BÁO CÁO KHOA HỌC: "ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON ESCULENTUM MILL)" ppt

ẢNH HƯỞNG CỦA MANNITOL ĐẾN TÍCH LUỸ
PROLIN VÀ GLUCOSE LIÊN QUAN VỚI KHẢ
NĂNG ĐIỀU CHỈNH THẨM THẤU TRONG NUÔI
CẤY CALLUS CÀ CHUA (LYCOPERSICON
ESCULENTUM MILL)

Trương Thị Bích Phượng, Hồ Thị Kim Khánh
Trường đại học Khoa học, Đại học Huế
Nguyễn Hữu Đống
Viện Di truyền Nông nghiệp, Hà nội

1. MỞ ĐẦU

Hạn là một trong những tác động bất lợi của môi trường
xung quanh gây mất nước ở thực vật. Theo Mussell H và
Staples RC (1979) một trong những xu hướng để thực vật
chống mất nước là dựa trên khả năng làm tăng áp lực nội
tại, tăng tính đàn hồi của màng tế bào, giảm kích thước tế
bào Thông thường stress nước gây rối loạn toàn bộ
phương thức chuyển hóa ở thực vật, làm tăng tích lũy hoặc
giảm hàm lượng các chất chuyển hóa như carbohydrate,
acid hữu cơ, amino acid, các hợp chất amon và abscisic
acid (Kaur và cs. 2000). Khả năng diều chỉnh thẩm thấu và
tích lũy các hợp chất hữu cơ hòa tan ở thực vật khi bị stress
hạn đã được quan sát thấy ở nhiều loài, sự tích lũy prolin và
đường sẽ khởi động tính chống chịu stress thẩm thấu và
muối cao (Watanabe và cs. 2000). Việt nam là nước nằm
trong khu vực nhiệt đới gió mùa hạn là yếu tố thường
xuyên tác động gây ảnh hưởng đến sinh trưởng, phát triển
của cây trồng, ảnh hưởng xấu đến năng suất và phẩm chất
của chúng. Vì vậy việc nghiên cứu các cơ chế chống chịu

hạn sẽ là cơ sở cho việc cải thiện giống cũng như tạo ra
được các giống có tính chống chịu.

Cà chua là loại rau quả có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao,
nhưng ở một số vùng ở nước ta nó còn giữ giá trị thấp trong
cơ cấu cây trồng. Hiện nay các nghiên cứu trên đối tượng
này chỉ dừng lại ở việc sử dụng hệ thống cây trồng hoàn
chỉnh. Sử dụng những tiến bộ trong lĩnh vực nuôi cấy mô
và tế bào đã thiết lập một công cụ hữu ích cho việc nghiên
cứu các cơ chế tế bào của tính chống chịu stress. Kết quả
nghiên cứu của chúng tôi góp phần làm sáng tỏ về vai trò
của sự tích luỹ các chất prolin và glucose của callus cà chua
liên quan với sự điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong điều
kiện stress nước.

2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU:

2.1. Nguyên liệu thực vật:

Sử dụng hạt cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) của
giống P375

2.2. Nuôi cấy cây và duy trì cây cà chua trong điều kiện
in-vitro

Hạt giống được rửa sạch dưới dòng nước chảy, để ráo rồi
đưa vào tủ cấy. Hạt đuợc khử trùng theo trình tự sau: khử
trùng sơ bộ bằng cồn 70% trong 1 phút, sau đó bằng HgCl
2

0,1% trong 2 phút. Hạt được rửa sạch 5 lần bằng nước cất
vô trùng. Hạt đã khử trùng được cấy lên môi trường MS cơ
bản (Murashige-Skoog 1962), saccharose 30 g/l, agar 8 g/l
ở pH 5,8; sau 10 ngày nuôi sẽ xuất hiện các cây con. Cây
được nhân giống vô tính bằng cách chuyển đỉnh sinh
trưởng và đoạn thân có một đốt lá lên môi trường cơ bản
MS có bổ sung kinetin 1,0 mg/l; IBA 0,1 mg/l; B1 1,0
mg/l; B6 0,1 mg/l.

