Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 2 doc

6

Sống đƣợc ở nhiệt độ thấp (8
o
C), biên độ của độ ẩm rộng, ở nơi tích lũy nhiều
CO
2
và O
2
chúng có thể sống sót tới 445 ngày. Khi hoại sinh trong đất, bào tử
dính bị ức chế nảy mầm bởi khu hệ nấm đất, trong đó có chủng Aeromonas (thí
nghiệm in vitro).
Ở dƣới 10
o
C và trên 35
o
C thì sự hình thành bào tử không thể xảy ra.
Nhiệt độ tốt nhất cho sự nảy mầm bào tử là 25 – 30
o
C và chết ở 49
o
C trong 10
phút.
Nhiệt độ tốt nhất cho sự sinh trƣởng là 25
o
C và pH 3,3 – 8,5.
Metarrhizium anisopliae có khả năng phân giải tinh bột, cellulose và kitin
(lông và da côn trùng). (Trần Văn Mão, 2004).
2.2.2 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille
- Nấm Beauveria bassiana cũng nhƣ Metarrhizium anisopliae là nấm thiên
địch ký sinh trên côn trùng gây hại, bào tử nấm thƣờng có kích thƣớc thƣờng dài hơn

3µmdạng bào tử túi.Nấm Beauveria bassiana thuộc lớp: Deuteromycetes, họ
Moniliacea, bộ Moniliales, Giống: Beauveria. Giống Beauveria thƣờng đƣợc chia
thành 3 loài: Beauveria bassiana, Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2
loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng
Giang, 1997)là nấm trắng thƣờng gây bệnh cho:rầy nâu, sâu cuốn lá, sâu dục thân,bọ
xích hại lúa, bọ xích đen,….Nó hủy hoại các mô mềm và dịch cơ thể ký chủ, chúng
phát triển bên ngoài rồi mọc đầy trên cơ thể ký chủ, hút hết dƣỡng chất cho đến khi
ký chủ chết, khi ký chủ chết nó hình thành bào tử và phát tán bào tử trong không khí
nhờ nƣớc và gió.Tuy nhiên để phát tán nó đòi hỏi cần phải có ẩm độ kéo dài để bào tử
có thể lan đi nhờ gió và nƣớc.
- Bào tử trần hình cầu (đƣờng kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-5,5 x 1,3 m).
Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi trƣờng, mang
nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng, Nấm khi mọc
trên côn trùng thƣờng có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề mặt trơn và có
nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi( Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hƣơng Giang, 1997).
Nhiệt độ tối ƣu cho nấm phát triển là khỏang trên dƣới 25
0
C tốt nhất từ 25
0
C-
30
0
C trong trƣờng PDA (Potato-Dextrose-Agar), trong khỏang 3-6 ngày nuôi cấy
7

nấm phát trịển mạnh lúc này nấm có màu vàng nhạt hoặc màu trắng, đƣờng viền đôi
khi có màu kem hoặc hơi đỏ. Bào tử thƣờng có hình cầu, hình trứng, có khi chiều dài
lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Có khỏang 9 lòai Beauveria bassiana đƣợc phân
lập, sử dụng trong nghiên cứu trong kỹ thuật rRNA Sequencing.

Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trƣờng từ 3 - 9 không ảnh hƣởng tới sự
phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral(1970) nấm
Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trƣờng, pH
thuận lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả
năng phát triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,4 (trích dẫn bởi
Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống nhƣ hầu hết các loại nấm
diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành
thành viên trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh
chuyên hóa rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng
nhiễm thành công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm
khác nhau: qua lớp cutin, qua đƣờng tiêu hóa, qua đƣờng hô hấp và
qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong
điều kiện môi trƣờng không thuận lợi dƣới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh
dƣỡng kết lại thành một thể rắn chắc).Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria
bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì: chúng có thể phát triển trên môi trƣờng dinh
dƣỡng, có thể đƣợc chế tạo ở dạng chế phẩm sinh học, và tiêu diệt một lƣợng không
nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang,
1997).
Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào
tử nảy mầm. Tên thông thƣờng của độc tố là beauverixin, công thức hóa học
C
45
H
57
O
9
N
3
- ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)

