Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƯỞI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ part 2 pptx

6




nhiều nƣớc và đã phát triển thành dịch ở khắp vùng châu Á nhiệt đới-Thái Bình
Dƣơng. Bệnh còn thấy ở các nƣớc châu Mỹ, châu Phi. Ở nƣớc ta bệnh hầu nhƣ phá hại
ở tất cả các vùng trồng cam quýt, gây thiệt hại đáng kể làm ảnh hƣởng tới nguồn hàng
xuất khẩu và tiêu dùng trong nƣớc.
Bệnh thƣờng bắt đầu xuất hiện ở lá non. Ban đầu vết bệnh là những chấm nhỏ
có đƣờng kính dƣới 1mm màu trắng vàng thƣờng thấy ở mặt dƣới lá. Sau đó vết bệnh
mở rộng hơn phá vỡ biểu bì mặt dƣới lá. Xung quanh vết bệnh có vầng tròn dạng giọt
dầu màu nâu hoặc xanh tối. Sau 2-3 tuần vết bệnh phát triển thành loét hình tròn màu
nâu xám. Khi vết loét già hóa gỗ rắn lại hình dạng vẫn còn hoặc không định hình. Trên
cây bƣởi vết bệnh khoảng 8mm.







Ở quả vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá.Vết bệnh rắn xù xì màu nâu ở giữa lõm,
mép ngoài nổi gờ lên, ở giữa vết bệnh mô chết rạn nứt. Toàn thể chiều dày của vỏ quả
có thể bị loét nhƣng không bao giờ vết loét ăn sâu vào ruột quả, bệnh nặng có thể làm
cho quả biến dạng ít nhiều.

Hình 2.1 Triệu chứng bệnh loét
trên lá bƣởi Da Láng

Hình 2.2 Triệu chứng bệnh loét
trên trái bƣởi Da Láng


7




Ở cành vết bệnh cũng tƣơng tự nhƣ ở lá nhƣng sùi lên tƣơng đối rõ ràng, ở giữa
vết bệnh không lõm xuống hoặc lõm xuống không rõ rệt. Vết bệnh còn xuất hiện ở gai
cũng giống nhƣ ở cành cây.







.
2.2.2. Đặc điểm gây bệnh của chủng vi sinh vật gây bệnh (X. a. pv. citri)
Vi khuẩn có hình gậy ngắn, kích thƣớc khoảng 1,5-2 x 0,5-0,75µm, hai đầu tròn
có một lông roi ở đầu, có thể nối liền thành chuỗi, có vỏ nhờn nhuộm gram âm, háo
khí. Độ dài genome khoảng 5 Mbp. Sinh trƣởng dễ dàng trên môi trƣờng agar –
glucose –peptone, khuẩn lạc hình tròn, sáng, bóng, màu vàng sáp.
Đặc trƣng để phân biệt vi khuẩn Xanthomonas sp. với loại vi khuẩn màu vàng khác

là nó có thể sinh trƣởng thành khuẩn lạc màu vàng sáp trên miếng lát cắt củ khoai tây.
Phạm vi nhiệt độ phát triển là 5-35
o
C, thích hợp 20-30
o
C. Ở nhiệt độ 52
o
C
trong10 phút vi khuẩn chết. Vi khuẩn phát triển và hoạt động trong phạm vi pH 6,1-
8,8, thích hợp ở pH 6,6. Vi khuẩn có khả năng chịu hạn ở nhiệt cao, trong điều kiện
phòng thí nghiệm có thể tồn tại 130 ngày. Bệnh loét cam, bƣởi là bệnh hại có tính
nhiệt đới, vi khuẩn gây bệnh phát triển thích hợp trong điều kiện nhiệt độ cao, ẩm ƣớt,
sức chống hạn và lạnh cao. Vi khuẩn tồn tại trong vết lá, cành bệnh từ năm này qua
năm khác.
Theo Wolf (1916) vi khuẩn bệnh loét cam có thể tồn tại qua đông trong đất,
nhƣng Pltier và Frederich lại cho rằng vi khuẩn không thể tồn tại qua đông ở trong đất
hoặc trong lá rụng. Lee (1920) và Fulton (1925) cho rằng vi khuẩn bệnh loét cam
không đấu tranh đƣợc với tập đoàn vi khuẩn khác nên dễ dàng chết trong đất. Loucks
Hình 2.3 Triệu chứng bệnh loét
trên cành bƣởi Da Láng


