BÁO CÁO KHOA HỌC: "TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM" doc

TÌM HIỂU CÁC ENZYM BẢO VỆ ÔXI HOÁ CỦA
NẤM LINH CHI GANODERMA LUCIDUM

Tạ Bích Thuận, Phạm Kiên Cường, Đặng Quang Hưng
Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
ĐHQGHN

MỞ ĐẦU

Nấm Linh Chi (Ganoderma lucidum) từ lâu đã được coi
như là một loại "thần dược” với những tác dụng giá trị
dược liệu như bổ gan, thận, phổi, điều hoà huyết áp, làm
giảm lượng đường và colesteron trong máu Gần đây nấm
Linh Chi còn được dùng để điều trị các bệnh ung thư và
được xem là nguyên liệu chứa nhiều chất chống oxy hoá.

Nhằm đóng góp thêm các dẫn liệu về loại nấm có nhiều giá
trị dược liệu này, chúng tôi đã tiến hành tìm hiểu các
enzyme bảo vệ oxi hoá của nấm Linh Chi, trong đó trước
hết tập trung vào 3 enzym chính đó là catalase, superoxid
dismutase và NADH oxidase. Bài báo này giới thiệu một số
kết quả mà chúng tôi đã thu được.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Nguyên liệu

Nấm Linh Chi Ganoderma lucidum - ký hiệu GAL được
lấy từ phòng Giống nấm gốc của Trung tâm Công nghệ
sinh học, Đại học Quốc Gia Hà Nội, được GS. Trịnh Tam
Kiệt định tên khoa học.

Phương pháp nghiên cứu

- Nuôi cấy nấm Ganoderma lucidum được trình bày trong
[1,2]

- Protein được xác định theo phương pháp của Lowry, dùng
casein làm chất chuẩn [7]

- Hoạt độ SOD được xác định theo phương pháp McCord
và Fredovich [3,9]

- Hoạt độ catalase được xác định theo phương pháp của
Thibodeau và cộng sự [8] và lượng H
2
O
2
còn lại được xác
định theo phương pháp của Mottola và cộng sự [10]

- Hoạt độ của NOX được xác định theo phương pháp của
Poole và Clairborne [11]

- Điện di trên gel polyacrylamide được tiến hành theo
phương pháp của Laemmli [6]

-Tinh sạch enzyme bằng cột sắc ký trao đổi ion qua cột DE-
52, sắc ký lọc gel qua cột Sephadex G100 [4,5].

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự sinh trưởng và phát triển của nấm GAL

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy hệ sợi của nấm
GAL phát triển thích hợp ở 26-28
o
C. Sau 18-24 giờ cấy, hệ
sợi bắt đầu phát triển mạnh trên môi trường nuôi cấy lỏng.
Chủng Ganoderma lucidum có tốc độ sợi mọc từ 150 - 200
ml/giờ. Còn trong điều kiện nuôi cấy sinh quả thể, kết quả
cho thấy sau khoảng 25-30 ngày nuôi cấy, hệ sợi nấm bắt
đầu bện kết. Sau khoảng 2-3 tháng kể từ khi cấy giống, tán
nấm phát triển thành thục, mỗi bịch chỉ cho 1-2 tán nấm
lớn, năng suất thu hái tương đối thấp từ 2,5 - 4%.

Hoạt độ các enzym NADH, CAT, SOD của nấm GAL
Hoạt độ enzym NADH oxidase (NOX) của nấm GAL
Kết quả xác định hoạt độ của enzym NADH oxidase được
trình bày ở hình 1.

Hình 1. Hoạt độ NADH oxidase (NOX) của nấm GAL


Qua đây chúng tôi thấy rằng hoạt độ NOX của nấm GAL
nhìn chung là tương đối thấp, chỉ đạt 0,049 đơn vị/ g
nguyên liệu tươi. Hoạt độ NOX của nấm GAL ở dạng sinh
khối cao hơn so với hoạt độ NOX ở dạng quả thể đạt 0,029
đơn vị/g nguyên liệu tươi

Hoạt độ enzym catalase (CAT) của nấm GAL

Catalase (CAT) là enzym chủ yếu giữ vai trò quan trọng
phân huỷ các H
2
O
2
trong hầu hết các cơ thể sinh vật. Kết
quả xác định hoạt độ CAT của mẫu GAL ( hình 4) cho thấy
hoạt độ CAT của nấm GAL nhìn chung là tương đối cao,
đạt tương ứng là 2,331 đv/mg protein và 2,319 đv/mg
protein ở dạng quả thể và dạng sinh khối.

Hình 2. Hoạt độ catalase (CAT) của nấm GAL


Hoạt độ enzym superoxit dismutase (SOD) của nấm GAL

Kết quả phân tích hoạt độ enzym SOD của nấm GAL được
biểu hiện ở hình 5, nhìn vào đồ thị cho ta thấy hoạt độ riêng
enzym SOD của quả thể là 1,517 đv/mgPr, còn ở dạng sinh
khối hoạt độ riêng tương ứng với 10,279 đv/mgPr

Hình 3. Hoạt độ superoxit dismuatse (SOD) của nấm GAL


Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD,
NADH chúng tôi đã chọn enzym NADH oxidase để tách,
tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất.