2.3. Nuôi cấy callus:

Mảnh lá (5x5 mm) và đoạn thân (5 mm) của cây in-vitro
được cấy lên môi trường tạo callus bao gồm môi trường cơ
bản MS, bổ sung thêm saccharose 30 g/l; kinetin 2,0 mg/l;
NAA 0,5 mg/l; agar 8 g/l ở pH 5,8.

Các khối callus (đường kính 2 mm) được nuôi 1 tuần trên
môi trường tạo callus có bổ sung ABA nồng độ 10-5 M để
tiền xử lý. Sau đó chúng được chuyển sang môi trường
tương tự nhưng thay ABA bằng mannitol ở các nồng độ 3,
6, 9 và 12% để gây stress nước trong các thời gian khác
nhau 7, 14, 21 và 28 ngày.

Các thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành ở nhiệt độ 25±2
o
C,
cường độ chiếu sáng 2000-3000 lux, thời gian chiếu sáng 8
giờ/ngày.

2.3. Xác định tốc độ sinh trưởng tương đối

Khả năng sinh trưởng của callus cà chua được xác định
bằng chỉ số tốc độ sinh trưởng tương đối (RGR) theo công
thức của Lutt và cs. (1996):


Trong đó:

t = t2 - t1 (t1: thời điểm bắt đầu nuôi cấy, t2: thời điểm
sau khi nuôi cấy), W1: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời
điểm t1, W2: trọng lượng tươi (g) của mô tại thời điểm t2.

2.4. Xác định áp suất thẩm thấu:

Áp suất thẩm thấu (P) được xác định theo phương pháp của
Schardakov (Grodzinski và Grodzinski 1981) và tính toán
giá trị bằng phương trình Van-Hoff :

P = iCRT

0,987 atm = 0,1 MPa. C: nồng độ mol của dung dịch. T:
nhiệt độ tuyệt đối. R: hằng số khí (0,082). i: hệ số đẳng
trương của dung dịch (i = 1 đối với dung dịch saccharose).

2.5. Phân tích hàm lượng prolin

Hàm lượng prolin được xác định theo phương pháp của
Bates và cs. (1973), đo hấp thụ quang của dịch chiết trên
máy quang phổ ở  = 520 nm. Hàm lượng prolin được xác

định bằng đường chuẩn prolin và tính toán theo công thức
sau:


TLT: trọng lượng tươi, TLTM: trọng lượng tươi của mô

2.6. Phân tích hàm lượng glucose:

Hàm lượng glucose được xác định theo phương pháp của
Folin-Wu (Lecoq 1952) có cải tiến, đo hấp thụ quang của
dịch chiết trên máy quang phổ ở  = 590 nm và tính toán
giá trị theo đường chuẩn glucose.

2.6. Xử lý thống kê

Mỗi công thức thí nghiệm tiến hành với 3 lần lặp lại. Số
liệu thí nghiệm được xử lý bằng thống kê sinh học.

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus cà chua

Kết quả trình bày ở hình 1 cho thấy, callus cà chua có khả
năng điều chỉnh thẩm thấu tương đối tốt trên môi trường bổ
sung mannitol. Áp suất thẩm thấu của các công thức có xử
lý mannitol đều cao hơn so với đối chứng, đạt giá trị cao
nhất là 0,289 MPa (ĐC: 0,177 MPa) ở môi trường có 12%
mannitol sau 7 ngày xử lý và đạt giá trị nhỏ nhất là 0,192
MPa (ĐC: 0,181 MPa) ở môi trường có 3% mannitol sau
28 ngày xử lý.

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi còn cho thấy, sau 28
ngày xử lý ở tất cả các nồng độ mannitol áp suất thẩm thấu
của callus giảm xuống đồng loạt so với các thời gian xử lý
trước. Như vậy nếu bổ sung mannitol vào môi trường với
nồng độ tăng dần trong thời gian xử lý ngắn thì mô có khả
năng điều chỉnh thẩm thấu tốt, nhưng khi kéo dài thời gian
xử lý, thì sẽ ức chế khả năng điều chỉnh thẩm thấu của mô.

