Luận văn : SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI part 1 pot

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



TRẦN NHƢ NGỌC

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium
anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ
SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI



LUẬN VĂN: KĨ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC






Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

SỬ DỤNG KỸ THUẬT RFLP XÁC ĐỊNH SỰ ĐA
DẠNG DI TRUYỀN CỦA NẤM Metarrhizium
anisopliae VÀ NẤM Beauveria bassiana KÝ
SINH TRÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI


LUẬN VĂN: KĨ SƢ
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN
VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC
KHÓA: 28



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006


MINISTRY OF EDUCATION AND TRAING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
FACULTY OF BIOTECHNOLOGY

***000***




RFLP ANALYSIS OF POLYMORPHISMS IN
Metarrhizium anisopliae AND Beauveria bassiana
ACCOSIATED WITH INSECT


GRADUATION THESIS
MAJOR: BIOTECHNOLOGY



PROFESSOR STUDEN
VÕ THỊ THU OANH TRẦN NHƢ NGỌC
TERM: 28





HCMC 9/2006

iii
LỜI CẢM TẠ

Xin chân thành gửi lời cảm tạ đến:
 Ban Giám Hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

 Ban chủ nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô
đã truyền đạt kiến thức cho chúng tôi.
 ThS. Võ Thị Thu Oanh đã hƣớng dẫn tận tình cho tôi trong suốt quá
trình thực tập và giúp tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
 TS. Bùi Minh Trí –Trƣởng trung tâm phân tích Hóa – Sinh trƣờng Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
 Phòng thí nghiệm Hóa – Sinh thuộc Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm
Trƣờng Đại Học Nông Lâm.
 Các anh chị làm việc tại Trung Tâm Phân Tích Hóa – Sinh, đặc biệt gửi
lời cảm ơn chân thành đến chị Hƣng đã hết lòng giúp đỡ, chia sẽ và
động viên tôi trong suốt thời gian làm khóa luận.
 Các bạn sinh viên thực tập tại phòng 105 – khu Phƣợng Vĩ Trƣờng Đại
Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ tôi.
 Các bạn bè thân yêu của lớp Công Nghệ Sinh Học K28 đã chia sẻ cùng
tôi những vui buồn trong thời gian học cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ
tôi trong thời gian thực tập.













TĨM TẮT

Đề tài nghiên cứu:“ sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của
hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana” ký sinh trên cơn trùng
gây hại ” đƣợc thực hiện từ ngày 20 tháng 2 năm 2005 đến ngày 15 tháng 8 năm 2005
tại trƣờng Đại Học Nơng Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Đề tài do Trần Nhƣ Ngọc thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn của ThS. Võ Thị Thu
Oanh
Đối tƣợng nghiên cứu là nấm Metarrhizium anisopliae và nấm Beauveria
bassiana ký sinh trên cơn trùng gây hại. Nấm này có tác dụng tiết ra độc tố làm ngừng
hoạt động của ruột, phá vở các hoạt động bình thƣờng của cơn trùng dẫn đến cơn trùng
bị chết khơ
Mục đích đề tài nhằm xác định đoạn gen gây độc Pr1 của những dòng nấm
Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana
giúp chọn lọc đúng những dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana
có tính độc đảm bảo hoạt tính diệt cơn trùng lâu dài và hiệu quả nhằm phục vụ cho sản
xuất nơng nghiệp .
Các nội dung nghiên cứu bao gồm:
1. Phục hồi các chủng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassian
trên một số cơn trùng gây hại .
2. Dùng kỹ thuật PCR phát hiện gen protease (Pr1) và vùng ITS1 – 5.8S –
ITS2 liên quan đến tính độc của hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và
Beauveria bassiana
3. Sau khi thực hiện phản ứng PCR ta sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng
enzyme cắt giới hạn để phát hiện sự đa hình trong phạm vi vùng IST1-5.8S-IST2 của nấm
Beauveria bassiana và vùng Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae
4. Giải trình tự đoạn gen Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 so sánh trình tự này
với các mẫu trên ngân hàng gen thế giới (genbank).
Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
1.Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trên mơi PGA:

Sau quá trình phục hồi các nguồn nấm trên môi trƣờng PGA(Potato-Glucose-
Agar),kết quả chúng tôi đã thu đƣợc một số dòng nấm sau khoảng 7-10 ngày nuôi cấy :
RNBT1.7 ,DONG 3.1, BXĐTG6, RMTĐ3 ,PULQ2, NNPT7, SR, BRVT6 ,BHBD6
,SCLLLA1, BDTN4 ,BDQ96 .
2.Nhân sinh khối các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria trong môi trƣờng
lỏng Czapek – Dox trong khoảng thời gian từ 3-5 ngày , thu đƣợc sinh khối nấm ,rửa
lại với nƣớc cất rồi phơi khô , nghiền trong nitơ lỏng ,cuối cùng chúng tôi đƣợc nấm ở
dạng khô và chúng tôi bảo quản nấm -80
0
C cho đến khi sử dụng .
3.Tiến hành ly trích nấm đã bảo quản ở trên bằng dịch ly trích ,kết quả trích
đƣợc DNA của 12 dòng nấm Metarrhizium và Beauveria ,sau đó là tinh sạch DNA của
các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria nhằm tạo sản phẩm sạch ,ít tạp trong sản
phẩm PCR.Sau tinh sạch vẫn giữ đƣợc DNA của 12 mẫu nấm.
4.Thực hiện phản ứng PCR trên các dòng nấm Metarrhizium và Beauveria , kết
quả thu đƣợc sản phẩm PCR của 6 dòng nấm Beauveria
5.Phân tích RFLP , thực hiện phản ứng cắt bằng enzyme cắt giới hạn trên 6
dòng nấm Beauveria ,enzyme cắt Alu I, Hae III trên các sản phẩm PCR .kếtquả chƣa
nhận thấy rõ sự đa dạng di truyền của các dòng nấm do mức độ tƣơng đồng giữa các
dòng nấm khá cao .Tuy nhiên thu đƣợc kích thƣớc các band trên gel so với Ladder là
hoàn toàn trùng khớp với kích thƣớc band DNA chuẩn của các dòng nấm Beauveria .

MỤC LỤC


CHƢƠNG
TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Mụclục vi
Danh sách chữ viết tắt ix
Danh sách các bảng x
Danh sách các hình xi

1. MỞ ĐẦU 1
1.1.Đặt vấn đề 1
1.2.Mục đích và yêu cầu đề tài 1
1.2.1.Mục đích 1
1.2.2.Mục tiêu 2
1.3.Yêu cầu nghiên cứu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1.Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học 3
2.2.Giới thiệu về nấm ký sinh 4
2.2.1.Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae 5
2.2.2.Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana vuille 6
2.3.Hiệu quả phòng trừ bằng chế phẩm nấm 8
2.4.Sơ lƣợc về phƣơng thức xâm nhiễm 9
2.5.Hoạt tính sinh học 11

2.6.Một số nghiên cứu trong và ngoài nƣớc 11
2.6.1.Nghiên cứu trong nƣớc 11
2.6.2.Nghiên cứu ngoài nƣớc 12
2.7.Vai trò của protease Pr1 và vùng ITS1 – 5.8S – ITS2 14
2.8.Phản ứng PCR 14
2.8.1.Giới thiệu chung về PCR 14
2.8.2.Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả PCR 15
2.8.3.Các ứng dụng của phƣơng pháp PCR 16
2.8.4. Những hạn chế của phƣơng pháp PCR 16
2.9. Đọc trình tự bằng máy đọc tự động 17
2.10.Phân tích RFLP 17
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1.Thời gian và địa điểm 19
3.1.1.Thời gian 19
3.1.2.Địa điểm 19
3.2. Vật liệu và hóa chất 19
3.2.1.Vật liệu 19
3.2.1.1.Mẫu thí nghiệm 19
3.2.1.2.Các Primer dùng trong thí nghịêm 19
3.2.2.Hóa chất và môi trƣờng 19


3.2.2.1.Các hóa chất dùng chiết tách DNA từ khối sợi nấm 19
3.2.2.2. Các hóa chất dùng trong điện di 20
3.2.2.3. Các hóa chất dùng trong phản ứng PCR 20
3.2.2.4.Môi trƣờng 20
3.2.3.Các thiết bị chính 21
3.3.Nôi dung nghiên cứu 21
3.4.Phƣơng pháp nghiên cứu 21
3.4.1.Phục hồi các chủng nấm 21

3.4.2.Chủân bị môi trƣờng lỏng 22
3.4.3.Phƣơng pháp ly trích DNA 22
3.4.4.Phƣơng pháp tinh sạch DNA 23
3.4.5.Thực hiên phản ứng PCR 24
3.4.5.1.Nấm Metarrhizium anisopliae 24
3.4.5.2.Nấm Beauveria bassiana vuille 25
3.4.6.Điện di và đọc kết quả 26
3.4.6.1.Điện di trên gel agarose 26
3.4.6.2.Đọc kết quả điện di 26
3.4.7.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27
3.4.7.1.Tinh sạch sản phẩm PCR 27
3.4.7.2.Thành phần phản ứng đọc trình tự 27
3.4.8.Tinh sạch sản phẩm đọc trình tự 28
3.4.9.Điện di và ghi nhân kết quả 29
3.4.10. Phân tích RFLP 29
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
4.1. Kết quả phục hồi và nhân sinh khối nấm 30
4.2. Kết quả ly trích DNA 30
4.3. Kết quả tinh sạch DNA 32
4.4. Kết quả PCR 33
4.5. Kết quả phân tích RFLP 34
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 36
5.1.Kết luận 36
5.2.Đề nghị 36
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 37

