Giáo trình : Kỹ thuật nhân giống in vitro part 3 ppsx

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
21
+ Giai đoạn 1: Nuôi cấy để protoplast tái sinh thành (vỏ) tế bào và phân chia
tạo thành cụm nhỏ tế bào (4÷10 tế bào): nuôi cấy trong tối hay trong điều kiện ánh
sáng yếu, trong môi trường lỏng có lắc hoặc bán lỏng. Môi trương cần giàu dinh
dưỡng và áp suất thẩm thấu phù hợp. Nhiều trường hợp cần dùng lớp nuôi trợ
dưỡng.
+ Giai đoạn 2: Nuôi cấy tạo mô sạo ổn định và tái sinh cây hoàn chỉnh: nuôi
cấy trong điều kiện chiếu sáng tốt với quang chu kỳ phù hợp, trên môi trường đặc.
Cần chú ý tới tỷ lệ và hàm lượng Auxin và xytokinin để tái được cây từ callus.
- Có hai con đường phát sinh hình thái trong quá trình hình thành cây hoàn chỉnh
đối với các tế bào có nguồn gốc protoplast:
+ Thông qua quá trình phát sinh cơ quan (organogenesis), ví dụ tế bào
protoplast có nguồn gốc từ mô thịt lá của cây thuốc lá.
+ Thông qua con đường phát sinh phôi soma (somatic embryogenesis), ví dụ
các tế bào protoplast có nguồn gốc từ các tế bào phôi được nuôi cấy dạng huyền phù
một số loài cây thuộc họ hoà thảo.
Nếu đảm bảo được môi trường nuôi cấy phù hợp, thì phôi và các mô phân sinh sẽ
hình thành sau khoảng 3÷5 tuần. Nhưng nếu điều kiện nuôi cấy không tối ưu, các
biến đổi di truyền có thể xảy ra. Ví dụ, trong một số nghiên cứu nuôi cấy protoplast
từ cây khoai tây, tần số cây 2n được tái sinh chỉ khoảng 10%, con lai là cây 4n.



Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
22

Protoplast
t
á
i sinh v
ỏ

t
ế

b
à
o
và phân chia tạo microcallus

Callus ph
á
t tri
ể
n t
ừ

microcallus

Callus tr
ê
n m
ô
i tr
ư
ờ

ng t
á
i sinh

Protoplast

TÕ b
µ
o

M« / khèi m«
Ph¸t sinh chåi / rÔ

H×nh thµnh cÊu tróc ph«i
C
©
y ho
µ
n ch
Ø
nh

Organogenesi
Embryogenes
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
23


* Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của tế bào trần
- Nuôi cấy tế bào trần thường yêu cầu một số thay đổi so với quy trình nuôi cấy

mô bình thường như: sự điều chỉnh nồng độ muối vô cơ, thêm vào các hợp chất hữu
cơ, vitamin, đường để đảm bảo khả năng thẩm thấu và chất điều tiết sinh trưởng để
kích thích sự phân chia tế bào.
+ Ammonium nitrate, Calcium: kích thích sự phân chia tế bào.
+ Bổ sung các thành phần hữu cơ: insitol, nicotinic acid, pyridoxine, thiamin,
glycine, fonic acid và biotin.
+ Casein hydrolysate, D-Ca- pantothenate, choline chloride, cysteine, malic
acid, ascorbic acid, adenine sulfate, riboflavin và glutamine: có tác dụng tăng nhanh
sự tổng hợp vỏ tế bào và kích thích sự phân chia tế bào.
+ Auxin (NAA và 2,4D 0,45÷10,7µM) và Cytokinin (BA, zeatin 2÷5µM;
nước dừa 20÷40ml/l.
+ Đường manitol, sorbitol 0,3÷0,7M; Sucrose và glucose 0,2÷0,6M.
- Điều kiện nuôi cấy
+ Cường độ chiếu sáng: nuôi cấy protoplast trong tối hoặc trong điều kiện ánh
sáng đã lọc bớt.
+ Chất lượng ánh sáng: ánh sáng trắng là tốt nhất, ánh sáng xanh và đỏ gây ức
chế sự hình thành chồi.
+ Nhiệt độ: các protoplast thường được nuôi cấy ở 20÷25
0
C.
* Dung hợp protoplast: có 2 phương pháp
- Dung hợp bằng hoá chất
+ Năm 1972, Calson tái sinh thành công cây thuốc lá từ tế bào protoplast dung
hợp trong môi trường bổ sung NaNO
3
.
+ Năm 1974, Melchers phát hiện ra môi trường dung hợp tế bào trần gồm
50mM Ca
2+
, 0,4M manitol, pH 10,5 tỏ ra thích hợp cho dung hợp tế bào trần nhiều