8




(1930) đã chứng minh rằng vi khuẩn ở trong đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 6-13
ngày nhƣng trong đất vô trùng có thể tồn tại đƣợc 150 ngày. Theo Rao và Hingorant ở
đất vô trùng, vi khuẩn sống đƣợc 52 ngày còn ở đất không vô trùng chỉ sống đƣợc 17

ngày. Cũng từ hai tác giả trên thời gian sống của vi khuẩn ở những lá cây chết rụng
xuống đất khoảng 6 tháng. (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Vào mùa mƣa trời ẩm ƣớt vi khuẩn từ trong vết bệnh cũ hoạt động, truyền
lan đi trong mƣa, gió hoặc côn trùng, chim. Vi khuẩn cũng có thể truyền dễ dàng
qua quần áo, nông cụ. Vi khuẩn rơi trên quả, lá, cành sẽ xâm nhập qua vết thƣơng,
khí khổng.
Đặc điểm xâm nhiễm gây bệnh: bệnh phát sinh do 3 yếu tố cơ bản tác động lẫn
nhau quyết định là “cây ký chủ- vi khuẩn gây bệnh-điều kiện ngoại cảnh môi trƣờng”
(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999).
Dựa triệu chứng bệnh và sự biến chủng của vi khuẩn có các loại bệnh loét sau:
- Loại Asiatic (Canker A), do Xanthomonas axonopodis pv.citri, bắt nguồn từ
châu Á, phân bố rộng, khả năng gây bệnh rất mạnh.
- Loại B, do Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii , bắt nguồn từ Nam Mỹ,
gây bệnh chủ yếu trên chanh nhỏ, cam chua, bƣởi.
- Loại C, cũng do Xanthomonasdis axonopodis pv. aurantifolii nhƣng gây bệnh
trên chanh nhỏ và cam chua.
- Loại A* đƣợc phát hiện ở Oman, Saudi Arabia, Iran và Idian chỉ gây bệnh trên
chanh. (
2.3. Sơ lƣợc vùng rDNA-ITS
2.3.1. Giới thiệu vùng rDNA
Những gen mã hóa rRNA đƣợc tìm thấy trong vùng rDNA. Sản phẩm của
những gen này (rRNA) kết hợp với những phân tử protein hình thành những ribosom
có chức năng tổng hợp protein. Gen rDNA 16S mã hóa một phân tử RNA hình thành
tiểu đơn vị ribosom nhỏ của vi khuẩn điển hình (thành phần protein của tế bào). Trình
tự của gen này thích hợp là một mô hình phổ biến để nghiên cứu sự tiến hóa và phân
loại vi khuẩn. Gene rDNA đƣợc tìm thấy ở hầu hết các dạng sống (ngoại trừ virus và
9

prion). Các thành phần của trình tự rDNA từ những sinh vật có quan hệ với nhau đƣợc
đánh dấu giống nhau. Điều này có nghĩa, trình tự của những sinh vật thân cận đã đƣợc
sắp xếp chính xác, làm cho những khác biệt dễ dàng để đánh giá. Điều đó cũng có
nghĩa là chỉ một vài nhóm primer PCR là cần thiết để khuếch đại gene rDNA từ bất cứ
loài vi khuẩn nào. Trình tự của rDNA 16S đã đƣợc xác định cho nhiều loài. Sự thật,
không có bất kỳ gen nào khác đặc trƣng cho nhiều loài nhƣ vậy.
Chiều dài và trình tự của những vùng ITS của rDNA đƣợc cho rằng là vùng tiến
hóa nhanh nhất và vì vậy có thể rất biến đổi. Những universal primer đƣợc thiết kế từ
những vùng bảo tồn nằm hai đầu vùng ITS và vùng ITS có kích thƣớc nhỏ (600 – 700
bp) dễ dàng đƣợc khuếch đại bởi vì số bản sao lớn (lên tới 30000 bản trong mỗi tế bào
(Dubouzet and Shinoda, 1999) của vùng lặp lại trên rDNA. Điều này làm cho vùng
ITS trở thành một đề tài đƣợc quan tâm cho việc nghiên cứu về sự tiến hóa và phát
sinh loài (Baldwin và ctv., 1995; Hershkovitz và ctv., 1996, 1999) cũng nhƣ các
nghiên cứu về địa lý sinh vật (biogeographic) (Baldwin, 1993; Suh và ctv., 1993;
Hsiao và ctv., 1994; Dubouzet và Shinoda, 1999). (Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005).
2.3.2. Vùng rDNA-ITS trên Xanthomonas ssp.
Phân tích mối quan hệ loài dựa trên vùng 16s-23s rDNA bằng cách thiết kế
cặp primer Xan1330 và Xan332 dựa trên vùng gen 16s-23s rDNA ở Xanthomonas
sp. Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1 kb và đƣợc xác định là
Xanthomonas sp. (Edmilson R Gonealves và Yoko. B. Rosato, 2002). (Hình 2.3,
Hình 2.4)
2.4. Sơ lƣợc về hrpW gen
Sự tƣơng tác giữa ký sinh với ký chủ phụ thuộc vào hệ thống protein . Đặc biệt
đối với tƣơng tác vi khuẩn gram âm gây bệnh thực vật với cây ký chủ. Loại protein
này đƣợc mã hóa bởi hrp gen. Trên Xanthomonas axonopodis pv.citri ngƣời ta xác
định các loại hrp gen: hrpG, hpaA, hpaB, hrcV, hrpB1, hrpD6, hrpB2, hrcU, hrcW,
hrpB4, hrcN. Trên X. a. pv.citri các hrp gen này nằm thành cụm trừ hrpW. (Marcos
C. Alergria và ctv, 2004). Dựa vào đặc tính của hrp gen là đặc trƣng cho từng loài gây
bệnh nên ngƣời ta thiết kế primer chuyên biệt cho phản ứng PCR phát hiện nhanh,