3
. Đó là
một loại depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu
Thị Hƣơng Giang, 1997).
Vì tính chất quan trọng của nấm trong vai trò điều khiển cân bằng sinh học
trong tự nhiên nói chung và trong bảo vệ thực vật nói riêng nên hiện nay nhiều
nghiên cứu trên thế giới về nấm đƣợc áp dụng, một số kỹ thụât đƣợc áp dụng trong
8

nhận diện nấm Beauveria bassiana vuille những nghiên cứu gần đây là :sử dụng
Isozymes (St Legent et al ., 1992;Poprawski et al .,1998), rRNA Sequences
(Rakotonirainy et al .,1991), phân tích RFLP (Kosir,Macpherson và
Khatchatourians.,1991 ; Maurer et al .,1997). Trong đó vịêc áp dụng kỹ thuật RFLP
kết hợp với PCR cho kết quả khả quan hơn cả .
2.3. Hiệu quả phòng trừ sâu hại bằng chế phẩm nấm
Nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc nghiên cứu sản xuất để
trừ một số sâu hại quan trọng trong nông nghiệp. Hiệu quả của chế phẩm đã thử đối
với rầy nâu, sâu đo đay, châu chấu xanh, châu chấu ở điều kiện trong phòng thí
nghịêm và ở nhà lƣới. Chế phẩm có tác dụng giảm tỷ lệ rầy nâu 55,2 – 58,8%, rầy
lƣng trắng 64 – 92%, rầy xanh 75 – 96% và sâu đo xanh hại đay 43,9 – 64,2%. Hiệu
lực diệt các loài rầy hại lúa trên đồng ruộng của nấm Beauveria bassiana biến động
từ 33 – 75% tùy theo vụ và năm khác nhau. Hiệu lực của nấm kéo dài 3- 4 tuần sau
khi phun nấm, vì vậy chỉ cần phun nấm một lần trong một vụ là đủ để quản lý các loài
rầy hại lúa trong vụ.
Dùng nấm B. bassiana vuille để quản lý các loài rầy hại lúa đã làm tăng năng
suất từ đối chứng (tùy theo từng vụ và từng năm). Nấm B. bassiana không gây ảnh
hƣởng gì cho lúa và cũng không gây hại đối với các thiên địch sâu, gầy hại lúa (Trần
Văn Mão, 2004).

Nấm M. anisopliae có khả năng gây bệnh làm chết 84,6% châu chấu
Nomadacris succincta sau 10 ngày xử lý và nấm M. flavoviride gây chết 100% châu
chấu thí nghiệm sau 7 ngày. Chế phẩm nấm diệt châu chấu đƣợc tiến hành ở Bà Rịa –
Vũng Tàu, Đồng Nai cho kết quả tƣơng đối tốt nhƣng không đều (Trần Văn Mão,
2004). Nghiên cứu gần đây của Hệ Thống Nghiên Cứu Nông Nghiệp Hội Đồng Khoa
Học Công nghệ Việt Nam cho kết quả nhƣ sau:nấm Beauveria bassiana ký sinh trên
sâu róm hại thông có khả năng trừ sâu là đến 93.6%. Còn tác dụng khi sử dụng kết
hợp hai lọai nấm Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae trong vịêc trừ hại
cho bọ dừa đạt hiệu quả từ 56%-97% (www.vnast .gov.vn/index .asp……)
Ở Bolivia, các nhà nghiên cứu thuộc công ty PROBIOMA đã sản xuất thành
công nhiều chế phẩm sinh học từ nhiều loài nấm thiên dịch khác, trong đó có hai loài
nấm phổ biến là Beauveria bassiana và Metarrhizium anisopliae và chế phẩm trên
thị trƣờng là: ProbioBass, ProbioMet
9


iPROBIOMET
CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM METARRHIZIUM
ANISOPLIAE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI


PROBIOBASS
CHẾ PHẨM SINH HỌC TỪ NẤM BEAUVERIA
BASSIANA VUILLE DIỆT CÔN TRÙNG GÂY HẠI


Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium
(Nguồn : www.probioma.org.bo)
2.4. Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm của nấm ký sinh trên côn trùng
- Hầu hết những loài nấm gây bệnh cho côn trùng đều xâm nhập vào cơ thể vật

chủ qua lớp vỏ cơ thể. Bào tử nấm bám vào bề mặt cơ thể vật chủ, trong điều kiện đủ
độ ẩm bào tử mọc mầm và xâm nhiễm vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ
chitin nhờ áp lực cơ giới hoặc hoạt động men của nấm. Nấm tiết ra loại men làm mềm
lớp vỏ chiti mầm, qua lỗ thủng dó bào tử xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng và
tạo thành một lỗ thủng tại nơi bào tử mọc. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ
thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm có thể ký sinh đƣợc côn trùng chích hút và cả
những pha phát triểncủa côn trùng nhƣ trứng, nhộng mà các vi sinh vật khác không ký
sinh đƣợc.
- Nấm cũng có thể xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua đƣờng miệng.Từ
miệng, bào tử đi tới ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các bào nội quan để gây
bệnh. Xâm nhiễm kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nƣớc. Dƣới tác
động của độc tố do bào tử nấm tiết ra có thể dẫn tới hiện tƣợng ngừng nhu động ruột
của vật chủ. Bào tử nấm còn có thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào
bên trong cơ thể côn trùng nhƣng rất ít.
Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Sau khi xâm nhập vào cơ thể côn trùng thì chúng bắt đầu sinh sôi nảy nở bên
10

