BÁO CÁO KHOA HỌC: "XENORHABDUS SP. CA: MỘT SỐ TÍNH CHẤT CỦA PROTEINAZ NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG" ppsx

XENORHABDUS SP. CA: MỘT SỐ TÍNH CHẤT
CỦA PROTEINAZ NGOẠI BÀO TỪ VI KHUẨN
CỘNG SINH VỚI TUYẾN TRÙNG

Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Lương
Thuỳ Dương
Khoa Sinh học, Ttường Đại học Khoa học Tự nhiên
Phan Thị Hà
Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội
Ở Việt Nam, một số chủng tuyến trùng gây bệnh côn trùng
đã được phân lập từ đất thuộc một số địa phương trong cả
nước [4]. Các chủng tuyến trùng này đã được nghiên cứu
và thử nghiệm trong phòng trừ sinh học có nhiều triển vọng
ứng dụng trong thực tiễn [3,5]. Khả năng gây bệnh của các
chủng tuyến trùng có liên quan đến các vi khuẩn cộng sinh
với chúng [1]. Vì vậy, việc nghiên cứu khả năng ứng dụng
trong phòng trừ sinh học không thể không quan tâm tìm
hiểu các vi khuẩn cộng sinh với chúng.

Trong bài viết trước [14] chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu
một số tính chất của proteinaz được tiết ra từ vi khuẩn
Xenorhabdus sp. XS4 được phân lập từ tuyến trùng
Steinernema ở Việt Nam. Các proteinaz này được phân loại
thuộc nhóm proteinaz kim loại do bị ức chế mạnh bởi
EDTA và o-phenalthroline. Nhằm tiếp tục tìm hiểu tính
chất của proteinaz do vi khuẩn cộng sinh với tuyến trùng
tiết ra, trong bài viết này chúng tôi trình bày một số kết quả
nghiên cứu về proteinaz được tiết ra từ vi khuẩn
Xenorhabdus sp. CA, một chủng vi khuẩn được phân lập từ
tuyến trùng Steinernema carpocapsae.

I. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA được phân lập từ tuyến
trùng Steinernema carpocapsae do Phòng Tuyến trùng,
Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, Nghĩa Đô- Từ
Liêm, Hà Nội cung cấp.

Phân lập và nuôi cấy theo phương pháp đã được mô tả như
trước [14].

Xác định hoạt độ của proteinaz: hoạt độ proteinaz đã được
xác định theo phương pháp Kunitz có cải tiến như đã mô tả
trước đây [13].

Định lượng protein theo phương pháp Lowry sử dụng
albumin huyết thanh bò làm chuẩn.
Điện di protein trên gel polyacylamit có SDS (SDS-PAGE)
theo phương pháp của Laemmli (1970) [8].

Điện di proteinaz theo phương pháp của Heussen và
Dowdle (1980) [7] được thực hiện như đã mô tả từ trước
[13]. Chuẩn bị mẫu như sau: mẫu được ủ với EDTA hoặc
PMSF trong 10 phút với nồng độ cuối cùng trong hỗn hợp
phản ứng bằng 10
-3
M, sau đó bổ sung ion Mn
2+
hoặc Fe
2+

với nồng độ cuối cùng bằng 5. 10
-3
M và 10
-2
M.

II. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

1. pH thích hợp của proteinaz

pH thích hợp của enzym được xác định với cơ chất được
hoà tan trong các đệm có nồng độ 0,2M. Kết quả cho thấy
enzym hoạt động mạnh ở pH 8 (hình1), tương tự như các
nghiên cứu khác về proteinaz của vi khuẩn cộng sinh với
tuyến trùng [12,13,15].

Chữ viết tắt: DMSO: Dimethyl Sulfoxide, PMSF:
phenylmethylsulfonyl fluoride, pCMB: p-
chloromercuribenzoate, EDTA: ethylendiaminetetraacetic
acid, o-phe: 1,10 – o-Phenanthroline.

Hình 1: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ proteinaz của vi
khuẩn cộng sinh với tuyến trùng Xenorhabdus sp. CA


2. Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu nhóm đến
hoạt độ enzym

Trong số 4 chất ức chế đặc hiệu nhóm được thử nghiệm
(PMSF, pCMB, EDTA, o-phenalthroline), enzym bị ức chế

mạnh nhất bởi PMSF và EDTA (ức chế trên 90%), còn o-
phenalthroline chỉ ức chế một phần hoạt độ enzym (ức chế
gần 10%) (hình 2).