10




chính xác loài gây bệnh. Phƣơng pháp phát hiện nhanh bằng primer chuyên biệt này
nhanh, chính xác hơn các phƣơng pháp nuôi cấy.

Hình 2.5 Sơ đồ hình cây thể hiện mối tƣơng quan giữa các dòng
Xanthomonas sp. dựa trên vùng 16s-23s rDNA ITS (Edmilson R
Gonealves và ctv, 2002).




Hình 2.4. Cấu trúc vùng 16s-23s rDNA ITS của Xanthomonas sp.
Trình tự primer Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s
(Edmilson R Gonealves và ctv, 2002).
Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’
Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’




11




Ngƣời ta dựa vào trình tự hrpW gen của X. a. pv. citri (Genbank Accession No.
AE008923) thiết kế cặp primer XACR, XACF chuyên biệt phát hiện nhanh chính nó.
Sản phẩm PCR thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 561 bp (Dong Suk Park và ctv, 2006)
XACR 5’CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’
XACF 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’
2.5. Những cứu về bệnh loét cam quýt trên Thế Giới và Việt Nam
2.5.1. Trên Thế Giới

Năm 2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di
truyền giữa 17 loài Xanthomonas sp. bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự
sản phẩm PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết
kế trên đoạn 16s-23s rDNA ITS.
Năm 2003, C. J. Vernière và ctv đã nghiên cứu sự phát triển và biểu hiện triệu
chứng bệnh của X. a. pv. citri trên cây có múi. C. J. Vernière và cộng sự đã kết luận
rằng để giảm bệnh loét nhà nông phải hạn chế tạo vết thƣơng cho cây, sự tăng trƣởng
quá nhiều chồi non và sự tăng trƣởng của quần thể X. a. pv. citri. Hệ thống chắn gió là
biện pháp hạn chế sự lan tràn bệnh hiệu quả nhất. Các tác nhân sinh học khác nhƣ ấu
trùng của côn trùng chít hút cũng là phƣơng tiện truyền bệnh nguy hiểm. Khả năng
nhiễm bệnh của ký chủ có liên quan đến giai đoạn phát triển của cây.
Năm 2003, Jung-Gun- Kim và ctv, đã mô tả đặc tính của vùng gây bệnh hrp của
X. a. pv. glycines Vùng này gồm vùng hrp gen, vùng hcr gen và vùng hca gen.Trong
đó vùng hrp và hcr mã hóa cho loại protein đóng vai trò quan trọng trong quá trình
xâm nhiễm của vi khuẩn X. a. pv. glycine. Đặc tính của vùng hrp gen này là chứa
nhiều gen độc, thành phần G+C thấp.
Năm 2006, Dong Suk Park và ctv, đã thực hiện thành công phƣơng pháp PCR
với mồi chuyên biệt trên hrpW gen để phát hiện nhanh và chính xác X. a. pv.citri, là
loài gây bệnh loét trên cây có múi tại châu Á.
2.5.2. Tại Việt Nam
Năm 2002, Nguyễn Thị Thu Cúc -Phạm Thị Hoàng Oanh, trƣờng Đại Học Cần
Thơ, có nghiên cứu về dịch hại trên cam, quít, chanh, bƣởi. Nghiên cứu này tập hợp
12