trong cơ thể côn trùng và côn trùng chết trong khoảng 3 tuần.
Sự sinh trƣởng và phát triển của nấm sau khi côn trùng vật chủ chết
- Sau khi côn trùng chết, nấm tiếp tục phát triển hình thành lớp bào tử bao phủ
toàn bộ bề mặt ngoài của vật chủ. Lớp bào tử này ban đầu có màu trắng sau chuyển
qua màu xanh lục.
- Các nấm gây bệnh cho côn trùng chỉ sinh trƣởng phát triển để hoàn thành một
chu kỳ sống của chúng: từ mọc mầm bào tử đến hình thành bào tử mới. Nấmgây bệnh
côn trùng có tính chuyên tính hẹp, chỉ ký sinh một vật chủ hoặc một giai đoạn nhất
định của vật chủ. Nhiều trƣờng hợp chúng là ký sinh có tính chuyên hóa thức ăn rộng,
có thể ký sinh nhiều loài côn trùng thuộc các giống, họ, bộ khác nhau.
- Để có thể gây đƣợc những dịch bệnh nấm lớn cho sâu hại, các đặc điểm của
nấm đóng một vai trò quan trọng là: độc tính của nấm, khả năng di chuyển bào tử

trong những điều kiện không thuận lợi và khả năng phát tán trong thiên nhiên. Đặc
điểm đặc biệt đối với các nấm họ Entomophthoraceae đó là hoạt động bắn bào tử xa
một khoảng cách gấp hàng nghìn lần kích thƣớc của nó. Điều đó tạo khả năng phát tán
rộng lớn hơn trong quần thể côn trùng. Sự phát tán có hiệu quả cao hay không ở mức
độ nhất định cũng phụ thuộc vào độ nhất định cũng phụ thuộc vào.
2.5. Hoạt tính sinh học
- Các nấm diệt sâu cũng đƣợc chú ý nhiều nhƣ một sinh vật sản sinh các enzyme,
toxin và các chất hoạt tính sinh học khác. Theo nhiều tài liệu của nhiều tác giả cho biết
các nấm Muscardine(ví dụ: nấm Muscardine trắng: Beauveria bassiana ,nấm
Muscardine xanh: Metarrhizium anosopliae )có khả năng tổng hợp một lƣợng lớn
enzyme, trong đó có ý nghĩa lớn nhất có khả năng gây bệnh cho côn trùng có chứa.
chitinase,Proteinase,lipase và amylase.
2.6. Một số nghiên cứu trong nƣớc và ngoài nƣớc về nấm Metarrhizium anisopliae
và nấm Beauveria bassiana vuille cũng nhƣ một số nấm ký sinh côn trùng
khác trong ứng dụng để phòng trừ sâu hại
2.6.1. Nghiên cứu trong nƣớc
- Lần đầu tiên tại Bến Tre, Phạm Thị Thuỳ (2000) đã sử dụng nấm Metarrhizium
để trừ bọ dừa, kết quả ban đầu cho thấy nấm Metarrhizium sau khi đã thử nghiệm
trong phòng, trong nhà lƣới và ngoài đồng có hiệu quả đối với bọ dừa ở Bến Tre. Hiện
tại ở Việt Nam đã thu thập và lƣu giữ một số chủng nấm Beauveria và Metarrhizium,
11

gồm 18 nguồn Beauveria và 10 nguồn Metarrhizium. Chúng đƣợc phân lập từ các
loại côn trùng khác nhau, gồm sâu đo xanh, châu chấu hại cam, sâu khoang hại lạc,
rầy nâu hại lúa, sâu đục thân ngô, sâu xanh hại bông, sâu cắn gié, bọ xít đen, bọ xít
dài (Nguyễn Văn Tuất, 2000).
- Theo Tạ Kim Chỉnh và ctv (2001), đã chọn đƣợc môi trƣờng nhân giống cho
các chủng Metarrhizium anisopliae là môi trƣờng Saubouraund có bổ sung vỏ trấu.Bùi
Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn (2000) đã thử nghiệm chế phẩm B.75 từ Beauveria
bassiana dạng bột để phòng trừ sâu róm hại cây thông và cho biết sâu chết 80% sau

