CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH THƯỜNG DÙNG – PHẦN 2 ppsx

CÁC KỸ THUẬT MIỄN DỊCH
THƯỜNG DÙNG – PHẦN 2


Khi một giải M được phát hiện trên điện di protein, mẫu huyết thanh đó cần
phải chạy điện di miễn dịch hoặc làm phản ứng cố định bổ thể để xác định bản
chất của dải. Nguyên tắc của điện di miễn dịch cũng giống như điện di protein
huyết thanh nhưng người ta dùng gel thạch để làm chất nền. Sau khi tách các
thành phần protein huyết thanh bằng điện di, một đường rãnh sẽ được cắt giữa các
lỗ chứa huyết thanh và kháng huyết thanh đặc hiệu được cho vào rãnh này (Hình
12.6); những protein nào có phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu sẽ cho ta
một cung kết tủa. Sau 12-24 giờ, các protein không tủa sẽ được rửa sạch khỏi gel
và các cung tủa được đem nhuộm để dễ thấy và đọc kết qủa. Trong các la-bô miễn
dịch của các bệnh viện hiện nay, người ta thường dùng các huyết thanh đặc hiệu
cho IgG, IgM, IgA hoặc các tiểu lớp của chúng, cho các chuỗi nhẹ kappa và
lambda tự do cũng như cố định trong công tác chẩn đoán. Các immunoglobulin đa
clôn bình thường cho ra những tủa dài, trơn láng khi phản ứng với kháng huyết
thanh đặc hiệu trong phương pháp xét nghiệm này. Một protein đơn clôn thì cho
một cung tủa dứt khoát và gãy gọn hơn.

Hình 12.6. Nguyên lý của điện di miễn dịch. (b là hình phóng đại của a)
Để định tính một giải M người ta có thể cùng phương pháp cố định miễn
dịch (immunofixation). Nhiều mẫu của huyết thanh thử trước hết được cho điện di
trên celluose acetate hoặc gel thạch (Hình 12.7). Sau đó, kháng huyết thanh đặc
hiệu đối với IgG, IgA, IgM hoặc các tiểu lớp của chúng cũng như đối với các
chuỗi kappa và lambda cố định được cho tác dụng với các mẫu nghiệm đã điện di
bằng cách nhúng màng cellulose acetate vào từng loại kháng huyết thanh (đối với
trường hợp điện di trên màng cellulose aceteat) hoặc cho từng loại kháng huyết
thanh phủ lên mặt gel thạch đã điện di (đối với trường hợp đã điện di trên gel
thạch). Sự kết tủa (tức cố định miễn dịch) của protein M sẽ thu được sau khoảng 2
giờ ủ. Còn các protein không được cố định (tức không tạo tủa) sẽ rửa sạch khỏi gel

và các giải tủa được đem nhuộm để đọc. Phương pháp cố định miễn dịch nhạy hơn
và thực hiện nhanh hơn điện di miễn dịch.

Hình 12.7. Định tính một dải M bằng phương pháp cố định miễn dịch.
Trong ví dụ này, dải M được tìm thấy trên giấy cellulose acetate là một Ig thuộc týp k

Trong trường hợp không có bất thường chuỗi nặng, kháng huyết thanh
chuỗi nhẹ tự do (tức không phản ứng với chuỗi nhẹ “cố định” vào chuỗi nặng)
sẽ cho chúng ta biết giải M có phải là của chuỗi nhẹ đơn clôn tự do hay
không. Rất hiếm khi có một giải M phản ứng với kháng huyết thanh đặc hiệu
chuỗi nhẹ “cố định” mà không phản ứng với chuỗi nhẹ “tự do” cùng týp; và
nếu điều đó xảy ra thì dải M là một paraprotein IgD hoặc IgE, bởi vì IgG, IgA
và IgM đã được loại trừ trên gel đầu tiên. Một bất thường xảy ra với chỉ kháng
huyết thanh chuỗi nặng nói lên một bệnh chuỗi nặng hiếm gặp.
Sự tăng cao hàm lượng immunoglobulin huyết thanh buộc chúng ta phải đo
độ quánh huyết thanh tương đối; kỹ thuật này đòi hỏi nhiều thời gian đủ cho một
thể tích huyết thanh đã cho đi qua một ống mao quản, và so sánh với thời gian cho
nước đi qua. Độ quánh huyết thanh tương đối bình thường có trị số từ 1,4 - 1,8.
Triệu chứng lâm sàng của tăng độ quánh xuất hiện khi trị số này vượt quá 4,0.
Nếu như huyết thanh còn mới, sự lắng đọng nhiều protein ở phần gốc điện di
nói lên khả năng hiện diện của cryoglobulin. Cryoglobulin là những
immunoglobulin có thể chuyển thành dạng tủa, dạng gel hoặc kết tinh khi gặp
nhiệt độ lạnh. Độ trầm trọng của triệu chứng, mà chủ yếu là ở da, phụ thuộc vào
nồng độ cryoglobulin và nhiệt độ khi tủa lạnh xuất hiện. Nếu trên lâm sàng có dấu
hiệu nghi ngờ về cryoglobulin, khi lấy máu xét nghiệm cần lấy máu tươi trực tiếp
vào ống tiêm đã làm ấm và chuyển cho phòng xét nghiệm trong nhiệt độ ẩm, mẫu
máu này khi cho đông cũng như khi tách huyết thanh đều phải được tiến hành
37
o
C. Mẫu huyết thanh sau đó được để ở 4

