Giáo trình : Kỹ thuật nhân giống in vitro part 1 pptx

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
1

Chuyên đề 3. Trình bày kỹ thuật nhân giống in vitro
o 0 o

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy
nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môi trường dinh dưỡng
nhân tạo, trong điều kiện vô trùng.
Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một
lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trông công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật.
Bao gồm:
+ Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành
+ Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh.
+ Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành
+ Nuôi cấy mô sẹo (callus)
+ Nuôi cấy tế bào đơn
+ Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trông tế bào thực vật sâu khi
đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần
Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện trong phòng thí nghiệm
nên còn gọi là phương pháp nhân giống trong ống nghiệm
(in vitro) để phân biệt với các quá trình nuôi cấy trong điều kiện tự nhiên ngoài ống
nghiệm (in vivo).
Khác vối các phương pháp nhân giống truyền thống như giâm, chiết cành hoặc
ghép mắt, phương pháp nhân giống in vitro có khả năng trong một thời gian ngắn có
thể tạo ra một số lượng cây lớn đều để phủ kín một diện tích đất nhất định mà các
phương pháp nhân giống khác không thể thay thế được. Ngoài ra phương pháp này
không phụ thuộc vào điều kiện tự nhiên nên có thể tiến hành quanh năm. Đây là
hướng đang được ứng dụng rộng rãi. Ở Việt Nam hiện nay có nhiều phòng thí
nghiệm nuôi cấy mô, nhiều trung tâm sản xuất giống cây trồng hàng năm đã cung
cấp một lượng đáng kể cây giống có chất lượng cao cho sản xuất như chuối, dứa,

khoai tây, các loại lan, cây cảnh, cây lâm nghiệp.
*Cơ sở khoa học
Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (tissue culture) nói chung và kỹ thuật nhân giống vô
tính nói riêng đều dựa vào cơ sở khoa học là tính toàn năng, sự phân hoá và phản
phân hoá.
- Tính toàn năng của tế bào:
Haberland (1902) lần đầu tiên đã quan niệm rằng mỗi một tế bào bất kỳ của một
cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cơ thể hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào đã chuyên hoá đều chứa
một lượng thông tin di truyền (bộ ADN) tương đương với lượng thông tin di truyền
của một cơ thể trưởng thành. Vì vậy, trong điều kiện nhất định một tế bào bất kỳ đều
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
2
có thể phát triển thành cơ thể hoàn chỉnh. Đặc tính đó của tế bào gọi là tính toàn
năng của tế bào. Qua đó người ta có thể biến một tế bào bất kỳ (hoặc một mẩu mô)
thành một cơ thể hoàn chỉnh khi được nuôi cấy trong một môi trường thích hợp có
đầy đủ các điều kiện cần thiết cho tế bào thực hiện các quá trình phân hoá, phản
phân hoá.
- Tính phân hoá và phản phân hoá của tế bào
+ Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế
bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chực năng khác nhau. Trong cơ thể thực
vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu,
mô dẫn, mô bì, mô khuyết…) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào môi sinh đã
trải qua giai đoạn phân hoá tế bào để hình thành các mô riêng biệt.
+ Tính phản phân hoá của tế bào: dó là các tế bào khi đã được phân hoá thành
các mô riêng biệt với các chức năng khác nhau nhưng trong điều kiện nhất định
chúng vẫn có thể quay trở về trạng thái phôi sinh để phân chia tế bào.
Trong kỹ thuật nuôi cấy các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân…thì giai đoạn tạo
mô sẹo chính là khi tế bào quay trở về trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia
liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân… trước đó.

Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được
biểu diễn theo sơ đồ sau:

Phân hoá tế bào
Tế bào phôi sinh Tế bào chuyên hoá
Phản phân hoá tế bào

Về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một
thời điểm nào đó trong quá trình phát triển các thể thì một số gen được hoạt hoá và
một số gen khác bị ức chế. Điều này được xảy ra theo một chương trình đã được mã
hoá trong cấu trúc phân tử ADN. Khi nằm trong một cơ thể hoàn chỉnh giữa các tế
bào có sự ức chế lẫn nhau, nhưng khi được tách rời và trong những điều kiện nhất
định thì các gen được hoạt hoá dễ dàng hơn nên chúng có khả năng mở tất cả các
gen để hình thành một các thể mới. Đó chính là cơ sở làm nền tảng cho kỹ thuật nuôi
cấy mô tế bào.
*Các ứng dụng
Đây là lĩnh vực mà nuôi cấy mô và tế bào thực vật đã mang lại hiệu quả kinh tế to
lớn thực sự. Một trong những ưu việt của phương pháp nhân giống in vitro là việc sử
dụng các mô nuôi cấy ở kích thước nhỏ. Ở kích thước nhỏ, sự tương tác giữa các tế
bào trong mô sẽ đơn giản hơn. Tác động của các phương pháp sẽ hiệu quả hơn. Mô
nuôi cáy dễ phân hoá và sau đó dễ tái sinh hơn.
Kỹ thuật nhân nhanh in vitro có những ưu việt mà các phương pháp khác không có
được đó là: có thể nhân giống cây trồng ở quy mô công nghiệp (kể cả trên các đối
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
3
tượng khó nhân bằng phương pháp thông thường), phương pháp có hệ số nhân rất
cao và cho ra các cá thể hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền.
Ứng dụng:
- Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quý hiếm làm vật liệu cho công tác chọn tạo
giống.

- Nhân nhanh và duy trì các cá thể đầu dòng tốt để cung cấp cây giống của các loại
cây trống khác nhau.
+ Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt
+ Duy trì và nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt giống cây
rau, cây hoa các loại cây trồng khác.
+ Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus
+ Bảo quản các tạp đoàn gen, đặc biệt với loại cây dễ bị nhiếm bệnh trong
điều kiện tự nhiên, hoặccác cây dễ bị giao phấn.
Với phương pháp này nhiều giống cây hoa (hoa lan, cẩm chướng, đồng tiền,
cúc…), cây lương thực thực phẩm (khoai tây, súp lơ, măng tây, cọ dầu, mía, cà
phê…), cây ăn quả (chuối, dứa, dâu tây…), cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai, dứa
sợi…) đã được phổ biến nhanh vào trong sản xuất.
*Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp
với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm giảm
tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các
yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào
mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần chọn
đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi ngọn, đỉnh
chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)

Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt được
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
4
tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-10 phút,
NaOCl hoặc Ca(OCl)
2
5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung dịch Br…
Một số dạng môi trường dinh dưỡng phổ biến:
Muối khoáng: theo White (1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962)
Chất hữu cơ: đường sarcaroza
Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit
Hoocmon: auxin (IAA, IBA, NAA…), Xytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin
(GA3)
Bước 3: nhân nhanh
Mục đích cảu giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và tăng nhanh số
lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong một thời gian nhất định thông qua các con
đường: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo phôi vô tính.
Vật liệu khởi đầu in vitro được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung
chất điều tiết sinh trưởngnhóm xytokinin để tái sinh tù một chồi thành nhiều chồi.
Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong một ống nghiệm. Vấn đề là
phải xác định được môi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp để có hiệu quả cao
nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25-27

0
C và 16 giờ chiếu sáng/ngày, cường độ ánh
sáng 2000-4000 lux, ánh sáng tím là thành phần quan trọng để kích thích phân hoá
chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi đối tượng nuôi cấy đòi hỏi chế độ
nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ngày, nhân
phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần che tối…
Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh
Kết thúc giai đoạn nhân nhanh cây chúng ta có được một số lượng chồi lớn nhưng
chưa hình thành cây hoàn chỉnh vì chưa có bộ rễ. Vì vậy, cần chuyển từ môi trường
nhân nhanh sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy chuyển vào môi trường
nuôi cấy có bổ sung chất điều tiết sinh trưởng nhóm auxin. Mỗi chồi khi ra rễ là
thành một cây hoàn chỉnh. Một số loại cây có thể phát sinh rễ ngay sau khi chuyển
từ môi trường nhân nhanh giàu xytokinin sang môi trường không chứa chất điều tiết
sinh trưởng. Đối với các phôi vô tính chỉ cần cấy chúng trên môi trường không có
chất điều tiết sinh trưởng hoặc môi trường có chứa xytokinin nồng độ thấp thì phôi
phát triển thành cây hoàn chỉnh.
Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên
Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây…)
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi
với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều
kiênj tự nhiên, mở nắp bình nuôi…
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
5
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoat nước. Phải
chủ động điều chỉnh được độ ẩm, sự chiếu sánh của vườn ươm cũng như có chế độ
dinh dưỡng thích hợp.