một năm xử lý.
- Nguyễn Thị Lộc và ctv (2004) đã thử nghiệm, sản xuất và ứng dụng chế
phẩm nấm ký sinh để phòng trừ sâu hại lúa ở Đồng Bằng Sông Cửu Long. Ngoài ra, ở
nƣớc ta cũng tiến hành nghiên cứu nấm gây bệnh trên các loài sâu hại đậu nành. Theo
Tống Kim Thuần, Vũ Quang Côn (2001), các vi nấm có khả năng gây bệnh sâu hại
trên đậu tƣơng chủ yếu là các loài sau: Beauveria bassiana, Metarrhizium anisopliae
và Normurea rileyi. Chúng gây bệnh hầu hết các loài sâu hại thuộc bộ cánh vảy –
Lepidoptera, Entomophthora sp gặp ở bộ cánh nửa cứng - Hemiptera
- Theo Phạm Thị Thùy và cộng sự (1991 - 1995), nguồn nấm Beauveria ở nƣớc
ta khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana đƣợc sản xuất bằng phƣơng
pháp lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 10
8
bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt
nhất theo phƣơng pháp này là 10 ngày, chế phẩm đƣợc làm khô ở nhiệt độ 45
o
C trong
8 giờ và có thể đƣợc bảo quản trong thời gian 6 tháng. Khi thử nghiệm phƣơng pháp
lên men chìm có sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trƣờng có pepton, cao nấm
men và muối khoáng thì sau 48 giờ ở 30 phút bào tử nấm Beauveria đạt 8,5 x 10
9
bào
tử/gam. Hiệu quả sử dụng tốt nhất của chế phẩm nấm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đậu, châu chấu sống lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5 - 6 x 10
8
bào tử/ml.
Hiệu lực của thuốc nấm phụ thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và độ ẩm.
- Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các nòi nấm có hiệu lực
diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phƣơng pháp
tách tế bào đơn từ sâu nhiễm đã chọn đƣợc các chủng nấm diệt sâu có độc tính cao. Từ
các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập đƣợc 9 chủng nấm Beauveria bassiana

từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hà khoai lang Đà Lạt, Hóc Môn và Indonesia.
Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có hiệu lực diệt trùng ấu
12

trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trƣởng thành và sâu xanh da láng nhƣng ở các mức độ
khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassiana với pheromon trên ruộng
khoai lang ở Thủ Đức Thị Hƣơng Giang, 1997).
- Nguyễn Xuân Niệm (2003) khi nghiên cứu hiệu lực trừ sâu hại của chế
bassiana và Entomopthorales) của Công ty Hợp danh Sinh Thành trong phòng trừ bọ
cánh cứng hại dừa tại Kiên Giang đã kết luận rằng Bemetent có hiệu lực phòng trừ
cả thành trùng và ấu trùng của bọ cánh cứng hại dừa.
2.6.2. Nghiên cứu ngoài nƣớc
- Trên thế giới, việc sử dụng nấm trong đấu tranh chống sâu hại có lịch sử khá
lâu đời, Meschnikoff (1884) là ngƣời đầu tiên trình bày vấn đề sử dụng nấm trong đấu
tranh sinh học với sâu hại (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang,
1997).
Theo Juntin L.Hatting, Richard A. Humber, Tadeusz J. Poprawski và Ray M.
Miller (1999), các nghiên cứu về nấm gây bệnh rầy mềm ở Nam Phi đƣợc định hƣớng
từ năm1995-1998, và cho biết trong 8 lòai nấm đƣợc tìm thấy đều lan truyền và giết
chết rầy mềm, gồm có 6 lòai thuộc Entomophthorale Pandora neoaphidis,
Connidiobolus thromdoides, C.corcnatus, Entomophthora planhoniana và Neozygites
fresenii) và hai lòai thuộc Hyphomycetes (Beauveria bassiana, verticillium lecanii) .
Theo A.M. Kammp và M. J. Bidochka (1994), tiến hành đánh giá sự sản xuất
bào tử của 3 loại nấm gây bệnh côn trùng Metarrhizium anisopliae, Beauveria
bassiana và Verticillium lecanii đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2mm , 3mm,
4mm tƣơng ứng với 10ml, 15ml, 20ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA,
MEA, NA, CMA, YPDA, PDA) và cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm
Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana tốt nhất trong môi trƣờng PDA ở độ
sâu 2mm, trong khi Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng
YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì không đáng kể. Theo Nguyễn Ngọc Tú và

Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang (1997), thì Codaira Y. (1961) đã tách đƣợc hai độc tố
ở nấm Metarrhizium anisopliae là destruxin A, liều gây chết với tầm là 0,28kg/g trọng
lƣợng cơ thể và destruxin B, liều gây chết là 0,34kg/g trọng lƣợng cơ thể
13