3.2. Ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu đến tốc độ sinh
trưởng tương đối của callus cà chua

Khi áp suất thẩm thấu nội bào tăng từ 0,210-0,224 MPa, tốc
độ sinh trưởng của callus tăng lên từ 0,065-0,067. Sau đó
tốc độ sinh trưởng của callus giảm dần khi áp suất thẩm
thấu tiếp tục tăng, chỉ đạt giá trị 0,0082 ở 0,278 MPa (Hình
2). Nghiên cứu của Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2000) ở
callus lúa cho thấy tốc độ sinh trưởng tương đối của mô
cũng tăng cùng áp suất thẩm thấu nội bào và đạt cực đại ở
giá trị 0,016/0,64 MPa, sau đó bắt đầu giảm dần tương
quan nghịch với áp suất thẩm thấu.

3.3. Khả năng tích luỹ prolin của callus

Tương tự như áp suất thẩm thấu, hàm lượng prolin trong
các công thức thí nghiệm đều cao hơn so với đối chứng
(Hình 3). Trong cùng thời gian xử lý, hàm lượng prolin
trong callus tăng dần ở môi trường có 3-9% mannitol và
giảm ở 12% mannitol. Trường hợp ở cùng nồng độ
mannitol, hàm lượng prolin trong callus cà chua tăng theo

thời gian xử lý từ 7-14 ngày và giảm ở 21-28 ngày. Hàm
lượng prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/g TLT ở
mannitol 9% sau 14 ngày xử lý (ĐC: 2,716 mol/g TLT).
Theo Delauney và Verma (1973), sinh tổng hợp prolin
được điều khiển bởi enzyme '-pyrrolin -carboxylate
synthetase (P5CS). Enzyme này được điều hoà nhờ prolin
thông qua ức chế ngược. Ở thực vật chịu stress nước, sự
điều hoà ngược này đã biến mất và đây có thể là nguyên
nhân làm tăng tích luỹ prolin dưới các điều kiện stress.

3.4. Khả năng tích luỹ glucose của callus

Khác với trường hợp prolin , sự tích lũy glucose trong
callus xử lý stress nước có sự sai khác không đáng kể, tuy
vẫn cao hơn so với đối chứng ở tất cả các công thức thí
nghiệm. Ở cùng một nồng độ mannitol, sự tích lũy glucose
của callus cà chua tăng từ 7-21 ngày và giảm sau 28 ngày
xử lý. Trường hợp ở cùng một thời gian xử lý, hàm lượng
glucose trong callus tăng từ 3-9% và giảm ở 12% mannitol.
Hàm lượng glucose đạt giá trị cao nhất là 10,154 mg/g TLT
(ĐC: 7,304 mg/g TLT) ở môi trường có 9% mannitol sau
21 ngày xử lý (Hình 4).

3.5. Thảo luận

Việc xử lý stress nước callus cà chua cho thấy sự thay đổi
hàm lượng prolin và hàm lượng glucose trong dịch bào có
liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm thấu trong tế bào.
Thực vật có thể duy trì một sức trương không đổi trong quá
trình khô hạn bằng cách tích luỹ các chất hoà tan để tăng áp