hầu hết các thông tin về dịch hại phổ biến tại Việt Nam. Trong nghiên cứu này, tổng
cộng có trên 30 loài côn trùng và 15 loại bệnh phổ biến trên nhóm cam, quít, chanh,
bƣởi đã đƣợc trình bày và mô tả qua các phần nhƣ đặc điểm hình thái, sinh học, sinh

thái, sự gây hại, triệu chứng và các biện pháp đối phó.
Năm 2005, Vi Thị Thanh Hƣờng, trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh đã nghiên cứu các tác nhân và biện pháp phòng trừ biện pháp phòng trừ
bệnh loét trên bƣởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu - tỉnh Đồng Nai. Tác giả đã phân
lập đƣợc một số dòng vi khuẩn gây bệnh nhƣng chƣa định danh đƣợc. Đồng thời, tác
giả cũng xác định một số loại thuốc hóa học phòng trừ bệnh loét.
2.6. Quy trình định danh Xanthomona sp. .
2.6.1. Quy trình định danh Xanthomonas sp. theo phƣơng pháp nuôi cấy, thực
hiện phản ứng sinh hóa
1. Sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập dòng gây bệnh (Bảng 2.1)
2. Xác định dựa vào sắc tố vàng Xanthomonadin.
(Phƣơng pháp thực hiện sẽ nêu ở phần 3.4.3 phƣơng pháp và vật liệu)
3. Thực hiện thí nghiệm sinh hóa và quan sát hình thái (Bảng 2.2)
a) Khả năng phát triển trong môi trƣờng YS ở 35
o
C trong 10-12 ngày.
b) Kiểm tra sự tạo nhầy, màu sắc của khuẩn lạc trên môi trƣờng GYCA hoặc
YDC trong 2-3 ngày.
c) Kiểm tra khả năng phân hủy protein: là thử nghiệm khả năng phân hủy
casein trong dịch sữa có chứa chất chỉ thị bromcresol purple đã khử trùng.
Dịch sữa và khuẩn đƣợc ủ 27
o
C quan sát phản ứng phân hủy.
d) Kiểm tra thủy phân asculin: phản ứng dƣơng tính khi dịch đổi màu nâu
tối (môi trƣờngYS lỏng + ferric ammonium citrate 0,05% và asculin 0,1%,
pH 6,8).
e) Kiểm tra khả năng thủy phân gelatin.
f) Kiểm tra khả năng tạo urease.
g) Kiểm tra tạo axit từ carbohydrates.

13




4. Kiểm tra tính gây bệnh
Khẳng định độc tính dòng phân lập đƣợc bằng cách chủng nhân tạo. Ký chủ
đƣợc chủng hoàn toàn là cây sạch bệnh. Tạo vết thƣơng trên cây ký chủ. Sau đó nhỏ
dòng vi khuẩn đã kiểm tra các bƣớc trên lên vết thƣơng. Đặt cây ký chủ đã chủng vào
điều kiện tối ƣu cho bệnh phát triển. Thông thƣờng thì ở nhiệt độ 27
o
C-30
o
C, trong
vòng 7 ngày sau khi chủng thì thấy triệu chứng bệnh.
2.6.2 Quy trình định danh theo phƣơng pháp phân tử
Dựa trên quy trình định danh bằng phƣơng pháp nuôi cấy và kiểm tra sinh hóa
nhƣng bổ sung thêm một số phƣơng pháp sinh học phân tử để định danh chính xác ở
mức loài. Quy trình gồm các bƣớc sau:
1. Phân lập và kiểm tra hình thái, sinh hoá trên các môi trƣờng khác nhau nhƣ
NA, YGA, YDC, KB.
2. Tiến hành kiểm tra dòng phân lập đƣợc bằng phản ứng ELISA để kiểm tra và
phân loại dựa trên độc tính gây bệnh.
3. Kiểm tra sự oxy hóa nguồn cacbon (khả năng tạo axit từ đƣờng cacbon).
4. Kiểm tra khả năng gây bệnh của dòng phân lập bằng phƣơng pháp chủng
nhân tạo.
5. Thực hiên phản ứng PCR với cặp primer đƣợc thiết kế trên vùng 16s-23s
rDNA ITS.
6. Tiến hành cắt bằng enzyme giới hạn nghiên cứu sự đa dạng di truyền.
7. Đọc trình tự sản phẩm PCR trên vùng 16s-23s sẽ định danh đƣợc dòng vi

khuẩn gây bệnh ở mức loài. (M. H. R Khoodoo và ctv, 2005).