.
Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana
ký sinh trên ong
(nguồn: wescaco.ars.usda.gov)
Glare và Inwood (1998) đã so sánh di truyền các giống Beauveria phân lập
từ New Zealand bằng hai phƣơng pháp RAPD và RFLP. Kết quả phân tích RAPD sử
dụng 10 primer khác nhau đã chia các giống phân lập đƣợc thành 4 nhóm có kiểu di
truyền khác nhau: nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii, nhóm B.
bassiana, nhóm B. brongniartii và một nhóm gồm các giống Beauveria khác. Sử dụng
enzyme cắt giới hạn vùng ITS của rDNA nhân cho thấy có sự khác biệt về di truyền
giữa giống B. bassiana và nhóm nhân không đồng nhất B. bassiana/B. brongniartii.
2.7. Phƣơng pháp phát hiện gen Pr1 và vùng ITS1 -5.8S – ITS2:
Có nhiều phƣơng pháp khác nhau (nhƣ ELISA, allozyme electrophoresis hoặc
RFLPs) có những ƣu và khuyết điểm khác nhau, chỉ phân biệt giữa mỗi loài hoặc đòi
hỏi số lƣợng lớn của DNA tinh khiết (Hegedus và ctv, 1993). Sự phân lập DNA thì tốn
nhiều thời gian và giới hạn số lƣợng mẫu có thể phân tích đƣợc trong thời gian thích
hợp. RAPD – PCR thì cũng đƣợc sử dụng để mô tả đặc điểm những giống
Metarrhizium anisopliae. Tuy nhiên, RAPD – PCR rất dễ bị nhiễm tạp và thƣờng
không ổn định, chỉ có thể thực hiện một cách chắc chắn trên DNA từ nuôi cấy ở ký
chủ.
Sử dụng phƣơng pháp mà cho phép sự khám phá về những đặc điểm của
những giống Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana lây nhiễm trên côn
trùng. Đó là phƣơng pháp kết hợp kỹ thuật PCR và phân tích RFLP (RFLP – PCR),
dựa trên sự khuếch đại của phần gen mã hóa chủ yếu là protease subtilisin Pr1 (St
Leger và ctv, 1992) đƣợc tiết ra bởi nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1- 5.8S

– ITS2 đƣợc tiết ra bởi nấm Beauveria bassiana và men cắt giới hạn các sản phẩm
PCR hai vùng này
14

2.8. Phản ứng PCR
2.8.1. Giới thiệu sơ lƣợc về PCR
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) là một phƣơng pháp in vitro để
tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số
lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp primer đặc hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này
đƣợc sử dụng rộng rãi để phát hiện, tạo ra các đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, biện
pháp cắt mầm bệnh trên ngƣời, vật nuôi và thực phẩm.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc
nhƣ sau:
Bƣớc 1 (tách sợi đơn DNA, denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử
DNA từ mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thƣờng là 94
o
C – 95
o
C trong
vòng 30 giây – 4 phút.
Bƣớc 2 (bƣớc lai, anealation): trong bƣớc này, ở nhiệt độ hơn Tm (nhiệt độ
nóng chảy) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong
thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40
o
C – 70
o
C tuỳ thuộc Tm
của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thƣớc sản
phẩm khuếch đại.

Bƣớc 3 (bƣớc kéo dài, elongation): dƣới tác động của DNA polymerase, các
nucleoid lần lƣợt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch
mới đƣợc tạo thành từ mồi đƣợc nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72
o
C.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bƣớc trên sẽ đƣợc lập lại nhiều lần, làm
gia tăng số lƣợng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu kỳ, sự
khuếch đại sẽ cho ra khoảng 10
6
bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản phẩm
đƣợc nhuộm bởi Ethidium Bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện di sản
phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312nm).
2.8.2. Yêu cầu cần thiết trong phản ứng PCR
- DNA khuôn dùng trong phản ứng PCR phải thật tinh sạch.
- Enzyme thƣờng đƣợc sử dụng hiện nay là Tag polymerase tách chiết từ vi
- khuẩn suối nƣớc nóng Thermus aquaticus, có khả năng chịu nhiệt cao.
- Việc thiết kế và chọn primer phải đáp ứng đủ các yêu cầu sau:Trình tự của
15

- primer đƣợc chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa primer “xuôi”
và primer “ngƣợc”.
- “Nhiệt độ nóng chảy” (Tm) của primer xuôi và primer ngƣợc không đƣợc
cách biệt quá xa
- Các pimer phải đặt trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại.
- Trình tự nằm giữa hai primer xuôi và ngƣợc không quá lớn, phản ứng PCR
tối ƣu nhất cho những trình tự nhỏ hơn 1kb.
2.8.3. Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR
Trong lĩnh vực công nghệ sinh học, kỹ thuật PCR đƣợc sử dụng trong việc lập
bản đồ gen, dòng hoá gen, giải trình tự DNA và phát hiện gen, các khảo sát trong pháp
y, trong điều tra hoạt tính di truyền, trong khảo cổ học thì giúp khuếch đại những đọan