o
C. Tủa sau đó được hòa tan bằng cách
cho làm nóng trở lại 37
o
C và đem xét nghiệm để tìm các thành phần protein cấu
tạo bằng điện di miễn dịch hay cố định miễn dịch.

12.2.2. Nước tiểu
Xét nghiệm nước tiểu là điều cần thiết trong trường hợp bệnh đa u tủy,
trong một số bệnh khác có thấy dải M trong huyết thanh khi điện di, trong
thiếu máu giảm gammaglobulin không rõ nguyên nhân và trong nhiễm tinh
bột.
Sự tổng hợp immunoglobulin bình thường đi kèm với sự sản xuất một lượng
thừa chuỗi nhẹ đa clôn tự do. Các chuỗi nhẹ này được bài tiết ra nước tiểu và
chúng ta có thể phát hiện chúng dưới dạng vết ở tất cả mọi người. Bệnh nhân bị
tổn thương thận thì sẽ tiết một lượng lớn chuỗi nhẹ tự do đa clôn trong nước tiểu.
Chuỗi nhẹ đơn clôn tự do (tức protein Bence Jones) đã được đặt tên của
người đầu tiên mô tả tính chất nhiệt học đặc biệt của nó là kết tủa khi cho hâm
nóng dung dịch lên đến 56
o
C, nhưng nếu cho nóng hơn thì tủa lại tan ra. Tuy
nhiên, phương pháp phát hiện cổ điển này chỉ phát hiện được khoảng 40% chuỗi
nhẹ tự do trong nước tiểu. Cả phương pháp thường qui định lượng protein nước
tiểu toàn phần lẫn thử nghiệm Clinistix đều không thể phát hiện chuỗi nhẹ tự do.
Hiện nay, xét nghiêm thường qui đối với trường hợp nghi ngờ có protein Bence
Jones nước tiểu gồm 3 giai đoạn: (1) cô đặc nước tiểu; (2) điện di cellulose acetate
để tìm sự hiện diện của dải M; và (3) cố định miễn dịch hoặc điện di miễn dịch để
xác nhận dải M được cấu tạo bởi chuỗi nhẹ kappa đơn clôn hoặc chuỗi nhẹ lambda
đơn clôn. Sự bài tiết toàn bộ paraprotein của thận tổn thương có thể cho một kết
quả dương tính giả, do đó chúng ta phải tìm bản chất của chuỗi nhẹ tự do của dãi

M để xác nhận kết quả.

12.2.3. Dịch não tủy
Điện di dịch não tủy là một xét nghiệm có ích đối với chẩn đóan bệnh xơ hóa
nhiều chỗ và các bệnh mất myelin khác. Cũng như trong huyết thanh,
immunoglobulin của dịch não tủy cũng nằm ở vùng gamma. Nhưng ngược với
huyết thanh, IgG thường tạo nên những dải thiểu clôn; có nghĩa là một vài dải rời
rạc chứ không phải là một đám lan toả. Các dải thiểu clôn không thể phát hiện
được bằng điện di thường qui dịch não tủy chưa cô đặc, do đó cần cô đặc dịch não
tủy (80 lần) để có thể cho những dải thấy được. Độ nhạy của phương pháp có thể
được tăng cường bằng cách nhuộm đặc biệt như nhuộm bằng kháng huyết thanh
đánh dấu enzyme hoặc bằng dung dịch có tăng cường bạc. Tuy nhiên, phương
pháp nhạy và đáng tin cậy nhất là điện di dịch não tủy không pha loãng trên gel
acrylamide. Môi trường gel này sẽ tách các protein theo trọng lượng phân tử cũng
như theo điện tích. Sau đó gel được cố định và nhuộm như thông thường. Xét
nghiệm này hiện chưa được dùng rộng rãi.