14




Bảng 2.1. Môi trƣờng sử dụng phân lập một số loài X. campestris








Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của Xanthomonas sp.


Loài
Môi trƣờng
campestris
carotae
translucens
phaseoli

vesicatoria
fragaria
SX, SM, NSCAA*
XCS*
XTS
MXP
Tween, XCS, XTS
SX, SM
Phản ứng kiểm tra
X. cam
_pestris
X.raga_
riae
X.albili
_neans
X.axono
_podis
X.
ampelina
Tạo nhầy trên
GYCA/YDC
+
+
_
_
_
Sinh trƣởng ở 35
o
C
+

_
+
+
_
Thủy phân asculin
+
_
+
+
_
Phân hủy gelatin
V
+
v
_
_
Phân hủy protein
+
_
_
_
_
Khả năng tạo
Urease
_
_
_
_
+
Tạo axit từ:

Arabinose
Glucose
Mannose

+
+
+

_
+
+

_
+
+

_
+
_

+
_
_
Ghi chú: * thƣờng sử dụng phân lập từ hạt

15




2.7 Phƣơng pháp PCR
Phƣơng pháp PCR ( Polymerase Chain Reaction) là một công cụ khá mới trong sinh học
phân học phân tử, do Karl Mullis và những cộng sự phát minh năm 1985 và đã liên tục hoàn thiện
và phát triển trong thời gian gần đây. Kỹ thuật PCR cho phép khuếch đại một đoạn DNA mong
muốn lên nhiều lần để phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau. Nguyên tắc cơ bản của phƣơng
pháp PCR chủ yếu dựa vào khả năng tự nhân đôi, biến tính và hồi tính của DNA.
*Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
Dựa trên khả năng biến tính và hồi tính của DNA cùng với sự phát hiện ra enzyme Taq-
polymerase (1 loại DNA polymerase chịu nhiệt), ngƣời ta thiết lập đƣợc hàng loạt các phản ứng
nhân đôi DNA in vitro trong một thời gian ngắn. Khi ta làm biến tính (đun nóng) để đoạn DNA
tách ra thành 2 mạch đơn và cung cấp 2 mồi chuyên biệt gồm mồi xuôi và mồi ngƣợc bắt cặp bổ
sung với 2 đầu đoạn DNA cần nhân lên thì Taq-polymerase sẽ tổng hợp nên 2 sợi DNA mới.
Nhƣ vậy nếu phản ứng nhân đôi DNA đƣợc lập lại liên tục nhiều lần thì ta sẽ thu đƣợc một lƣợng
khuếch đại rất lớn DNA cần nghiên cứu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ, mỗi chu kỳ có 3 giai đoạn:
- Giai đoạn 1: là giai đoạn biến tính (denaturation), nhiệt độ đƣợc nâng lên 93- 100
o
C. Ở
nhiệt độ này tất cả các mạch xoắn kép của DNA đều đƣợc tách ra.
- Giai đoạn 2: là giai đoạn bắt cặp (hybridization), nhiệt độ của phản ứng đƣợc hạ xuống
thấp hơn nhiệt độ nóng chảy-Tm của các mồi (là nhiệt độ mà tại đó 2 mạch của sợi đôi DNA tách
ra hoàn toàn) cho phép các mồi bắt cặp với DNA khuôn mẫu. Mức nhiệt độ dao động khoảng 40-
70
o