DNA ủa những sinh vật đã tuyệt chủng nhƣ: khủng long, voi mamut…và những hóa
thạch khác.Và gần đây là đóng góp vào việc giải mã bộ gen ngƣời, đƣợc xem là thành
tựu mang tính lịch sử.
Do vậy, ƣu điểm của công cụ PCR là khả năng khuếch đại chính xác một trình
tự DNA mong muốn với một lƣợng lớn. Hiện nay, phƣơng pháp PCR còn đƣợc sử
dụng trong phát hiện các virus, vi khuẩn gây bệnh cho ngƣời và động vật cũng nhƣ
việc kiểm nghiệm vi sinh gây bệnh trong thực phẩm, mỹ phẩm, trong nƣớc.
Ở các nƣớc phát triển, PCR đã đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ công cụ chuẩn đoán
trong y học để phát hiện những bệnh di truyền, đƣợc sử dụng trong điều tra tội phạm
để xác định những ngƣời bị tình nghi ở cấp độ phân tử, đƣợc sử dụng trong xác
địnhquan hệ quyết thống và là một công cụ hữu hiệu trong việc giải trình tự các bộ gen
ngƣời.
2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR
- Trừ vài trƣờng hợp rất cá biệt, phƣơng pháp PCR không hoạt động đƣợc với
những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các độ dài dƣới 1,5 kb cho
kết quả tốt.
- Ỵếu tố ngoại nhiễm lớn nhất thƣờng là các sản phẩm khuếch đại của những
lần thao tác trƣớc.
- Các công đoạn thao tác khác nhau nhƣ thiết lặp phản ứng PCR và phân tích
các sản phẩm khuếch đại phải đƣợc tiến hành ở các địa điểm cách xa nhau.
16

- Micropipette không sử dụng vào các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với
micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm đầu micropipette bởi các phân tử khuếch
đại khi hút dung dịch phản ứng.
- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại trƣớc.
- Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá cao (cứ 10000 nucleotide
thì enzyme gắn sai 1 nucleotid (Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998)).
2.9.Kỹ thuật RFLP(Restriction Fragment length polymorphism)
* Kỹ thuật RFLP(sự đa hình về chiều dài các đọan DNA cắt bởi các enzyme giới

hạn).
Đây là phƣơng pháp tạo nên các đọan cắt khác nhau trên band agarose và đƣợc
ghi nhận trên gel bởi máy điện di, từng lòai có kích thƣớc riêng và đặc trƣng cho từng
loài.Khi xử lý cùng một enzyme cắt cho các mẫu DNA khác nhau, những lòai khác
nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau trên gel tạo nên sự đa hình trong loài đó . Còn
những loài khác nhau sẽ cho kích thƣớc band khác nhau.
* Quy trình phƣơng pháp RFLP thông thƣờng:
1. Ly trích và tinh sạch DNA.
2. Thực hiện phản ứng cắt các mẫu DNA khác nhau trên cùng enzyme cắt.
3. Điện di và tiến hành phản ứng lai Southern blot.
Trong thực tế, DNA của genome là rất lớn, nên khi cắt bởi enzyme và điện di
Southern blot. Đây là môt kỹ thuật rất tốn kém và phức tạp. Do đó khi sự khác nhau
trong trình tự của các loài lân cận chỉ xảy ra ở một vùng nào đó trong genome thì áp
dụng kỹ thuật RFLP dựa trên PCR có thể đƣợc sử dụng phân biệt các sản phẩm PCR.
Quy trình phƣơng pháp RFLP dựa trên PCR (phƣơng pháp RFLP-PCR):
- Tách chiết DNA tổng số,tinh sạchDNA.
- Thực hiện phản ứng PCR để khuếch đại trình tự đích.
- Xử lý các sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.
- Phân tích trên gel các sản phẩm PCR đã đƣợc cắt.
Ƣu điểm của phƣơng pháp RFLP-PCR so với phƣơng pháp RFLP thông thƣờng:
- Đơn giản, dễ thực hiện .
- Cần lƣợng nguyên liệu DNA ít.
- Có thể đọc đƣợc kết quả trực tiếp bằng mắt thông qua điện di trên gel.
17

- Không cần phải sử dụng các đầu dò phức tạp và tốn kém.
- Khi đọc kết quả dùng ánh sáng huỳnh quang thay cho chất phóng xạ.
2.10.Giải trình tự bằng máy đọc tự động
Ở đây, chúng tôi tiến hành giải trình tự trực tiếp từ sản phẩm PCR bằng máy đọc
trình tự tự động ABI PRISM 3100 của công ty AB (Applied Bioscience). Máy hoạt

động dựa trên nguyên tắc của Sanger nhƣng có một số cải biên. Trong kỹ thuật này
ngƣời ta không đánh dấu bằng các đồng vị phóng xạ mà bằng hoá chất – các
fluochrome. Mỗi loại dideoxynucleotide đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu
khác nhau. Nhƣ vậy, tất cả các oligonucleotide cùng chấm dứt tại một loại
dideoxynucleotide sẽ có cùng một màu. Sau khi điện di trên gel polyacrlamide, kết
quả sẽ đƣợc đọc qua một hệ thống vi tính.

