lực nội tại tế bào. Hàm lượng prolin trong callus cà chua
tăng theo thời gian xử lý từ 7-14 ngày và giảm ở 21-28
ngày. Ở mannitol 9% sau 14 ngày xử lý, hàm lượng prolin
đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/gTLT, gấp khoảng 4,8
lần so với đối chứng. So với hàm lượng prolin , hàm lượng
glucose trong callus cà chua tăng ít hơn và đạt giá trị cao
nhất là 10,154 mg/g TLT ở môi trường có 9% mannitol sau
21 ngày xử lý, chỉ gấp khoảng 1,4 lần đối chứng. Hàm
lượng prolin và glucose trong callus giảm sau 28 ngày xử
lý stress nước, tương ứng với việc giảm áp suất thẩm thấu
nội bào. Theo Gzik (1996), nhiều loài thực vật phản ứng
nhanh với các nhân tố gây stress bằng cách tăng nồng độ
các chất hòa tan thích hợp để điều chỉnh thẩm thấu, bảo vệ
protein và màng ở điều kiện thế năng nước thấp. Tích lũy
prolin tự do dường như là phương thức phổ biến đối với
stress ở thực vật bậc cao.
Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (1992) nhận thấy các tế bào của
những dòng thuốc lá có khả năng chịu muối và chịu mất
nước, hàm lượng đường khử tăng một cách rõ rệt hơn từ
2,11 - 4,9 lần. Nghiên cứu tế bào của callus lúa bị stress
nước (Nguyễn Hoàng Lộc và cs. 2000) cho thấy có sự gia
tăng đáng kể hàm lượng glucose so với đối chứng ở tất cả
các công thức thí nghiệm; ở nồng độ mannitol từ 3-9% hàm
lượng glucose tăng dần từ 7-28 ngày xử lý; ở mannitol 12%
hàm lượng glucose tăng dần từ 7-21 ngày xử lý và giảm ở
28 ngày xử lý. Như vậy rõ ràng những phân tử đường có
cấu trúc phân tử nhỏ và dễ tan trong dịch bào có vai trò
quan trọng trong việc tham gia điều chỉnh áp suất thẩm
thấu. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh được rằng sự tích
luỹ nhiều chất tương ứng với áp suất thẩm thấu trong tế bào

có thể ngăn chặn sự mất nước hay gia tăng khả năng giữ
nước, với sự tích luỹ này giúp cho tế bào trương lên và tăng
kích thước (Kogan và cs. 2000). Morgan (1984) cho rằng
các hợp chất hoà tan liên quan đến sự điều chỉnh thẩm thấu
là các loại đường đặc biệt, các amino acid, các ion vô cơ và
hữu cơ, trong đó sự tích lũy prolin và đường sẽ khởi động
tính chống chịu stress thẩm thấu (Watanabe và cs. 2000).

Áp suất thẩm thấu của callus cà chua gia tăng theo nồng độ
mannitol trong môi trường nuôi cấy từ 3-12%, tuy nhiên sự
tích lũy prolin và glucose ở môi trường có 12% mannitol
lại giảm xuống. Trường hợp áp suất thẩm thấu vẫn tiếp tục
tăng ở 12% mannitol có thể là do tác động của sự tích lũy
của các chất hòa tan khác trong tế bào hoặc tế bào có sự
thay đổi về cấu trúc. Theo kết quả xác định kích thước tế
bào callus cà chua (Trương Thị Bích Phượng và cs. 2000)
cho thấy ở môi trường có 12% mannitol tế bào có kích
thước nhỏ nhất sau 2 và 3 tuần nuôi cấy và sau 4 tuần nuôi
cấy thì kích thước tế bào thay đổi không đồng đều, bên
cạnh những tế bào có kích thước lớn là những tế bào có
kích thước bé. Nghiên cứu của Gebre và cs. (1997) cho
thấy sự tích lũy của glucose và fructose trong các dòng
Populus delfoids tạo ra thế năng thẩm thấu của lá thấp hơn
và đây là yếu tố giúp duy trì sức trương tế bào dưới điều
kiện stress nước. Sucrose và các loại đường hòa tan khác có
thể giúp cho thực vật tăng khả năng chống chịu sự mất
nước thông qua vai trò là một nhân tố thẩm thấu (Nieves và
cs. 2001). Điều này cho thấy có mối liên quan giữa điều
chỉnh áp suất thẩm thấu với việc tích luỹ các chất hoà tan
trong dịch bào và thay đổi kích thước tế bào. Theo nghiên

cứu của nhiều tác giả thì một trong những phương thức
thích nghi với sự thiếu nước của môi trường là khả năng
làm tăng áp suất thẩm thấu nội bào liên quan tới việc tăng
tích luỹ các chất hoà tan như các loại đường polyol, prolin ,
glycinebetain , các ion vô cơ (Serrano và cs. 1994), cùng
với việc tăng tính đàn hồi của màng tế bào và giảm kích
thước tế bào (Mussell và cs. 1979).