Hình 2: Ảnh hưởng của các chất ức chế đặc hiệu nhóm đến
hoạt độ proteinaz của vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA

3. Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ
enzym

Các ion kim loại được sử dụng gồm: Ca
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
,
Cu
2+
, Fe
2+
, Co
2+
, Zn
2+
, Hg
2+
với nồng độ cuối cùng trong
hỗn hợp phản ứng bằng 10-3 M. Kết quả cho thấy enzym bị
giảm hoạt tính mạnh nhất bởi Hg2+, sau đó đến Zn

2+
, Co
2+

và Cu
2+
; ngược lại, ion Ca
2+
và Mg
2+
đã làm tăng hoạt độ
enzym 10-15% (hình 3)

Hình 3: Ảnh hưởng của ion kim loại hoá trị hai đến hoạt độ
proteinaz của vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA


4. Độ bền với nhiệt ở 60
O
C

Giữ dung dịch enzym ở 60
O
C, sau những khoảng thời gian
nhất định làm lạnh nhanh chúng và xác định hoạt độ
proteinaz ở 37
0
C. Kết quả cho thấy hoạt độ enzym giảm
dần theo thời gian xử lý ở 60
0

C. Sau 10 phút, hoạt độ còn
khoảng 15% so với hoạt độ ban đầu (hình 4).

Hình 4: Sự biến đổi hoạt độ proteinaz theo thời gian xử lý ở
600C
5. Phân tích thành phần proteinaz bằng điện di

Điện di trên gel polyacrylamit có SDS và có cơ chất gelatin
0,1% đã cho thấy có nhiều băng proteinaz (hình 5). Trong
số các băng proteinaz được nhìn thấy trên bản gel, băng
proteinaz có độ di động điện di 0,151 (biến đổi từ 0,127
đến 0,175) thể hiện hoạt độ mạnh nhất. Đây cũng chính là
băng proteinaz bị ức chế bởi EDTA và PMSF. Băng
proteinaz có độ di động điện di 0,310, không bị ức chế bởi
EDTA nhưng bị ức chế bởi PMSF. Băng proteinaz 0,246 bị
ức chế hoàn toàn bởi PMSF, nhưng cũng bị ức chế một
phần bởi EDTA.

Hình 5: Điện di trên gel polyacrylamit 10% có SDS và
gelatin 0,1% các proteinaz của Xenorhabdus sp. CA (ghi
chú: giếng 2-5, ức chế bởi EDTA; giếng 7-10, ức chế bởi
PMSF; 1, đối chứng-H20; 2, đối chứng-EDTA; 3 và 8,
Mn2+ 5.10-3M; 4 và 9, Fe2+ 5.10-3M; 5 và 10, Fe2+ 10-
2M; 6, đối chứng-DMSO; 7, đối chứng-PMSF)


Như vậy, kết quả nghiên cứu đã cho thấy: hoạt độ proteinaz
trong dịch nuôi cấy vi khuẩn Xenorhabdus sp. CA mạnh
nhất ở pH 8. Enzym kém bền với nhiệt, hoạt độ giảm nhanh
sau 10 phút xử lý enzym ở 60

0
C. Các chất ức chế đặc hiệu
nhóm như PMSF và EDTA làm giảm mạnh hoạt độ enzym
(ức chế trên 90% hoạt độ), đưa đến giả thiết cho rằng vi
khuẩn Xenorhabdus sp.CA đã tiết ra môi trường nuôi cấy cả
proteinaz thuộc nhóm xêrin và nhóm kim loại theo phân
loại của Hartley (1960) [6].

Proteinaz kim loại là enzym được tìm thấy ở nhiều loại vi
khuẩn gây bệnh côn trùng như: Pseudomonas aeruginosa,
Proteus mirabilis và Serratia marcescens [9,10]. Proteinaz
kim loại cũng được tìm thấy ở các vi khuẩn cộng sinh với
tuyến trùng thuộc các chủng Xenorhabdus [11,12,13] và
Photorhabdus [10,12,13]. Tuy nhiên, điều đáng lưu ý là:
bằng kỹ thuật điện di enzym, chúng tôi đã nhận ra được
một băng proteinaz bị ức chế bởi cả EDTA và PMSF. Đây
là băng chiếm ưu thế nhất trong bản gel điện di. Câu hỏi
được đặt ra là: liệu trong băng này có chứa một loại
proteinaz thuộc nhóm proteinaz kim loại nhạy cảm với
PMSF (còn gọi là proteinaz-xêrin như đã được tìm thấy ở
vi khuẩn Bacillus pumilus [2]), hay băng này gồm một số
băng có độ di động điện di giống nhau, trong đó có thành
phần proteinaz xêrin nhạy cảm với PMSF và có thành phần
proteinaz kim loại nhạy cảm với EDTA. Để trả lời câu hỏi
này, cần phải tiếp tục đi sâu nghiên cứu hơn nữa về thành
phần proteinaz ngoại bào của Xenorhabdus sp.CA.