C, tuỳ thuộc vào Tm của các mồi mà thời gian từ 30 -60 giây.
- Giai đoạn 3: là giai đoạn kéo dài (extension), nhiệt độ đƣợc nhân lên 68-72
o
C. Ở nhiệt
độ này Taq-polymerase hoạt động tốt nhất để kéo dài các mạch DNA. Đoạn DNA nằm giữa 2
mồi đƣợc tổng hợp.
Cứ sau 1 chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên, từ 1 DNA khuôn mẫu sẽ tạo ra 2 DNA mới. Và
sau mỗi lần lập lại sẽ làm tăng gấp đôi lƣợng DNA mẫu của lần trƣớc (theo cấp số nhân).
Tổng số DNA đƣợc khuếch đại sau phản ứng PCR đƣợc tính theo công thức:
Tổng số DNA khuếch đại = m x 2
n

Với m là số bản sao ban đầu của DNA mẫu, n là số chu kỳ.
16




PH ẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Đề tài đƣợc tiến hành từ 06/02/06 đến 06/08/06
Địa điểm: Tại Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật-
Trƣờng Đại Học Nông Lâm T.P Hồ Chí Minh.
3.2. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập, nuôi cấy, xác định dòng vi khuẩn gây bệnh là gram âm hay gram
dƣơng, quan sát hình thái trên môi trƣờng PGA, YDC.
2. Chủng bệnh nhân tạo xác định dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng vi khuẩn
có khả năng gây bệnh trên ký chủ là cây bƣởi. Dựa trên kết quả chủng bệnh
khẳng định đặc tính gây bệnh của dòng vi khuẩn phân lập.
3. Thực hiện sắc ký bản mỏng để định danh Xanthomonas.sp (dựa vào sắc tố

vàng Xanthomodin đặc trƣng).
4. Nhân sinh khối, ly trích DNA tổng số các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc.
5. Dùng phản ứng PCR trên 16s-23s rDNA ITS với cặp primer Xan1330 và
Xan332 để kiểm tra phƣơng pháp định danh đã thực hiện. Đồng thời tiến tới
giải trình tự sản phẩm PCR định danh ở mức độ loài.
6. Thực hiện phản ứng PCR trên vùng hrpW gen với cặp mồi chuyên biệt XACR
và XACF cho phép xác định nhanh Xanthomonas axonopodis pv. citri.
3.3 Vật liệu nghiên cứu
Tiến hành thu thập mẫu bệnh cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam tại huyện
Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai. Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại vƣờn, trữ trong thùng mát,
mang về phòng, tiến hành phân lập.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1 Phân lập, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC, xác định Gram âm hay
Gram dƣơng các dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi
 Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu
- Autoclave - Đƣờng glucose
- Bếp điện - CaCO
3

17




- Tủ cấy vô trùng - Yeast extract
- Đĩa peitri - Khoai tây
- Becher 100ml - Agar
- Cồn 96%, và cồn 70% - Que cấy
- Đèn cồn
 Phân lập vi khuẩn gây bệnh, nuôi cấy trên 2 môi trƣờng PGA và YDC,

xác định Gram âm hay Gram dƣơng
1. Thu thập mẫu bệnh, lá, trái bị bệnh.
2. Cắt nhỏ thành mẫu hay đoạn ngắn.
3. Khử trùng bề mặt bằng cách nhúng mô bệnh trong nƣớc cất vô trùng 1 phút,
tiếp tục rửa bằng cồn 70% trong 15- 30 giây, sau đó rửa sạch trong nƣớc cất
vô trùng.
4. Để khô mẫu sau đó cấy lên môi trƣờng PGA.
5. Nuôi cấy thuần khiết dòng vi khuẩn: từ đĩa petri phân lập vi khuẩn, chọn một
khuẩn lạc, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cấy truyền vi
khuẩn sang đĩa petri mới. Đặt đĩa Petri đã cấy truyền ở nhiệt độ thích hợp
(28
o
C) từ 1-3 ngày cho đến khi các khuẩn lạc mới mọc ra. Từ đó cấy truyền
lại lần thứ 2 khi các khuẩn lạc đều đồng nhất về hình dạng, kích thƣớc, độ
nhờn, cuối cùng khuẩn lạc đồng nhất nói trên đƣợc trữ trong LB tăng sinh
(Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mẫn 1999 và có chỉnh sửa, 1999).
6. Cấy các khuẩn lạc đã đồng dạng này cấy tiếp tục lên môi trƣờng YDC quan
sát hình thái màu sắc đậm trƣng.
7. Xác định Gram âm hay Gram dƣơng: Nhỏ một giọt dung dịch KOH3% ra
miếng lam. Sau đó, dùng que tăm lấy một vi khuẩn cần xác định khuấy đều
trong giọt dung dịch. Kéo que tăm lên thấy dung dịch kéo sợi thì đó là Gram
âm, còn không kéo sợi đó là Gram dƣơng.