* Các phương pháp nhân giống in vitro
Tất cả các phương pháp nhân giống in vitro đều có các ưu, nhược điểm sau:
* Ưu điểm
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành được số lượng cây
giống từ một mô, cơ quan của cây với một kích thước nhỏ khoảng 0.1-10mm. Trong
khi đó phương pháp nhân giống truyền thống thì để tạo thành cây giống, ít nhất phải
sử dụng một phần cơ quan dinh dưỡng của cây với kích thước từ 5-20cm.
- Hoàn toàn tiến hành trong điều kiện vô trùng nên cây giống tạo đựoc sẽ không bị
nhiễm bệnh từ môi trường bên ngoài
- Sử dụng vật liệu sạch virus và có khả năng nhân nhanh số lượng cây giống sạch
virus
- Hoàn toàn chủ động điều chỉnh các tác nhân, điều chỉnh khả năng tái sinh của
cây như thành phần dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều tiết sinh trưởng… theo
ý muốn
- Hệ số nhân giống cao nên có thể sản xuất số lượng cây giống trong một thời gian
ngắn. Hệ số nhân giống ở các loại cây nằm trong khoảng 3
6
-10
12
/năm, như vậy
không có một kỹ thuật nhân giống vô tính nào khác lại có hệ số nhân giống cao hơn.
- Có thể tiến hành quanh năm mà không chịu chi phối của điều kiện ngoại cảnh
của thời vụ.
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
6
- Cây giống in vitro nếu chưa có nhu cầu sử dụng thì có thể bảo quản được trong
thời gian dài ở điều kiện in vitro
* Nhược điểm

- Mặc dù có hệ số nhân giống lớn nhưng cây giống tạo ra cí kích thước nhỏ và đôi
khi xuất hiện những dạng cây không mong muốn
- Cây giống in vitro được cung cấp nguồn hydrat cacbon nhân tạo nên khả năng tự
tổng hợp các hợp chất hữu cơ của cây kém. Đồng thời cây giống in vitro được nuôi
dưỡng trong bình thuỷ tinh hoặc bình nhựa nên đọ ẩm không khí thường bão hoà.
Do đó khi trồng ra điều kiện tự nhiên cây thường bi mất cân bằng nước, gây hiện
tượng cây bị héo và chết. Vì vậy trước khi chuyển cây từ điều kiện in vitro ra điều
kiện in vivo cần phải trải qua giai đoạn huấn luyện để cây quen dần với điều kiện
bên ngoài có độ ẩm không khí thấp và ánh sáng mạnh.
- Cần trang thiết bị hiện đại, kỹ thuật viên có tay nghề cao.
- Những vấn đề tồn tại trong vi nhân giống
+ Tính bất định về mặt di truyền
+ Sự nhiễm mẫu
+ Việc sản sinh các hợp chất độc từ mô nuôi cấy
+ Hiện tượng thuỷ tinh hoá
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
7
Chuyên đề 4:
Vì sao có thể nuôi cấy mô phân sinh (meristem) để tạo ra cây sạch virus?
Các bước và điều kiện cần thiết của một hệ thống sản xuất giống sạch bệnh?
o 0 o