III. KẾT LUẬN

1. Hoạt độ proteinaz mạnh nhất ở pH 8. Sau khi xử lý ở

60
0
C trong 10 phút, hoạt độ enzym còn khoảng 15% hoạt
độ ban đầu.

2. Trong số các ion kim loại hoá trị hai được nghiên cứu,
enzym bị ức chế mạnh bởi Hg
2+
, sau đó đến Zn
2+
, Co
2+
và
Cu
2+
. Ngược lại, các ion Ca
2+
và Mg
2+
đã làm tăng hoạt độ
enzym.

3. Xenorhabdus sp. CA đã tiết ra môi trường nuôi cấy các
proteinaz thuộc nhóm xêrin và nhóm kim loại. Điện di trên
gel polyacrylamit đã cho phép nhận thấy một băng
proteinaz chủ yếu bị ức chế bởi cả EDTA và PMSF.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Boemare N., Givaudan A., Brehelin M., and Laumond

C., 1997. Symbiosis, 22: 21-45.
2. Phạm Thị Trân Châu and Henryk Urbanek, 1974. Acta
Micobiol. Polo. 5(23)1:21-25.
3. Nguyễn Ngọc Châu, 1998. Tạp chí khoa học và công
nghệ, XXXVI (3): 24- 29.
4. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, Lại Phú
Hoàng, Phan Kế Long, 1999. Tạp chí Sinh học, 21(2b):90-
95.
5. Nguyễn Ngọc Châu, Vũ Tứ Mỹ, Lại Phú Hoàng, Ngô
Xuân Tường, 1999. Tạp chí Sinh học, 21(2b):104-113.
6. Hartley B.S., 1960. Ann. Rev. Biochem., 29 (60): 45-
72.
7. Heussen C. and Dowdle E.B., 1980. Anal. Biochem.,
102: 196- 202.
8. Laemmli U.K, 1970. Nature, 227: 680- 685.
9. Morihata K.,1974. Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol.
Biol., 41: 179- 243.
10. Ong K.L, Chang F.N, 1997. Electrophoresis, 18:
834- 839.
11. Schmidt T.M., Bleakley B., Nealson K.N., 1988.
Appl. Environ. Microbiol., 54: 2793- 2797.
12. Trịnh Hồng Thái, Nguyễn Hoài Hà, Phạm Thị Trân
Châu, 1999. Tạp chí sinh học, 21 (1b): 173- 179.
13. Trinh Hong Thai, Boigegrain R.A., Brehelin M.,
2001. J. Genetics and Applications. Specical Issue:
Biotechnology, p. 10- 17.
14. Trịnh Hồng Thái, Trịnh Thị Thanh Hương, Phan Thị
Hà, 2002. Tóm tắt báo cáo. Hội nghị khoa học Khoa Sinh
học, Trường ĐHKHTN, Hà Nội.
15. Wang H., Dowds B.C.A., 1993. J. Bacteriol., 175:

1665- 1673.


SUMMARY

XENORHABDUS SP. CA: CHARACTERIZATION OF
EXTRACELLULAR PROTEINASES FROM
ENTOMOPATHOGENIC BACTERIA

Trinh Hong Thai, Trinh Thi Thanh Huong, Luong
Thuy Duong, Phan Thi Ha

Extracellular proteinases secreted by entomopathogenic
bacteria have been characterized. Their pH optimum was 8.
The proteinases were less stable: activity remained about
15% after incubating at 60
0
C in 10 minutes. Among 8
cations tested (Ca
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
, Cu
2+
, Fe
2+
, Co
2+

, Zn
2+
,
Hg
2+
), the proteinases were strongly inhibited by Hg
2+
, then
by Zn
2+
, Co
2+
and Cu
2+
; on the contrary, Ca
2+
and Mg
2+

increased their activity.
Proteinases were strongly inhibited by EDTA and PMSF.
Some bands of the proteinases were identified in
polyacrylamide gels by incorporating 0.1% gelatin in to
sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel. one
band was inhibited by PMSF, the other band was inhibited
by PMSF and partly by EDTA, especially, a major band
was inhibited by both EDTA and PMSF.