loài cây trồng khác nhau.
+ Năm 1974, Kao phát hiện ra PEG (polyethylenglycol) có tác dụng làm tăng
hiệu quả dung hợp của protoplast. Khi được ngâm vào dung dịch PEG (20÷40%
w/v), các protoplast kết dính lại với nhau. Sau đó, PEG được rửa bằng dung dịch
Ca
2+
có độ pH cao, màng nguyên sinh chất ở chỗ tiếp xúc sẽ vỡ ra và các protoplast
sẽ dung hợp với nhau. Do PEG độc với tế bào, nồng độ PEG thường được giảm đi
và bổ sung thêm vào đó DMSO (dimethyl sulfuside).
- Dung hợp bằng xung điện: đưa dung dịch hỗn hợp tế bào trần vào một điện
trường, các tế bào trần sẽ lần lượt sắp xếp thành chuỗi giữa hai bản cực. Khi có một
xung điện cao (750÷1000V) trong một thời gian rất ngắn (1÷200 mili giây) vùng tiếp
xúc giữa hai màng tế bào sẽ bị vỡ, hai tế bào trần hoà nhập vào nhau - qua trình
dung hợp sẽ xảy ra.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
24


d. Ứng dụng của protoplast
* Dung hợp protoplast
- Khi các tế bào trần dung hợp với nhau và tạo thành một tế bào lai mang trong
mình vật chất di truyền tất cả các bố mẹ. Các tế bào trần có nguồn gốc từ tế bào
soma nên gọi là lai soma.
- Chọn lọc các thể lai soma
+ Do lai ngẫu nhiên nên có thể
A+B→AB
A+A→AA
B+B→BB
+ Các cách chọn lọc thể lai vô tính
• Phương pháp tế bào học

• Phân tích isoenzym
• Lai ADN, PCR
• Trồng cây tái sinh và đánh giá các đặc điểm nông sinh học…
* Chọn dòng tế bào
- Xử lý đột biến tế bào trần rồi đưa chúng vào tình trạng stress để thanh lọc nhằm
chọn ra các dòng có tính chống chịu với điều kiện bất thuận. Các tế bào sống sót
Xung điện

Hình ảnh dung hợp tế bào trần nhờ xung điện ở cây yến mạch
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
25
trong các test thanh lọc sẽ được tái sinh thành cây để khảo sát tính chống chịu của
chúng.
- Một số hệ thống chọn lọc:
+ Chọn lọc dòng tế bào kháng kháng sinh, các dòng tế bào kháng sâu bệnh,
chịu thuốc trừ cỏ, chịu điều kiện bất thuận, và các dòng tế bào có khả năng sinh
trưởng trên các amono acid đặc thù trong số những acid amin khác.
+ Chọn các dòng tế bào có khả năng sản xuất các hợp chất thứ cấp.
* Biến nạp di truyền
- Nhận biết gen thông qua chức năng sinh học ( tính trạng liên quan đến đặc điểm
hình thái, đặc điểm chức năng…). Xác định điều kiện đặc trưng cho quá trình biểu
hiện và kìm hãm gen.
- Gen gắn với các vectơ: thông thường người ta sử dụng các loại plasmid mang
gen kháng sinh để tiện lợi cho việc chọn lọc sản phẩm biến nạp sau này.
- Chuyển gen vào protoplast: có nhiều phương pháp chuyển gen bằng hoá học,
xung điện, súng bắn gen, thông qua vi khuẩn Agrobacterium.
- Chọn lọc sản phẩm biến nạp.
- Đánh giá kết quả và theo dõi biểu hiện của gen biến nạp.
Protoplast ngay sau khi tách