18

- Cách đặt tên cho các dòng vi khuẩn phân lập được
Dựa trên cây ký chủ thu thập mẫu lá và trái. Ví dụ: dòng vi khuẩn XBDL1 đƣợc
hiểu là dòng Xanthomonas sp., BDL là tên ký chủ bƣởi Da Láng, số 1 là dòng
vi khuẩn trên lá, số 2 là dòng trên cành, số 3 là dòng vi khuẩn trên trái.
3.4.2. Chủng bệnh nhân tạo
Chủng bệnh nhân tạo trong phòng: hái lá, quả bƣởi không bị nhiễm bệnh, rữa
thật sạch dƣới vòi nƣớc chảy. Khi lá, quả bƣởi ráo nƣớc ta tiến hành chủng bệnh. Dùng
kim nhọn gây vết thƣơng dƣới lá, sau đó dùng pipet hút dịch khuẩn (khuẩn lạc đặc
trƣng pha với nƣớc cất vô trùng) nhỏ lên vết thƣơng. Giữ lá trong hộp nhựa đủ độ ẩm.
3.4.3. Thực hiện sắc ký bản mỏng định danh vi khuẩn
 Dụng cụ và thiết bị  Hóa chất và vật liệu

- Bình hút ẩm - Methanol 100%

- Epffendorf 1,5 ml - Nutrient
- Micropipette 1000µl - Agar
- Bếp điện
- Tấm sắc ký
- Máy ly tâm
 Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
Nhiều vi khuẩn có sắc tố vàng thƣờng đƣợc phân lập từ cây hoặc đất.
Xanthomonas cũng có sắc tố vàng. Do đó, việc dựa vào màu khuẩn lạc trên môi trƣờng
để xác định đó là Xanthomonas thì khó. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn có thể xác định đƣợc
Xanthomonas dựa vào phƣơng pháp sắc ký bản mỏng.
Các bƣớc tiến hành:
1. Cấy khuẩn lạc trên môi trƣờng nutrient agar (môi trƣờng không có
cacbonhydrate vì sẽ tạo chất nhầy cản trở quá trình sắc ký).
19

(b)
2. Sau 48 giờ phát triển ở nhiệt độ phòng, cạo sinh khối vi khuẩn cho vào ống
típ, thêm 3ml methanol sao cho độ đục của vi khuẩn trong methanol khoảng
10
10
CFU/ml.
3. Đặt ống típ vào nƣớc đang sôi, cho đến khi màu vàng xuất hiện.
4. Ly tâm 1000 vòng/15 phút loại mảnh vỡ tế bào.
5. Thu dịch nổi, đồng thời làm bay hơi methanol trong dung dịch trong nƣớc ấm
50-60
o
C cho đến khi mật độ quang học của dịch chiết sắc tố khoảng 0.4 ở
443nm.
6. Nhỏ dịch chiết sắc tố này lên tấm bản mỏng đo sắc tố. Mỗi dòng vi khuẩn là
một giếng. mỗi giếng là 25µl (hình 3.1).
7. Đặt tấm sắc ký bản mỏng đã nhỏ sắc tố vào dung dịch methanol. Để cho
methanol thẩm thấu lên tấm sắc ký này (hình 3.2).
8. Phát thảo vệt sắc tố màu vàng hiện lên tấm sắc ký. Vệt sắc tố màu vàng có
Rf khoảng 0.45 chứng tỏ đó là Xanthomonas.







Hình 3.1 (a) Tấm sắc ký vừa nhỏ Xanthomodin dung dịch
sắc tố, (b) Tấm sắc ký ngâm methanol trong bình hút ẩm.

