng tạo đa chồi C1-
C20 của các tổ hợp hoóc môn khác nhau. Sau 10 ngày, đỉnh
chồi của phôi được cắt với độ dài trung bình 2 mm và cấy
lên các môi trường tạo đa chồi S1-S5. Thành phần các môi
trường như trong bảng 1. Đánh giá khả năng tạo đa chồi
sau 5 tuần.

Tách chồi đơn từ các cụm chồi và cấy chuyển lên các môi
trường kéo dài chồi E0-E2. Khi chồi cao khoảng 2-4 cm thì
kích thích tạo rễ trên các môi trường R1-R2.

2.3. Môi trường và điều kiện nuôi cấy

Các tổ hợp môi trường nuôi cấy được trình bày trong bảng
1.
Bảng 1: Thành phần các môi trường tái sinh cây và tạo đa
chồi



3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Cảm ứng tạo đa chồi

Trên môi trường không có chất điều khiển sinh trưởng C0,
phôi nhanh chóng vươn dài thành cây con và phát triển lá.
Trong khi đó, trên tất cả cảc môi trường cảm ứng đa chồi
(C1-C20), 100% phôi không phát triển thành cây hoàn
chỉnh mà phình to, phát sinh mô sẹo màu trắng. Như vậy,

sự kết hợp 2,4-D, BAP và NAA đã có tác dụng làm kìm
hãm quá trình biệt hoá, tạo ra nhiều tế bào liên tục phân
chia. Trong thí nghiệm của chúng tôi thì môi trường C16
cho mức độ cảm ứng vừa phải và đồng đều nhất. Sau 10
ngày trên môi trường C16, chiều cao trung bình của phôi là
1,5 cm, dao động từ 1cm đến 4cm. Đỉnh chồi được cắt làm
nguyên liệu tạo đa chồi.

3.2. Sự hình thành cụm chồi

Các đỉnh chồi của phôi (hình 1B) được đặt lên các môi
trường kích thích tạo đa chồi S1-S5 chứa các tổ hợp khác
nhau của Kinetin, BAP và NAA. Sau 5 tuần, chồi mới chỉ
xuất hiện ở dạng 1 chồi (đơn chồi), hoặc dạng 2-3 chồi
(cụm 2-3 chồi).

Từ bảng 2, một số mẫu vật ngả màu nâu, ít khả năng sống
sót có thể do đỉnh chồi có kích thước rất nhỏ và được cấy
trên môi trường với mật độ cao, nên mẫn cảm đối với thao
tác nuôi cấy và các hợp chất phenol do chính mẫu vật tiết
ra. Tỉ lệ sống sót của mẫu vật sẽ tăng lên khi kỹ thuật nuôi
cấy được tối ưu hoá. Môi trường tạo đa chồi tốt phải cho tỉ
lệ chết thấp và tỉ lệ tạo cụm chồi cao. Môi trường S1, S2 và
S5 cho tỉ lệ chết gần tương đương nhau (20, 28 và 29%),
nhưng môi trường S2 và S5 cho tỉ lệ tạo cụm 2-3 chồi cao
hơn hẳn (46, 47% so với 33%).
Bảng 2: Sự hình thành chồi sau 5 tuần nuôi cấy

Sau giai đoạn 5 tuần, các đỉnh chồi đã hình thành 0-3 chồi,
đều được cấy chuyển lên chính môi trường tạo đa chồi ban
đầu là S2-S4 (bỏ qua môi trường S1), với mục đích tiếp tục
thu được cụm chồi. Ba tuần sau, các cụm chồi trung bình
4,5 chồi/cụm và nhiều nhất là 10 chồi/cụm đã hình thành
(bảng 3). Như vậy, sau 5 tuần trên môi trường tạo đa chồi
thì mới chỉ thu được 0-3 chồi từ mỗi mẫu vật, còn sau 8
tuần với một lần thay mới môi trường đã thu đươc các cụm
chồi có hệ số chồi cao hơn (hình 1C). Có những mẫu vật
không có chồi nào trước khi được cấy chuyển nhưng lại tạo
cụm chồi sau khi cấy chuyển. Hầu hết các môi trường S
cho tỉ lệ tạo đa chồi trên tổng số mẫu vật cấy chuyển cao,
từ 78%-93%, trong đó cao nhất là S5 (93%). Kết hợp kết
quả bảng 2 và 3, S5 được chọn là môi trường tối ưu cho
quy trình tạo đa chồi áp dụng cho biến nạp gen sau này.
Bảng 3: Sự hình thành cụm chồi sau 8 tuần nuôi cấy



Hình 1: Quá trình tạo đa chồi từ phôi:
A: Phôi B: Đỉnh chồi C: Cụm chồi hình thành sau khi cấy
chuyển



3.3. Sự phát triển chiều cao của chồi

Kết quả kéo dài chồi được thể hiện trong bảng 4. Các chồi
kích thước từ 1 cm trở lên được coi là có cảm ứng kéo dài.
Một số chồi hình thành rễ ngay trên những môi trường này.