Bước đầu tinh sạch và nghiên cứu một số tính chất của

NOX từ sinh khối nấm GAL.

Trên cơ sở xác định hoạt độ của các enzym CAT, SOD,
NOX chúng tôi đã chọn enzym NOX để tách, tinh sạch và
nghiên cứu một số tính chất.

Tinh sạch một phần enzym NOX từ sinh khối nấm GAL

Để tinh sạch NOX từ sinh khối của nấm GAL, chúng tôi
tiến hành thu dịch chiết, bổ sung thêm 0,1 thể tích đệm
Tris-HCL 100mM, pH 8,0 để nồng độ cuối cùng của đệm
là 100mM, pH đảm bảo đạt 8,0 và cho sắc ký qua cột gel
DEAEcellulose DE-52, cột Sigma có kích thước 3x14 cm,
được cân bằng với cùng đệm trên. Phần protein gắn trên cột
được rửa chiết bằng gradient NaCl từ 50 mM- 1000 mM
pha trong đệm Tris- HCl 100mM, pH 8,0.

Kết quả phân tích protein và hoạt độ NOX của các phân
đoạn sắc ký qua cột cho thấy phần dịch không hấp thụ
không có hoạt độ NOX. Phần hấp thụ được đẩy ra dưới
dạng 3 đỉnh protein chính, trong đó chỉ có đỉnh đầu tiên
được đẩy ra ở nồng độ khoảng 370mM là có hoạt độ NOX.
Sử dụng SDS-PAGE để đánh giá độ sạch của chế phẩm
NOX sau khi qua cột DE-52 (hình 4) cho thấy chế phẩm có
một băng protein rõ nét với kích thước khoảng 40 kDa và
một số băng protein khác nhưng ít rõ nét hơn ( H4.cột 2)

Để tiếp tục tinh sạch NOX của GAL, chúng tôi đã tiến hành
tập trung các phân đoạn có hoạt độ NOX qua cột DE-52, cô
đặc mẫu bằng centricon và cho sắc ký qua cột lọc gel

Sephadex G-100. Cột có kích thước 1x70cm, được cân
bằng với đệm. Kết quả rửa chiết và phân tích protein và
hoạt độ NOX của các phân đoạn qua cột Sephadex G100
cho thấy có 2 đỉnh protein chính, trong đó đỉnh thứ nhất có
hoạt độ NOX.

Kết quả kiểm tra độ sạch của chế phẩm sau khi qua bước
lọc gel cho thấy ngoài băng protein 40 kDa vẫn còn một số
băng khác có mặt trong chế phẩm, cho thấy chế phẩm chưa
được tinh sạch hoàn toàn và cần tiếp tục tinh sạch.

Hình 4: Kết quả điện di phổ băng protein của nấm GAL
Cột M: Thang chuẩn protein; Cột 1: Dịch mẫu thô nấm
GAL;
Cột 2: Mẫu chạy qua cột DE-52 ; Cột 3: Mẫu chạy cột lọc
gel G-100


Nghiên cứu một số tính chất của enzym NOX

Sau khi thu được chế phẩm NOX tinh sạch một phần qua
bước sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel chúng tôi đã tiến
hành tìm hiểu một số tính chất của enzym.

Độ bền nhiệt

Kết quả phân tích độ bền của enzym NOX bằng cách ủ
enzym ở các nhịêt độ khác nhau và sau đó xác định hoạt độ
còn lại (hình 5) cho thấy NOX của nấm GAL là tương đối
bền với nhiệt, ở nhiệt độ 30-60

o
C sau 15 phút xử lý enzym
vẫn giữ nguyên hoạt độ ban đầu. Tuy vậy khi xử lý ở 80
o
C,
trong 15 phút thì enzym chỉ còn 10% hoạt độ ban đầu.


Ảnh hưởng của một số ion kim loại


Kết quả phân tích ảnh hưởng của 5 ion kim loại (Ca
2+
,
Cu
2+
, Fe
2+
, Mg
2+
, Zn
2+
) và anion F
-
lên hoạt độ của NOX
(hình 6) cho thấy chỉ có Fe
2+
ở nồng độ 3-4mM có khả
năng làm tăng một phần hoạt độ của NOX. Các ion Ca
2+

,
Mg
2+
và Zn
2+
và anion F
-
không ảnh hưởng đến hoạt độ của
enzym. Còn ion Cu
2+
ở nồng độ 4mM ức chế hoạt độ của
NOX.

Hình 6: Ảnh hưởng của ion kim loại lên hoạt độ của NOX


Xác định NOX của nấm GAL là thuộc loại sinh H
2
O hay
sinh H
2
O
2
.