3.4.4. Phƣơng pháp ly trích DNA tổng số của vi khuẩn
 Hóa chất và vật liệu
- Hỗn hợp phenol: chloroform: isoamyl alcohol (25:24:1)
- Hỗn hợp chloroform: izoamyl alcohol (24:1)
- Isopropanol
Vệt sắc tố sau khi nhỏ lên
tấm sắc ký
(a)
20




- Ethanol 100 % và 70 %
- Dung dịch đệm ly trích DNA
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh
tổn hại DNA
EDTA (Ethylenediamine tetraacetate) : tạo phức Mg
++
, gây bất hoạt enzyme
phân hủy DNA trong quá trình tách chiết
SDS: (sodium dodecy sulphate) 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào,
màng nhân để phóng thích DNA
Dung dịch CTAB (Cetultrimethylammonium bromide): dùng để kết tủa
polysaccharide và tạp chất khác
- 10g CTAB (Cetultrimethylammonium bromide)
- 100ml NaCl 0,5 M
Dung dịch đệm TE (Tris-EDTA) pH 8
Bảng 3.1. Thành phần dung dịch đệm TE
Thành phần

Nồng độ stock
Nồng độ
Thể tích
Tris (pH 8.0)
1 M
10 mM
0,5ml
EDTA
0,5 M
0,5 mM
0,1ml
Nƣớc cất


49,4ml
Tổng cộng


50,0ml

 Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng để ly trích DNA
- Epffendorf 1,5 ml - Micropipette các loại
- Đầu típ các loại - Bồn ủ nhiệt
- Máy vortex - Máy ly tâm lạnh
- Giấy thấm - Tủ 4
o
C và - 20
o
C
 Quy trình ly trích DNA tổng số

1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4
o
C. Rửa sinh
khối vi khuẩn đƣợc với 1ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex.
21




2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567µl dung dịch TE, đánh tan
bằng vortex, thêm 30µl dung dịch SDS10%, đánh tan bằng vortex. Sau đó ủ ở
37
o
C khoảng 1-2 h.
3. Cho thêm vào 100µl dung dịch NaCl5M hòa tan thật kỹ bằng vortex.
3. Thêm 80µl dung dịch CTAB/NaCl, pha trộn (đánh tan bằng vortex), ủ 65
o
C
trong 10 phút.
4. Chiết xuất dung dịch DNA với phenol/ chloroform/ isoamyl alcohol
(25:24:1).Hòa hỗn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4
o
C.
5. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới.
6. Thêm 780µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn
đều bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4
o
C.
7. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol,
ủ -20

o
C/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10 phút/4
o
C. Lấy kết tủa sau ly
tâm.
8. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20
o
C, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4
o
C. Đổ
cồn ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
9. Hòa tan kết tủa trong 40µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4
o
C trong
suốt thời gian thử nghiệm.
(Sambrook và ctv, 2001 đã có cải tiến)
3.4.5. Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS và vùng hrpW gen
 Các hóa chất đƣợc sử dụng để thực hiện phản ứng PCR
- Dung dịch đệm PCR 10X (Bio-rad)
- MgCl
2
50 mM (Bio-rad)
- dNTP 10 mM (gồm dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Bio-rad)
- Taq DNA polymerase 5 UI/µl (Bio-rad)
- Primer: Xan1330 và Xan332, XACR và XACF
Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng thực hiện phản ứng PCR
- Hộp đá khô -20
o
C
- Eppendorf 0,2ml

22




- Micropipette 10µl, 100µl và các loại đầu típ tƣơng ứng
- Máy luân nhiệt
- Tủ vô trùng

3.4.5.1 Khuếch đại vùng 16s-23s rDNA ITS dòng vi khuẩn phân lập với cặp
mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv, 2005)
Xan 1330 5’GTTCCCGGGCCTTGTACACAC 3’
Xan 322 5’ GGTTCTTTTCACCTTTCCCTC 3’
Bảng 3.2. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt phản ứng PCR.cc







3.4.5.2 Khuếch đại đoạn hrpW gen dòng vi khuẩn phân lập với cặp mồi
XACF và XACR
Sử dụng bặp mồi XACR, XACF khuếch đại vùng hrpW gen trên Xanthomonas
axonopodis pv.citri có kích thƣớc 561bp. Đây là trình tự mồi chuyên biệt để xác định
Thành phần
Nồng độ ban đầu
Nồng độ sau phản ứng
Thể tích (µl)

PCR buffer
10X
1X
2,5
dNTPs
25mM
0,2mM
0,2
MgCl
2

25 mM
0,75mM
0,75
Primer
20pmol/µl
1,25pmol/µl
1
Taq polymera se
5unit/1µl
2unit/1µl
0,4
DNA
<=100ng
<=50ng
1
H
2
O

18,05
Tổng cộng


25
Các bƣớc phản ứng
Nhiệt độ
Thời
gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ và bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
o
C

94
o
C
58
o
C
72
o
C
72

o
C
3 phút

1phút
45 giây
1 phút
7phút