Bảng 4: Kết quả kéo dài chồi



Như vậy là các môi trường không có hoóc môn hoặc có
nồng độ hoóc môn Kinetin và BAP thấp (như bảng 1) đã có
tác dụng kéo dài chồi. Môi trường E0 cho tỉ lệ kéo dài chồi
cao nhất là 30%, chứng tỏ rằng hàm lượng auxin và
cytokinin nội sinh tạo ra trong quá trình hình thành và phát
triển của chồi là rất lớn.

3.4. Sự hình thành rễ

Quan sát sự hình thành rễ trên môi trường MS bổ sung
NAA ở nống độ 0,2 và 0,5 mg/L cho thấy sự hình thành rễ
diễn ra khá dễ dàng đối với chồi bông trên cả hai môi
trường tạo rễ (bảng 4). Môi trường R1 với hàm lượng
0,2mg/L NAA và 1g/L than hoạt tính cho sự tạo rễ tốt nhất
là 100%.

Bảng 5: Sự hình thành rễ


3.5. Quy trình tái sinh cây bông bằng tạo đa chồi

Từ những kết quả nhận được trên đây chúng tôi xây dựng
quy trình tái sinh cây bằng phương pháp tạo đa chồi đối với
bông giống 254 như sau: Phôi được tách từ hạt và đặt trên
môi trường MS có 0,4mg/L 2,4-D, 1,5mg/L BAP và

0,1mg/L NAA trong 10 ngày. Sau đó, cắt và nuôi cấy đỉnh
chồi kích thước 2 mm trên môi trường tạo đa chồi có
1mg/L Kinetin, 2mg/L BAP và 0,1mg/L NAA trong thời
gian 8 tuần với một lần cấy chuyển, thu được các cụm chồi.
Tiếp theo, môi trường không có hoóc môn sinh trưởng
được dùng để chồi phát triển chiều cao. Cuối cùng, tạo rễ
trên môi trường có 0,2 mg/L NAA.

Trên đối tượng bông vải, phương pháp tái sinh cây từ
phôi soma còn rất hạn chế trên thế giới [5, 10], và chủ yếu
mới chỉ thành công khi nuôi cấy tế bào huyền phù với
nhiều lần thay mới môi trường[3]. Đây là khó khăn cho
việc chuyển gen thành công ở cây bông. Mặt khác những
giống đã được công bố là tái sinh được như Coker 312,
Coker 210 là những giống hầu như không được sản xuất
ở Việt Nam. Vì thế việc xây dựng một quy trình tái sinh
cây cho những giống bông Việt Nam là yêu cầu thực tiễn.
Xây dựng quy trình tái sinh cây thông qua phương pháp tạo
đa chồi đối với cây bông có thể khắc phục được những khó
khăn trên[6].

Agrawal và cộng sự năm 1997 công bố đã thành công
trong việc tạo đa chồi từ mấu lá mầm cây con 35 ngày tuổi
với hệ số 4-5 chồi/ mẫu vật [1]. Năm 1998, Hemphill và
cộng sự công bố tái sinh được cây bằng cách tạo chồi, cũng
duới tác động của BAP từ những mô phân sinh có sẵn của
cây con 28 ngày tuổi được tạo ra trong ống nghiệm bằng
cách duy trì nuôi cấy các mô phân sinh [7]. Ngoài đỉnh
chồi, các mẫu vật còn là các mấu lá mầm và mấu lá thật.
Phương pháp này lấy việc sử dụng nhiều nguồn mẫu vật có

mô phân sinh sẵn có của cây con để tăng tỉ lệ tái sinh nên tỉ
lệ biến nạp cũng đã được một phần cải thiện. Quy trình tạo
đa chồi từ phôi do chúng tôi thiết lập không những đã có hệ
số tạo chồi tương tự, mà còn bỏ qua được giai đoạn tạo cây
con 35 ngày tuổi hay quá trình nuôi cấy liên tục mô phân
sinh in vitro trong 28 ngày để tạo nguồn mẫu vật, và do đó
rút ngắn được thời gian tái sinh cây.

Mặc dù cần khẳng định thêm sự trọn vẹn của quy trình
tái sinh cây bằng cách trồng cây trên đất và theo dõi sự sinh
trưởng, phát triển và sinh sản của cây tái sinh, kết quả của
chúng tôi trên đây đã đưa ra một triển vọng là tái sinh được
giống bông 254 với tỉ lệ khá cao. Ngoài ra, tái sinh qua tạo
đa chồi cũng có thể áp dụng cho nhiều giống bông khác.

KẾT LUẬN

Đã nghiên cứu phát triển được quy trình tái sinh in vitro ở
cây bông bằng phương pháp tạo đa chồi từ phôi giống bông
vải 254. Phôi bông được nuôi cấy trên môi trường MS có tổ
hợp 0,4mg/L 2,4-D, 1,5mg/L BAP và 0,1mg/L NAA, sau
đó đỉnh chồi được cấy chuyển lên môi trường có 1mg/L
Kinetin, 2mg/L BAP và 0,1mg/L NAA để tạo cụm chồi.
Chồi phát triển kéo dài trên môi trường không có chất điểu
khiển sinh trưởng. Sau cùng một lượng rất nhỏ NAA được
dùng để kích thích tạo rễ. Kết quả này khẳng định một triển
vọng cho việc khắc phục những khó khăn của việc tái sinh
theo con đường tạo phôi sôma ở loại cây khó nuôi cấy này.