Theo các nghiên cứu khác nhau [10], NADH oxidase của
các sinh vật được phân thành hai nhóm: nhóm thứ nhất xúc
tác cho phản ứng oxi hoá một phân tử NADH đến oxi và
hình thành nên một phân tử H
2

O
2
, vì vậy được gọi là NOX
sinh H
2
O
2
. Nhóm thứ hai oxi hoá 2 phân tử NADH và tạo
H
2
O, nên có tên là NOX sinh H
2
O. Kết quả xác định lượng
H
2
O
2
sau phản ứng giữa NADH và enzym cho thấy H
2
O
2
không hình thành sau phản ứng, chứng tỏ NADH oxidase
của nấm GAL thuộc nhóm sinh H
2
O.

Tóm lại, qua nghiên cứu này chúng tôi đã điều tra được
hoạt độ ba enzym bảo vệ oxi hoá là SOD, CAT và NOX
của nấm GAL ở dạng quả thể cũng như dạng sinh khối. Có
sự khác nhau về hoạt độ enzym giữa hai loại mẫu này.

Chúng tôi cũng đã bước đầu thu được chế phẩm NOX ở
dạng tinh sạch một phần bằng phương pháp sắc ký qua cột
trao đổi ion DE-52 và cột lọc gel Sephadex G-100. Các kết
quả xác định tính chất chứng tỏ NOX của nấm GAL là
thuộc nhóm sinh H
2
0, khá bền với nhiệt, được hoạt hoá bởi
Fe
2+
và bị ức chế bởi Cu
2+
.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Nấm lớn ở Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật -
Hà Nội, 1981.
2. Lê Xuân Thám - Nấm Linh Chi Dược Liệu quý ở Việt
Nam, Nhà xuất bản mũi Cà Mau - 1996.
3. Beanchamp, C., Fridovich, I., 1971. Superoxide
dismutase: Improved assays and assay applicable to
acrylamide gel. Anal. Biochem., 1: 276 - 287.
4. Coco, D., Kinaldi, A., savini, I., Cooper, J.M., Bannister,
J.V., 1988. " NADH oxidase from the extreme
Thermophile Thermus aquatiousYT-1. Purification and
characteristic". Eur. J. Biochem., 174: 267 -271.
5. David Toomey and Stephin, G.M., 1998 " Purification
and characteristic of NADH oxidase from Thermus
aquatious YT -1 and evidnce that is function tin a
peroxidase reduction system", Eur.J. Biochem, 254: 935 -

945.
6. Leammli, U.K., 1970. Cleavage of structure protein
during the assembly of the head of bacterophage T4.
Nature, 227: 680-685.
7. Lowry,O.H. Rose brough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J.,
1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J.
Biochem., 193: 265 - 270. 9. Mc Cord, J.M, Fridovich, L.,
1969. Superoxide dismutase an enzymic function
orerthoenperia. J. Biochem. 244 : 6049 - 6055
8. Mc Cord, J.M, Fridovich, L., 1969. Superoxide
dismutase an enzymic function forerthoenperia. J.
Biochem. 244 : 6049 - 6055 9. Mottola - Aebi, H.E.,
(1987), " Catalase" In : Methods of enzymatic analysis, ,
eds, Bermeyer, J., Grabl, M., VCH Publishers . New York.,
273 - 285
10. Mottola, H.A., Simpson, B.E., Gorin, G., 1970.
Absorptiometric determination of hydrogen peroxide in
submicrogram amout with leucin crystal violet and
peroxodase as catalyst. Anal. Chemistry., 42 : 410 - 411
11. Poole, L.B., and Claibome, A. 1986. Interactions of
pyrimidine nucleotide with redox forms of the flavin-
containing NADH peroxidase form from streptococcus
faecalis J. Biol. Chem., 261 : 14525 - 14533

SUMMARY

Investigation on some anti-oxidation enzymes of
Ganoderma lucidum

For many year Ganoderma lucidum (GAL) has been

considered to be a valualbe medicinal fungus with
anticancer and anti-oxidation activities. In this study,
Ganoderma lucidum was selected for investigation of some
anti-oxidation enzymes including catalase (CAT),
superoxide dismutase (SOD), NADH oxidase (NOX).

Our obtained results shows that GAL biomass grown in lab
conditions has higher activity of CAT and NOX enzymes
than GAL fruit body. SOD is present at the lowest level in
both of samples.

The NOX (which was partially purifed by chromatography
on DEAE-cellulose and Sephadex-G100 columns) appears
to work well at pH 7.5 – 8 as a thermostable enzyme with
more than 60% of activity remained after treatment at 60
o
C
for 15 minutes. However, the enzyme quickly lost its
activity when being incubated at 80
o
C. Some ions such as
Mg
2+
, Ca
2+
at 1 - 4mM concentrations hardly effect the
activity of enzyme. Fe
2+
at 1 - 4mM concentration
stimulates the activities of the enzyme whereas Cu

2+
at the
same concentrations shows to be strongly inhibitory for its
activity.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Bùi Phương
Thuận