18

Phần III
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
- Thời gian đề tài được tiến hành là từ 20/2/2006 đến 15/8/2006
- Đòa điểm :phòng thực tập bệnh cây Bộ Môn Bảo Vệ Thực Vật, khoa Nơng

Học và trung tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh trường Đại Học Nơng Lâm
Thành Phố Hồ Chí Minh .
3.2. Vật liệu và hố chất
3.2.1. Vật liệu
3.2.1.1. Mẫu thí nghiệm
Đối tƣợng khảo sát là gen gây độc protease (Pr1) hiện diện ở nấm
Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 hiện diện trên nấm Beauveria
bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại cây trồng. Các mẫu phân lập nấm
Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana đƣợc thu thập trên một số cơn trùng
gây hại ở một số tỉnh thành trong nƣớc.
3.2.1.2. Các primer dùng trong khuếch đại gen và giải trình tự
Các primer đƣợc dùng để khuếch đại gen, giải trình tự đều đƣợc thiết kế bằng
phần mềm Amplify v1.4. Các primer đƣợc tổng hợp bởi cơng ty IDT
(Mỹ) do cơng ty Bio-Rad cung cấp.
3.2.2. Hố chất và mơi trƣờng
Các hố chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Cơng ty Sigma,
Merk, Amersham Biosence và Bio Rad.
3.2.2.1. Các hố chất dùng để chiết tách DNA từ khối sợi nấm
Phenol bảo hồ trong TE pH 8,0.
Chloroform.
Isoamyl.
Isopropanol.
Ethanol 100%.
Ethanol 70%.
RNAse 1mg/ml.
19

Nitơ lỏng.
Dung dịch chiết xuất (lyssis buffer): 50mM Tris HCl, 50mM EDTA,
3%SDS, 1% - mercaptoethanol.

Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1).
3M sodium acetate (pH5,2).
Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0.
3.2.2.2. Các hoá chất dùng trong điện di
Gel agarose, thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1% agarose.
Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy
điện di với thành phần nhƣ sau:
Tris HCl 4,48 g
Na
2
EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml
Glacial acetic acid 1,14 ml
Nƣớc cất vừa đủ 1 lít
Dung dịch nhuộm gel là Ethidium bromide 1%.
Ladder 1.5kb, 1kb.
3.2.2.3. Hoá chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp)
Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl.
Dung dịch đệm 10X: đi kèm với Taq.
dNTP 10 mM.
MgCl
2
50 mM.
Primer 1 (METPR1).
Primer 2 (METPR4).
Primer 3 (METPR2).
Primer 4 (METPR5).
3.2.2.4. Môi trƣờng
Môi trƣờng PGA.
Môi trƣờng Agar.
Môi trƣờng lỏng CZA.

20

3.2.3. Các thiết bị chính
Các dụng cụ và thiết bị cần thiết cho một phòng thí nghiệm sinh học
phân tử.
Máy đo pH.
Máy lắc.
Máy ly tâm lạnh.
Máy khuấy từ.
Bộ điện di ngang HorizonR 558 (Life Technologies).
Máy PCR (PTC – 100 Programable Thermal Controller, MJ Raearch).
Máy vortex .
Máy chụp hình gel Bio –Rad.
Máy đọc trình tự ABI PRISM 3100.
3.3. Nội dung nghiên cứu
1. Phục hồi 2 chủng nấm Metarrhizium anisopliae vaø Beauveria bassiana
trên một số sâu hại cây trồng.
2. Sử dụng kỹ thuật PCR phát hiện gen liên quan tới tính độc của 2 chủng
nấm Metarrhizium anisopliae, gen protease (Pr1) và Beauveria
bassiana, vùng ITS1 -5.8S – ITS2
3. Xác định tính đa dạng di truyền của gen Pr1 và gen ITS1 - 5.8S - ITS2
trên nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana vuille bằng
phƣơng pháp RFLP và phƣơng pháp giải trình tự (Sequencing).
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu:
3.4.1 Phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA:
Nấm đƣợc thu thập từ nhiều địa phƣơng khác nhau nhƣ : Bến tre.Tiền Giang,
long An, Đồng Tháp, Quận 9, Quận 2 TP Hồ Chí Minh,…trên một số côn trùng gây

hại nhƣ: Rầy Nâu, Bọ Dừa, Bọ Xích Đen,…đƣợc bảo quản trong ống nghiệm dể phục
hồi sức sống cho nấm chúng tôi tiến hành cấy chuyền nấm sang môi trƣờng
PGA(potato –glucose – agar).
- Thành phần môi trƣờng phục hồi: (PGA)cho 1lít
+ Glucose: 20g.
+ Khoai tây: 200g.
21

+ Agar: 18-20g.
+ Nƣớc cất1lần: 1lít.
- Cách nấu: nấu khoai tây với 1lít nƣớc khỏang 1h cho mềm, vớt bỏ xác lấy
nƣớc đong lại cho đủ 1lít (nếu thiếu cho thêm nƣớc cất)sau đó cho agar và glucose
vào nấu cho tan, đem hấp môi trƣờng bằng Autoclay 121
0
C 15phút, để nguội bớt đỗ
lên dĩa dã tịêt trùng (sấy ở 200
0
C trong 1h), khỏang 15ml để chuẩn bị cấy chuyền.
- Cách cấy:dùng que cấy đã khử trùng bằng đèn cồn cấy lên 4 điểm, cấm sâu
vào bề mặt thạch, sau 5-7 ngày nấm phát triển mạnh lúc này có thể sử dụng nấm để
nhân sinh khối.
3.4.2 Chuẩn bị môi trƣờng lỏng nhân sinh khối sợi nấm
Các mẫu phục hồi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng lỏng CZA (Czapek- Dox)
(Tuite, 1969):
- Glucose 10g.
- Dịch chiết nấm men (Yeast extract) 1.5g.
- KH
2
PO
4

0.025g.