Hệ số chồi và tỉ lệ tái sinh khá cao chứng tỏ tính khả thi của

công tác chuyển nạp gen vào cây bông. Quy trình đang áp
dụng để biến nạp gen thông qua Agrobacterium.

TÀI LIỆU THAM KHẢO:

1. Agrawal D.C. 1997. In vitro induction of multiple
shoots and plant regeneration in cotton (Gossypium
hirsutum L.). Plant Cell Reports 16; 647-652.
2. Feng R., Zhang B.H., Zhang W., and Wang Q. 1998.
Genotype analysis in cotton tissue culture and plant
regeneration. Agricultural Biotechnology: Laboratory,
Field and Market. Proceedings of the 4th Asia-Pacific
Conference on Agricultural Biotechnology. Australia. 161-
163.
3. Finer J.J. 1988. Plant regeneration from somatic
embryonic suspension cultures of cotton. Plant Cell Reports
10: 346-350.
4. Finer J.J. 1990. Transformation of cotton (Gossypium
hirsutum L.) via particle bombardment. Plant Cell Reports
8: 586-589.
5. Firoozabady E. 1986. Isolation, culture and cell
division in cotyledon protoplast of cotton (Gossypium
hirsutum and G. barbadense). Plant Cell Reports 5; 127-
131.
6. Gould J., Banister S., Hasegawa O., Fahima M., and
Smith R.H. 1991. Regeneration of Gossypium hirsutum and
G. barbadense from shoot apex tissues for transformation.
Plant Cell Reports 10:12-16.
7. Hemphill J.K., Maier C.G.A and Chapman K.D. 1998.
Rapid in-vitro plant regeneration of cotton (Gossypium

hirsutim L.). Plant Cell Reports 17: 273-278.
8. Nguyễn Hữu Bình. Kế hoạch phát triển bông đến
2005-2010 và những giải pháp chủ yếu. 2001. Công ty
Bông Việt Nam. Tổng Công ty Dệt-May Việt Nam. 2.
9. Quyết định số 55/2001/QĐ-TTg ngày 23/4/2001 của
Thủ tướng Chính phủ.
10. Rajasekaran K. 1996. Regeneration of plants from
cryopreserved embryogenic cell suspension and callus
cultures of cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell
Reports 15: 859-864.
11. Trolinder, N. 1987. Somatic embryogenesis and plant
regeneration in cotton (Gossypium hirsutum L.). Plant Cell
Reports 6:231-234.
12. Umbeck P. 1985. Genetically transformed cotton
(Gossypium hirsutum L.) plants. Biotechnology 5: 263-
266.


SUMMARY

Developing a plant regeneration system via in vitro
induction of multiple shoots in cotton (Gossypium
hirsutum L. )

To facilitate the transformation of some important genes
such as insect-resistance and drought-tolerance encoding
genes into Vietnam cotton (Gossypium hirsutum L. )
cultivars, a study on developing a plant regeneration system
in cotton was conducted. As cotton regeneration via
somatic embryogenesis has been proved very difficult and

strictly genotype dependent, our research focused on the
regeneration by multishoot formation from seeds of high
yield cultivar 254.

Seeds were sterilized through treatment with 70% ethanol
for one minute and with 60% Javell solution for 20
minutes. It was necessary to separate cotyledons from the
seed scores to obtain embryos as explants for in vitro
regeneration. A wide range of hormonal combinations were
screened for optimal processes: multishoot induction,
multishoot formation, shoot elongation and root formation.

Based on the media screening results, a procedure for
multiple shoot–mediated plant regeneration in cotton has
been established. Having been isolated from sterile seeds,
embryos were cultured for 10 days on multishoot induction
medium consisting of 0.4 mg/L 2,4-D, 1.5 mg/L BAP and
0.1 mg/L NAA. This plant regulator combination played an
important role in slowing down the differentiation process
of the embryos. Then the apical meristem regions of 2 mm
long were dissected and passed onto multishoot formation
medium with 1 mg/L Kinetin, 2 mg/L BAP and 0.1 mg/L
NAA, which drove the continuously dividing cells derived
from the former process towards the formation of shoots.
After 8 weeks with one subculture, a cluster of average 4,5
shoots and maximum 10 shoots arose from each shoot apex
of an original zygotic embryo. Subsequently, individual
shoots were separated from the shoot clusters and were
induced to elongate on the medium without
phytohormones. Afterwards, rooting could be easily

obtained by adding 0.2mg/L NAA. All the media contain
major and minor Murashige and Skoog salts as basal
components. Transferring the in vitro rooted plantlets into
soil will be expected to verify the whole regeneration
system. However, the relatively high rate of shoot mass
formation could help the genetic transformation in cotton
become feasible.

Người thẩm định: TS. Nông Văn Hải