* Tác hại của virus:
Trong thế giới các loài sinh vật thì thế giới của các loài vi sinh vật vô cùng đa dạng
và phức tạp mà đến nay vẫn còn rất nhiều loài mà con người vẫn chưa biết đến.
Người ta thường phân vi sinh vật thành 2 loại là vi sinh vật có tác dụng tốt cho con
người và vi sinh vật có hại cho con người. Trong thế giới vi sinh vật ấy thì virus là
một loại rất nguy hiểm. Đối với cả con người và các loài động thực vật khác khi đã
nhiễm bệnh virus thì không có một loại thuốc nào có thể chữa được, mà chỉ phụ
thuộc vào khả năng đề kháng của cơ thể. Vì vậy, để đề phòng và chống lại tác hại

của virus người ta đã tạo ra các loại vacxin và thuốc kháng sinh nhằm tăng cường
sức đề kháng cho cơ thể.
Phổ tác động của virus là rất lớn. Nó không những tác động đến con người, động
thực vật, thậm chí cả những loài vi sinh vật khác. Trong nông học, chúng ta quan
tâm chủ yếu đến thực vật vì đây là đối tượng chủ yếu trong sản xuất nông nghiệp.
Theo thống kê, có khoảng 600 loài virus trên thực vật mà con người đã biết đến,
trong đó có ít nhất 80 loại có thể truyền qua hạt giống. Bệnh virus hại thực vật là
một loại bệnh nguy hiểm, dễ lan truyền qua nhân giống vô tính (do tồn tại trong các
mô sống), qua mô giới truyền bệnh (các loại côn trùng như rệp, bọ phấn, nhện, v.v.),
qua tiếp xúc cơ giới (vết cắt, xây xát, v.v.).
Tác hại của virus là vô cùng lớn. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới năng suất và phẩm
chất của nông sản.


Côn trùng Biểu hiện một số bệnh virus
truyền bệnh
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
8
* Cơ sở lý luận của phương pháp:
Virus tồn tại ở mọi cơ thể sống. Theo White (1934), Limasset & Cornuet (1950),
Morel & Martin (1952): nồng độ virus ở mô phân sinh đỉnh rễ, đỉnh chồi và lá bao
thứ nhất là bằng không sau đó tăng dần ở các lá xa với mô phân sinh ở phía dưới.
Như vậy, có thể sử dụng mô phân sinh đỉnh để tạo ra cây sạch virus hoàn toàn từ cây
đã nhiễm bệnh.
Gần đây, vào năm 1987 bằng những nghiên cứu của mình, ông Meyer cho thấy
phương pháp nuôi cấy meristem để loại virus là hoàn toàn đúng đắn. Sự loại virus
phụ thuộc rất nhiều sự có mặt của một hay nhiều loại virus xâm nhiễm. Ví dụ có thể
sử dụng đỉnh sinh trưởng với kích thước 1-2mm để loại virus chủ yếu hại khoai tây
(trừ virus X đòi hỏi kích thước 0,2mm).
Theo nghiên cứu của Mathews (1970) & Wang et Hu (1980) thì hoàn toàn có cơ sở

khẳng định mô phân sinh đỉnh không có virus. Theo các ông có thể do các lý do sau:
- Virus vận chuyển trong cây nhờ hệ mô dẫn, hệ thống này không có trong mô
phân sinh đỉnh.
- Trong sự phân chia, các tế bào mô phân sinh đỉnh không cho phép sao chép các
thông tin di truyền của virus.
- Hệ thống vô hiệu hóa virus ở vùng mô phân sinh đỉnh mạnh hơn các vùng khác
trong cây.
- Nồng độ auxin cao ở mô phân sinh đỉnh có thể ngăn cản quá trình sao chép
virus.

* Kỹ thuật làm sạch virus in vitro:
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh: tách chính xác mô phân sinh đỉnh có kích thước
<0,3mm, nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng phù hợp để tái sinh thành cây
nguyên vẹn. Sau đó kiểm tra độ sạch virus ở cây tái sinh bằng các phương pháp khác
nhau để thu nhận cây sạch bệnh.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý nhiệt độ cao: ở nhiệt độ cao 36-37
0
C
thì một số loài virus không còn khả năng nhân lên. Lợi dụng đặc tính này có thể kết
hợp phương pháp nuôi cấy mô phân sinh đỉnh với xử lý nhiệt để tẩy sạch virus khỏi
mẫu. Biện pháp này cho phép có thể tách meristem ở kích thước lớn hơn (0,5-
Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp
9
1,0mm) giúp cho việc tách và tái sinh cây thuận lợi hơn so với phương pháp tách ở
kích thước 0,1-0,2mm.
Có thể xử lý nhiệt độ cao 35-37
0
C một thời gian dài cho cây mẹ trước khi tách mô
phân sinh đỉnh (5-10 tuần). Hoặc có thể xử lý các mẫu sau khi đưa vào nuôi cấy in
vitro ở nhiệt độ 39-40