- K
2
HPO
4
0,25g.
- MgSO
4
.7H
2
O 0.25g.
- Một lƣợng nhỏ vài mg NACL.
. - Nƣớc cất : 500ml.
Tất cả cho vào cốc 500 ml nƣớc cất vô trùng và đặt vào máy khuấy từ nấu
khoảng 20 phút. Sau đó đổ vào 10 bình tam giác, mỗi bình 50 ml đem hấp khử trùng
20 phút. Sợi nấm đƣợc băm nhỏ trực tiếp từ bề mặt của môi trƣờng PGA cho vào bình
chứa môi trƣờng lỏng, để vào máy lắc điều chỉnh ở mức 170 vòng khoảng từ 3-5ngày,
sau đó ta thu đƣợc khối sợi nấm là những hạt tròn nhỏ li ti. Lọc lấy khối sợi nấm này
qua giấy lọc (đã đƣợc khử trùng) và làm khô. Đặt khối sợi nấm vào giấy bạc và giữ ở
-80
o
C.
3.4.3 Phƣơng pháp ly trích DNA
Quy trình tách chiết đƣợc cải tiến theo hƣớng đơn giản nhƣng vẫn đạt đƣợc hiệu
quả tốt trong sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng PCR (Leal, 1994) nhƣ sau:
- Đặt 1g sợi nấm đƣợc làm khô kiệt vào cối và nghiền nát trong dung dịch
nitơ lỏng. Sau khi nghiền xong chuyển dung dịch này sang một eppendorf thể tích 1,5
ml. Lƣu ý trong công đoạn này cố gắng giữ cho bột nấm đƣợc nghiền không tan .

22

- Thêm 400 l Lysis buffer, trộn đều hỗn hợp và đem ủ khoảng 1 giờ
ở 65
o
C.ở giai đọan này để đạt hiệu quả tốt có thể ủ thời gian kéo
dài hơn làm quá trình phá vỡ màng DNA tốt hơn.
- Lấy ống nghiệm ra khỏi dung dịch nƣớc ấm. Thêm vào khoảng
300 l Phenol:Chloroform: Isoamyl: alcohol (25:24:1)lắc nhẹ
nhiều lần, dung dịch lúc này có màu trắng đục nhƣ sữa.
- Ly tâm 20 phút 13500 vòng ở nhiệt độ phòng 28
0
C.
- Thu dung dịch (phần trên ống nghiệm ) sang một ống nghiệm khác,
chất kết tủa DNA bởi sự thêm vào với thể tích tƣơng ứng 0.03 mol
của 3M Sodium acetate và 0.5 mol của Isopropanol (tƣơng ứng
khỏang 15ml Sodium acetate : 250ml Isopropanol), trộn nhẹ nhàng
nhiều lần. Lúc này DNA kết tủa thành những sợi có màu trắng đục.
- Ly tâm 13500 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng 28
0
C.
- DNA kết tủa nằm dƣới đáy eppendorf, nhẹ nhàng dổ bỏ dịch nổi
phía trên, dùng ethanol 70% rửa DNA khoảng 3 lần, mỗi lần
khoảng 300 l.
- Làm khô DNA ờ nhiệt độ phòng khỏang 2h, hoà tan DNA trong
khỏang 80µl dung dịch TE 1X, đánh tan DNA và tồn trữ mẫu ở
. +4
o
C hoặc -20
o

C cho đến khi sử dụng.
- Điện di kiểm tra kết quả bằng bộ điện di ngang trên gel agarose,
nồng độ gel 0.8%.
*LƢU Ý: cần phơi DNA khô trƣớc khi cho TE 1X vào để bảo quản mẫu, vì
Ethanol dễ phá hủy DNA nếu trữ mẫu lâu
3.4.4 Phƣơng pháp tinh sạch DNA
Các bƣớc tinh sạch DNA bằng RNAse nhƣ sau:
Cho hỗn hợp DNA pha loãng với nƣớc vào eppendorf (theo tỷ lệ 1:3)
Thêm vào 2 l RNAse vào hỗn hợp lắc nhẹ nhàng.
Ủ ở 37
0
C khoảng 30 phút.
Thêm vào 2 l Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), lắc nhẹ
nhàng nhiều lần .
Ly tâm lấy phần dịch nổi phía trên sang ống khác.