4. KẾT LUẬN

- Áp suất thẩm thấu của callus cà chua tăng dần theo nồng
độ mannitol (3-12%) và thời gian xử lý từ 7-21 ngày, sau
đó giảm ở 28 ngày. Áp suất thẩm thấu của callus cà chua ở
các môi trường có mannitol đều cao hơn so với đối chứng,
đạt cực đại là 0,289 MPa (ĐC: 0,177 MPa) ở nồng độ
mannitol 12% sau 7 ngày xử lý.

- Hàm lượng prolin của callus tăng dần ở môi trường nuôi
có 3-9% mannitol và giảm ở 12% mannitol. Hàm lượng
prolin đạt giá trị cao nhất là 12,992 mol/g TLT ở nồng độ
mannitol 9% sau 14 ngày xử lý (ĐC: 2,716 mol/gTLT).

- Sự tích luỹ glucose trong callus cà chua bị stress cao hơn
so với đối chứng ở các công thức thí nghiệm. Hàm lượng
glucose trong callus tăng dần theo thời gian xử lý từ 7-21
ngày, giảm ở 28 ngày xử lý và đạt giá trị cao nhất là 10,154
mg/g TLT ở mannitol 9% sau 21 ngày xử lý (ĐC: 7,304
mg/g TLT).

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Bates LS, Waldren RP and Teare ID. 1973. Rapid
determination of free proline for water stress studies. Plant
and soil 39, 205-207
Delauney AJ and Verma DPS. 1993. Proline biosynthesis
and osmoregulation in plants. The Plant Journal, 4(2): 215-
223.
Gebre GM, Brandle JR, Kuhns MR. 1991. Influence of
rewatering and time of sampling on solute accumulation of
two Populus deltoides clones. Tree Physiol 17: 341-346.
-aminoaGzik A. 1996. Accumulation of proline and pattern
of acid in sugar beet plants in response to osmotic, water
and salt stress. Enviromental and Experimental Botany,
39(1): 29-38.
Grodzinski AM và Grodzinski DM. 1981. Sách tra cứu tóm
tắt về sinh lý thực vật. NXB Mr-Maxcơva, NXB Khoa học
và Kỹ thuật Hà nội.
Karakas B, Akin PO, Stushnoff C, Suefferhelo M and
Rieger M. 1997. Salinity and drought tolerance of
mannitol-accumulating transgenic tobacco. Plant Cell and
Environment, 20: 609-616.
Kaur S, Gupta AK, Kaur N. 2000. Effects of GA3, kinetin
and indole acetic acid on carbohydrate metabolism in
chickpea seedlings germinating under water stress. Plant
Growth Regulation 30: 61-70.
Kogan MJ, Kristoff G, Benavides MP and Tomaro ML.
2000. Effect of pre-treatment with ethanolamine on the
response of Helianthus annuus L. to salt stress. Plant
growth regulation, 36: 87-94.
Lecoq R. 1952. Manuel-D'analyes me'dicales et de biologie