0
C trong 1-2 tuần. Ở nhiệt độ này, thường các mARN của virus
sẽ bị phân giải và cây tái sinh sẽ có độ sạch virus cao.
- Nuôi cấy mô phân sinh đỉnh kết hợp xử lý hóa chất: Khi nuôi cấy mô phân sinh
đỉnh có kích thước 0,5-1,0mm có thể kết hợp bổ sung vào môi trường nuôi cấy các
chất kháng virus để tạo cây sạch bệnh. Các chất kháng virus như 2-thiouracil,
ribavirin, vidarabin làm tăng kháng của tế bào, mô thực vật và ức chế sự nhân bản
của virus.
- Vi ghép: Là kỹ thuật ghép các mô phân sinh đỉnh lên gốc cây sạch và kháng bệnh
trong điều kiện in vitro để sản xuất cây sạch virus. Kỹ thuật này thường sử dụng với
cây thân gỗ, đặc biệt họ cam chanh.
Một số ứng dụng kỹ thuật làm sạch virus:
 Kỹ thuật tạo củ khoai tây bằng phương pháp in vitro: Một hiện trạng sản xuất
khoai tây là rất dễ bị nhiễm virus do quá trình nhân giống vô tính. Vì vậy cần tạo ra
các giống khoai tây sạch bệnh virus. Đó là lý do mà ngày nay khoai tây được nhân
giống bằng phương pháp in vitro khá phổ biến. Để nhân giống in vitro khoai tây cần
thực hiện các bước sau đây:
+ Bước 1: Chọn cây giống đủ tiêu chuẩn. Cây đủ tiêu chuẩn lấy mẫu cso chiều
cao 7-10cm, có từ 8-10 lá, cây phải sinh trưởng khỏe, thân mập. Thông thường nuôi
cấy 8-10 cây trong bình 250ml.
+ Bước 2: Rót môi trường tạo củ vào các bình 250ml đã chọn. Môi trường tạo củ
gồm MS và 12% saccarose. Lượng môi trường cho mỗi bình là 50-70ml.
+ Bước 3: Tiến hành nuôi cây giống trong điếu kiện tối hoàn toàn ở nhiệt độ
20-22
0
C.
+ Bước 4: Sau 2 tháng cây đã hình thành củ. Lúc này tiến hành thu hoạch củ in
vitrro. Như vậy, đã tạo được củ sạch bệnh virus.

Líp C©y trång 49C - Nhãm 4 C«ng nghÖ sinh häc n«ng nghiÖp

10

Cây sau khi nuôi cấy Cây khi hình thành củ

 Nhân giống in vitro hoa đồng tiền: Các bước thực hiện như sau:
+ Bước 1: Khử trùng mẫu. Mẫu lấy là các nụ hoa bình thường. Nụ hoa được lấy
về sau đó khử trùng bằng HgCl
2
nồng độ 0,1% trong 7 phút.
+ Bước 2: Cắt nụ hoa thành các lát mỏng. Dùng các lát mỏng này để tạo thể tiền
chồi bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo (MS, 1ppmBA, 0,2ppm Ki,
0,2pp IAA).
+ Bước 3: Nhân nhanh chồi mầm. Tách thể tiền chồi và nuôi cấy trong môi
trường nhân tạo (MS, 1ppm Ki).
+ Bước 4: Tạo cây hoàn chỉnh. Sau nhân nhanh tách cây và nuôi trong môi
trường nhân tạo (MS, 0,1ppm α-NAA).
+ Bước 5: Sau tạo cây hoàn chỉnh thì đưa cây con ra vườn thích nghi. Cây con
được trồng trong giá thể (1 trấu hun + 1 mùn) và đảm bảo những điều kiện tốt nhất
cho cây con phát triển. Sau đó cây con được đưa ra vườn sản xuất. Tiến hành chăm
sóc bình thường.