12.3. Kháng thể đối với kháng nguyên ngoại sinh
Trong nhiễm trùng, đáp ứng miễn dịch đối vi sinh vật có tính chất bảo vệ,
làm cho cơ thể hồi phục sau khi bị nhiễm trùng, đồng thời tính miễn dịch còn giúp
cơ thể chống lại sự tái nhiễm vi sinh vật đó. Tuy nhiên, bên cạnh tác dụng có lợi
đó, một số kháng nguyên vi sinh vật lại có phản ứng chéo với kháng nguyên của
cơ thể người, do đó kháng thể chống các kháng nguyên này có thể phản ứng với tự
kháng nguyên và gây ra bệnh tự miễn. Đáp ứng quá mẫn đối với kháng nguyên
ngoại sinh cũng có thể gây ra tổn thương mô.
12.3.1. Kháng thể chống vi khuẩn
Từ nhiều năm nay, người ta đã dùng phương pháp phát hiện kháng thể chống
vi sinh vật để chẩn đoán nhiễm trùng do vi sinh vật đó gây ra. Sự hiện diện của
kháng thể trong tuần hoàn chỉ chứng tỏ rằng cơ thể đã gặp kháng nguyên trước đó.
Để chẩn đoán một nhiễm trùng cấp, chúng ta phải thấy được có sự gia tăng hiệu

giá của kháng thể ở hai lần lấy máu xét nghiệm cách nhau hai tuần. Nếu cần có kết
quả trả lời ngay, sự hiện diện với hiệu giá cao của kháng thể IgM đặc hiệu chứng
tỏ đang có đáp ứng sơ cấp với vi sinh vật.
Phát hiện kháng thể chống vi khuẩn cũng là một điều cần thiết để khảo sát thiếu
hụt miễn dịch. Khả năng tạo kháng thể của người bệnh là một hướng dẫn tốt cho tính
cảm nhiễm của người đó đối với nhiễm trùng là mức immunoglobulin toàn phần
trong huyết thanh. Kháng thể chống các vi khuẩn chí đường tiêu hóa như E.coli có thể
đo được với hiệu giá cao (<1/32) trên hầu hết người bình thường, còn những người bị
thiếu hụt miễn dịch tiên phát thì không. Nếu bệnh nhân đã được chủng ngừa, việc tìm
kháng thể chống độc tố uốn ván, độc tố bạch hầu và virus bại liệt cũng tỏ ra có ích.
Việc phát hiện kháng thể đối với kháng nguyên liên cầu tỏ ra quan trọng khi khảo sát
các bệnh nhân mắc bệnh do phản ứng miễn dịch sau nhiễm liên cầu.
12.3.2 Kháng thể chống kháng nguyên không sinh sản
Một số kháng thể đối với kháng nguyên không sinh sản có thể gây ra tổn
thương miễn dịch (quá mẫn). Loại xét nghiệm dùng trong trường hợp này phụ
thuộc vào cơ chế tổn thương là tup I qua trung gian IgE, tup III qua trung gian IgM
hay tup III qua trung gian IgG.
Trong hen ngoại sinh hay viêm mũi dị ứng, thử nghiệm bì rất có ích vì: (1)
nó nói lên rằng đây là một phản ứng tup I qua trung gian của IgE; và (2) nó giúp
phát hiện kháng nguyên liên quan. Các xét nghiệm la-bô thường có ích đối với
những bệnh nhân có chống chỉ định đối với thử nghiệm bì, vì có rất nhiều bệnh
nhân dương tính với cả thử nghiệm bì và xét nghiệm la-bô. Thử nghiệm lẩy da
(prick test) là kiểu thử nghiệm trong đó chất đem thử được đưa vào da nhờ một
đầu kim đưa xuyên qua một giọt chất đó trên mặt da và lẩy da lên (Hình 12.8); thử
nghiệm này dễ làm . Thử nghiệm nội bì (intradermal test) gây đau nhiều hơn. Một
điều cần lưu ý hơn khi làm các thử nghiệm này cũng như các thử nghiệm khác là
chất đem thử phải là chất tinh khiết và đang có hoạt tính tốt, khi đó thử nghiệm
mới cho kết quả tốt. Điều này đã gây rắc rối không ít cho thử nghiệm lẩy da trước
đây mặc dù hiện nay đã có sẵn nhiều chế phẩm tương đối tinh khiết của nọc ong,
phấn hoa, bọ bụi, lông thú và một số kháng nguyên thực phẩm như trứng, cá, các