clinique. G. Doin ( CIE -e'diteurs, Paris, 502-503.
Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thanh Thu, Lê Thị Muội, Lê
Trần Bình. 1992. Nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của một số
dòng thuốc lá có khả năng chịu muối và chịu mất nước khi
nuôi cấy in vitro. Di truyền học và ứng dụng. Số 1, 35-39.
Nguyễn Hoàng Lộc, Võ Châu Tuấn, Phan Công Bình và Lê
Thị Thính. 2000. Ảnh hưởng của mannitol đến tích luỹ
prolin và glucose liên quan với khả năng điều chỉnh thẩm
thấu trong nuôi cấy callus lúa (Orya sativa L.). TC Sinh
học, 22(3b) CĐ, 96-100.
Lutt S, Kinet JM, Bourhamont J. 1996. Effects of various
salts and of mannitol on ion and proline accumulation in
relation to osmotic adjustment in rice (Oryza sativa L.)
callus cultures. J Plant Physiol 149, 186 - 195.
Morgan JM. 1984. Osmoregulation and water stress in
higher plants. Ann Rev Plant Physiol 35: 299-319.
Murashige T, Skoog F. 1962. A revised medium for rapid
growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Plant,
15, 473-497.
Mussell H, Staples RC. 1979. Stress physiology in crop
plants. John Wiley and Sons, Inc.
Nieves N, Martinéz ME, Castillo R, Blanco MA, González-
Olmedo JL. 2001. Effect of abscisic acid and jasmonic acid
on partial desiccation of encapsuled somatic embryos of
sugar-cane. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 65: 15-21.
Trương Thị Bích Phượng, Phạm Thị Duy Phương. 2001.
Ảnh hưởng của mannitol đến sự thay đổi kích thước tế bào
callus cà chua (Lycopersicon esculentum Mill). Tạp chí
Khoa học Đại học Huế, số 8, 85-91.
Serrano R and Gaxiola R. 1994. Microbial models and salt

stress tolerance in plants. Critical Review in Plant Sciences.
13(2): 121-138.
Watanabe S, Kojima K, Ide Y, Sasaki S. 2000. Effects of
saline and osmotic stress on proline and sugar accumulation
in Populus euphratica in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ
Culture 63: 199-206.


SUMMARY

Effects of mannitol on proline and glucose accumulation
in relation to osmotic adjustment in tomato
(Lycopersicon esculentum Mill) callus culture

Truong Thi Bich Phuong, Ho Thi Kim Khanh
College of Science, Hue University
Nguyen Huu Dong
Institute of Agriculture Genetics

Tomato calli were obtained and treated on the medium
containing 10-5 M ABA. After 7 days, treated calli were
transferred into the medium containing different
concentration of mannitol (3, 6, 9 and 12%) after 1, 2, 3
and 4 weeks of water stress treatment. Osmotic pressure,
relative growth rate, proline and glucose accumulation were
quantified in the same the experimental condition.

The results showed that relative grow rate, proline and
glucose concentrations relate to osmotic adjustment ability.
The osmotic pressure of tomato callus increased during

water-stress treatment periods from 7 to 21 days at all
different concentrations of mannitol (3, 6, 9 and 12%
mannitol) and then decrease at 28 days, but the value of
osmotic pressure of water-stress treatment callus was
greater than that of control callus. The maximum value of
osmotic pressure of callus was 0,289 MPa at 12% mannitol
after 7 days of treatment, while that of the control callus
was 0,177 MPa. At the osmotic pressure of 0,210-0,224
MPa, the relative growth rate ranged from 0,065-0,067.
After that relative growth rate was negatively correlated
with its osmotic pressure. The proline and glucose
concentrations increased at all the concentrations of
mannitol. The glucose concentrations increased from 7 to
21 days of treatment and decreased at 28 days, too. At 9%
mannitol, after 21 days of treatment, the glucose
concentrations were maximum and reached 10,154 mg/g
FW (the glucose concentration of the control callus was
7,304 mg/g FW). The proline concentrations of mannitol
treated callus were greater than that of control callus. The
proline concentrations were maximum at 9% mannitol after
14 days of water stress treatment and reached 12,992
mol/g FW (the proline concentration of the control callus
was 2,716 mol/g FW), about 4.8 times times compared to
the control.

*FW is fresh weight

Người thẩm định khoa học: TS. Nguyễn Huỳnh Minh
Quyên, Viện Di truyền Nông nghiệp (Đt: 7540764 (Cq))

Hình 1. Khả năng điều chỉnh thẩm thấu của callus nuôi cấy
trên môi trường có mannitol (p <0,05)




Hình 2. Mối liên quan giữa khả năng điều chỉnh thẩm thấu
và tốc độ sinh trưởng tương đối của callus cà chua




Hình 3: Khả năng tích luỹ prolin của callus nuôi cấy trên
môi trường có mannitol (p < 0,05)



Hình 4: Khả năng tích luỹ glucose của callus trên môi
trường có mannitol (p < 0,05)