Tế bào giống, loài A

Tế bào giống ,loài B

Tế bào lai soma mang đặc của cả hai giống, loài A và B
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
26
Câu 7. Trình bày kỹ thuật bảo quản nguồn gen in vitro
o 0 o
a. Mục đích của bảo quản nguồn gen in vitro
Mục đích cơ bản của việc bảo quản nguồn gen thực vật là duy trì sự phong phú đa
dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung để làm cơ sở
cho việc khai thác và sử dụng chúng một cách hợp lý cho hiện tại và trong tương lai.
b. Các phương pháp bảo quản nguồn gen truyền thống
Có 2 phương thức bảo quản nguồn gen cây trồng
- Bảo quản Insitu là bảo quản tại chỗ, cây được duy trì tại điều kiện sinh thái tự
nhiên của chúng.
- Bảo quản Ex-situ là bảo quản các mẫu trong điều kiện nhân tạo tối ưu. Bảo quản
ex xitu đóng vai trò quan trọng trong xây dựng các ngân hàng gen và được sử dụng
rộng rãi cho bất kì loại cây trồng nào.
Những hình thức bảo quản ex xitu khác nhau
+ Bảo quản cây trong vườn ươm tạo thành field bank.
+ Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed bank.
+ Bảo quản in vitro tạo thành in vitro bank.
+ Bảo quản ADN tạo thành DNA bank.
Trong bốn phương thức trên, phương thức bảo quản in vitro có vai trò quan trọng
vì bảo quản trong một không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ một số lượng lớn cá thể,
điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp có hiệu quả đối với các cây

trồng nhân vô tính và hạt cây dễ mất sức nảy mầm ở nhiệt độ và ẩm độ thấp.
c. Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro
Có hai phương pháp bảo quản in vitro: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản
ngừng sinh trưởng tạm thời
- Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểu.
+ Nguyên lý: mẫu được bảo quản trong điều kiện bảo quản sao cho tốc độ
sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểu.
+ Đặc điểm:
• Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển
nhờ ức chế sinh trưởng của mẫu cấy để giảm tới mức tối thiểu chi phí trong quá trình
bảo quản.
• Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng
nhưng với tốc độ rất chậm.
• Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm.
+ Đối tượng: phương pháp này thường áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn
các cây nhân giống in vitro (chuối, dứa, khoai tây, khoai lang…). Mẫu đưa vào bảo
quản thường ở các dạng phôi, chồi, mầm, cây con.
+ Các bước tiến hành:
• Chuẩn bị mẫu: mẫu phải đảm bảo sạch bệnh.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
27
• Đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy có bổ sung các nhân tố nhằm ức chế sinh
trưởng. Các nhân tố gây ức chế sinh trưởng thường dùng là:
Giảm nhiệt độ của phòng nuôi. Với loài cây chịu lạnh nhiệt độ bảo quản từ 0÷5
0
C.
Ví dụ: chồi cây thông và cây táo giữ được 52 tuần ở 2
0
C, khoai tây bảo quản ở
6÷12

0
C có thời gian cấy chuyển là 25÷52 tuần. Những loài cay nhiệt đới thường bảo
quản ở nhiệt độ cao hơn. Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 15
0
C, cọ dầu bảo quản ở
18
0
C.
Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic),
CCC (Clo Cholin Clorit).
Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarose.
Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi…
Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 22
0
C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian
cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 20
0
C trong môi trường có 4%
saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng.
• Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang
môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích
thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mới.
Ví dụ: bảo quản sinh trưởng chậm cây khoai tây
Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần.
Thời gian bảo quản: 2 năm.
Nhiệt độ: 10
0
C.
Thời gian chiếu sáng:16h.
Cường độ chiếu sáng: 1500lux.

Độ ẩm: 60÷70%.
- Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
+ Nguyên lý: bảo quản mẫu bằng cách làm mẫu ngừng sinh trưởng tạm thời.
+ Đặc điểm:
• Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nitơ lỏng,
và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng.
• Có thể bảo quản mẫu được 20÷30 năm hoặc lâu hơn.Trước khi đưa vào bảo
quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫu.
+ Đối tượng: mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi
cấy…
+ Các bước tiến hành:
• Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản.
• Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy: mẫu được xử lý bằng dung
dịch 5÷10% prolin, manitol 3÷6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO
1M+ glycerol 1M+ đường saccarose 2M…
• Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30÷-40
0
C)
• Bảo quản mẫu ở nhiệt độ -196
0
C (trong nitơ lỏng).
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
28
Mẫu sau thời gian bảo quản khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37÷40
0
C. Mẫu sẽ
được phục hồi sinh trưởng và có thể tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
29
Chuyên đề 8. Vì sao có thể chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn

Agrobacterium tumefaciens?
o 0 o

Chuyển gen gián tiếp thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens

Trong thập niên của những năm 1880 mở ra kỷ nguyên của cây trồng chuyển
gen khi con người đã phát hiện ra khả năng chuyển gen của vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens.
A.tumefaciens là loại vi khuẩn gây bệnh khối u ở thực vật sống trong đất,
trong lĩnh vực biến nạp gen nó được sử dụng làm vectơ đặc biệt để chuyển các
gen ngoại lai vào thực vật nhằm tạo ra những thực vật mang gen có các đặc tính
mong muốn.
Đây là phương pháp chủ yếu và thành công nhất trong chuyển gen thực vật:
Đậu tương ; cà chua; khoai tây; bông…. Phương pháp này dựa trên cơ chế gây u
vết thương của A.tumefaciens. Khi cây bị thương, vi khuẩn này đã nhập vào chỗ
bị thương và gây u.
Tiến hành phân tích thành phần các chất trong khối u thì thấy có nhiều hợp
chất lạ. Phân tích hoá sinh các hợp chất lạ thì phát hiện ra đó là các phức hợp axit
amin arginin-xetoaxit, những hợp chất đó không có ở thực vật, vi khuẩn đã sử
dụng những hợp chất đó trong quá trình đồng hoá. Như vậy vi khuẩn đã chuyển
vào trong tế bào thực vật tác nhân gây u và những tác nhân đó tổng hợp lên
những hợp chất mới. Nhờ những thành tựu của kỹ thuật ADN tái tổ hợp, những
phương pháp nghiên cứu mới về ADN, người ta đã làm sang tỏ cơ chế gây bệnh
của vi sinh vật đất.

Hiện nay có rất nhiều kỹ thuật chuyển gen khác nhau vào tế bào song kỹ thuật
chuyển gen bằng vi khuẩn Agrobacterium tumerfacien vẫn được ứng dụng rộng
rãi là nhờ những ưu điểm sau:
1. Không đòi hỏi dụng cụ đặc biệt

2. Số lượng bản copy thấp và ổn định ở thế hệ con cháu
3. Dễ thao tác invitro, dễ làm
4. Đây là kỹ thuật đơn giản, chi phí thấp

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
30
1. Hoạt động của Agrobacterium tumefaciens
Bản chất tự nhiên của vi khuẩn A.tumefaciens là xâm nhập vào những vị trí
tổn thương trên cây hai lá mầm và gây ra khối u tại những vị trí tổn thương đó.
Những chất được tổng hợp và bài tiết ra từ tế bào khối u, được vi khuẩn sử dụng
làm nguồn cácbon và nitơ duy trì sự tồn tại và phát triển của chúng. Bệnh khối u
do vi khuẩn A.tumefaciens gây ra được phát hiện cách đây khoảng một thế kỷ và
suốt thời gian dài, nhiều nghiên cứu tập trung khám phá nhằm tìm ra cơ chế gây
“ung thư” của chúng với mục đích dựa vào đó có thể tìm ra những phương sách
chữa bệnh ung thư ở người cũng như ở động vật. Những ý tưởng đó đã bất thành
và một loạt các nghiên cứu cũng bị dừng lại khi cơ chế gây khối u ở thực vật
được khám phá chính là kết quả của quá trình chuyển gen từ vi khuẩn vào thực
vật. Tuy nhiên, sự khám phá và hiểu biết về cơ chế gây khối u đó đã mở ra một
hướng chuyển gen mới mà ở đó con người đã lợi dụng vi khuẩn để chuyển những
gen mong muốn vào thực vật.
Vi khuẩn xâm nhiễm vào chỗ vết thương, kích thích hình thành các chất độc
có bản chất phenolic (Acetosyringon, Hydroxyl acetosyringon). Chất này có tác
dụng làm lành vết thương, vừa là kết hợp chất dẫn dụ vi khuẩn xâm nhập , lại có
vai trò như một chất kích hoạt vùng gen vir thuộc Ti-plasmid kích thích cho sự
cắt đoạn T-ADN (tại vùng bờ trái và bờ phải) để gắn vào genom thực vật.
Trong T-ADN có chứa 3 vùng gen quan trọng quy định sự hình thành khối u.
Đó chính là vùng gen iaam và iaah kích thích cho sự hình thành IAA và vùng
gen ipt kích thích cho sự hình thành xytokinin. Tỷ lệ auxin/xytokinin kích thích
sự hình thành callus tạo lên các khối u.

2. Đặc diểm cấu trúc của Agrobacterium tumefaciens Ti plasmid

Agrobacterium là các vi khuẩn đất nhuộm gram (-) gây ra các triệu chứng
bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương. Trong chi Agrobacterium gồm các
loài chính sau:
A. tumefaciens

gây b
ệnh u s
ùi thân.

A. rhisogenes
gây b
ệnh tóc rễ.

A. rubi

gây u
ở các loại dâu đất, mâm sôi.