loại hạt vỏ cứng có nhân. Tuy nhiên, sự phân tích kết quả trong lâm sàng cần phải
xem xét đối chiếu với các triệu chứng. Một bệnh nhân atopy thường cho thử
nghiệm lẩy da dương tính với nhiều kháng nguyên, mặc dù chỉ có một loại kháng
nguyên có thể gây ra triệu chứng lâm sàng.
Thử nghiệm kích thích (provocation test), tức thử nghiệm kích thích niêm
mạc mũi hoặc niêm mạc phế quản bằng kháng nguyên, là một thử nghiệm khá phổ
biến. Tuy nhiên, thử nghiệm này khá nguy hiểm nên cần phải được tiến hành trong
bệnh viện bởi những thầy thuốc có kinh nghiệm. Thử nghiệm lẩy da mặc dù an
toàn hơn nhưng cũng không phải là hoàn toàn không gây phản vệ; vì thế mà cũng
nên được tiến hành dưới sự giám sát của thầy thuốc.
Ở các nước phát triển việc định lượng IgE toàn phần trên bệnh nhân nghi
nhiễm ký sinh trùng tỏ ra có lợi. Định lượng IgE toàn phần còn giúp phân biệt cơ
chế bệnh là có hay không vai trò trung gian của IgE. Định lượng IgE thường được
thực hiện bằng phương pháp miễn dịch phóng xạ vì lượng IgE bình thường trong
huyết thanh cực kỳ thấp (120-480 ng/ml). Lượng IgE thường được tính bằng IU
(Đơn vị quốc tế, 1 IU = 2,4 ng IgE). Kỹ thuật đo thường dùng nhất đối với IgE là
“kỹ thuật hấp thụ miễn dịch phóng xạ trên giấy” (paper radioimmunosorbent
technique, PRIST). Thử nghiệm này, mặc dù giá thành hơi đắt, nhưng là một xét
nghiệm nhậy, chính xác và rõ ràng.

Hình 12.8. Các thử nghiệm bì. (a) Thử nghiệm lẩy; (b) Thử nghiệm nội bì.
Kỹ thuật hấp thụ dị ứng phóng xạ (radioallergosorbent technique, RAST)
(Hình 12.9) cho phép chúng ta định lượng được kháng thể IgE đặc hiệu kháng
nguyên. Trong những kỹ thuật này, kháng nguyên được gắn lên những tấm đĩa nhỏ
bằng giấy hoặc lên các hạt không hoà tan; sau đó cho huyết thanh thử vào và chỉ
những kháng thể IgE nào phản ứng với kháng nguyên này mới còn giữ lại sau khi
rửa. Kháng thể IgE đặc hiệu này sẽ được phát hiện bằng kháng thể thứ cấp có đánh
dấu phóng xạ. Kết quả của thử nghiệm RAST hoàn toàn phù hợp với kết quả của
thử nghiệm bì nhưng đắt nên ít được dùng trong trường hợp thử nghiệm bì bị
chống chỉ định hoặc không có lợi. Những bệnh nhân thích hợp cho thử nghiệm

này gồm có trẻ nhỏ bị viêm da nặng, trẻ nhỏ đang dùng các thuốc gây biến đổi
phản ứng da như kháng histamine, người có khả năng bị phản ứng nặng nếu làm
phản ứng bì và một số bệnh nhân dị ứng thức ăn.
Kháng thể kết tủa đối với kháng nguyên đặc hiệu thường là IgM hoặc IgG.
Để chẩn đoán các bệnh viêm phế nang dị ứng ngoại sinh người ta thường dùng xét
nghiệm tìm những kháng thể này. Kỹ thuật kết tủa được làm theo phương pháp
Ouchterlony; đây là một phương pháp kém nhạy nhưng rẻ hơn nhiều so với kỹ
thuật miễn dịch phóng xạ. Chiết xuất của các kháng nguyên nghi ngờ được đặt
trong các lỗ ngoài (Hình 12.10) còn huyết thanh bệnh nhân được cho vào lỗ giữa.
Sau nhiều ngày, tìm xem có tủa xuất hiện không. Hiện nay, trên thị trường người
ta có bán một số kháng nguyên thường dùng, nhưng vẫn chưa có các sản phẩm
tiêu chuẩn. Khi có một chất nghi ngờ là thủ phạm gây ra triệu chứng phổi cho
bệnh nhân, chúng ta có thể dùng chất đó như một kháng nguyên để thử bằng thử
nghiệm kết tủa với huyết thanh bệnh nhân.



Hình 12.9. Nguyên lý của phép đo kháng thể IgE đặc hiệu dị nguyên


Hình 12.10. Phát hiện kháng thể kết tủa trong viêm phế nang dị ứng ngoại sinh.
Bệnh nhân có kháng thể kết tủa chống albumin chim chứng tỏ đang bị bệnh phổi
của người nuôi chim.