DANH SÁCH CÁC HÌNH


HÌNH TRANG
Hình 2.1 Chế phẩm sinh học từ nấm Beauveria và Metarrhizium 9
Hình 2.2 Nấm Beauveria bassiana vuille ký sinh trên ong 13
Hình 4.1 Nấm Beauveria và Metarrhizium 30
Hình 4.2 Kết quả ly trích 31
Hình 4.3 Kết quả tinh sạch 32
Hình 4.4:Kết quả PCR 34
Hình 4.5:Kết quả phân tích RFLP 35

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BDQ96 : Bọ dừa Quận 9 6
BDTN4 : Bọ dừa Tây Ninh 4
SCLLLA1 : Sâu cuốn lá lúa Long An 1
RNBT1.7 : Rầy nâu Bến Tre 1.7
DONG3.1 : Dòng 3.1
BXĐTG6 : Bọ xít đen Tiền Giang 6
RMTĐ3 : Rầy mềm Thủ Đức 3
PULQ2 : Rệp vải mềm nâu tím Quận 2
SR : Sâu róm
BRVT6 : Bọ rầy Vũng Tàu 6
BHBD6 : Bọ hà Bình Dƣơng 6
PM : pico mol
Ng : nano gram
nm : nano mol
g : micro gram
m : micro mol
M : micro mol/lít
l : micro lít
TE : tris EDTA
dNTP : deoxyribonucleotide – 5 – trphosphate
TAE : tris acetic EDTA
UI : unit international
bp : base pair
Kb : kilo base
CZA : Czapek – Dox
SDS : Sodium dodecyl sulphate
PGA : Potato glucose agar
SDA : Soduim dedocyl sulphate

RFLP : Restriction Fragment Lengh Polymorphism
RAPD : Random Amlification of Polymorphic DNA
Tm : melting temperature
PCR : Polymerase Chains Reaction
RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism
EDTA : Ethylene Diamine Tetracetic Acid
ITS : Intenal Transcribed Spacer
Taq : Thermus aquaticus
TAE : Tricacetic ethylene diamine tetra acetat
TE : Tris ethylene diamine tetra acetate





ix



DANH SÁCH CÁC BẢNG


BẢNG TRANG
Bảng 3.1:Thành phần phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium 24
Bảng 3.2:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Metarrhizium 25
Bảng 3.3: Thành phần phản ứng PCR ở nấm Beauveria 25
Bảng 3.4:Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR ở nấm Beauveria 26
Bảng 3.5:Thành phần phản ứng đọc trình tự 28
Bảng 3.6:Quy trình chung phản ứng cắt 29

1

Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay với tốc độ phát triển nhƣ vũ bão của khoa học và công nghệ đã kéo
theo hàng loạt những thay đổi trong đời sống xã hội của con ngƣời: kinh tế, chính trị,
xã hội,… rồi đến đời sống vật chất, tinh thần,… Thông qua đó đặt ra một vấn đề hết
sức cấp thiết làm sao giải quyết tốt vấn đề lƣơng thực thực phẩm cho con ngƣời. Thực
tế cho thấy việc áp dụng thành công trong khoa học – công nghệ vào sản xuất nông
nghịêp nhằm nâng cao năng xuất cây trồng đã đƣợc ứng dụng từ nhiều năm nay và đã
đem lại nhiều kết quả đáng kể nhƣ: tạo giống bƣởi không hạt, bƣởi da xanh có chất
lƣợng tốt, mùi vị ngon, ngọt và không xử lý hóa chất (Viện Cây Ăn Quả Miền Nam);
hay tạo giống lúa ngắn ngày có khả năng chống chịu tốt, hạt gạo mềm, dẻo, thơm, đặc
biệt là năng suất tăng so với nhiều giống trƣớc đó bằng việc xử lý yếu tố di truyền
trong gen (Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long )….Đây chính là những thành tựu
trong lĩnh vực Bảo Vệ Thực Vật nói chung và của Công nghệ Sinh học nói riêng .
Chính vì tính chất quan trọng của ngành Bảo Vệ Thực Vật (cũng nhƣ Công
Nghệ Sinh Hoc) trong Nông Nghiệp và đời sống, nên chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Sử dụng kỹ thuật RFLP xác định sự đa dạng di truyền của các dòng nấm
Metarrhizium anisopliae và Beauveria basiana ký sinh trên côn trùng gây hại”. Từ
việc xác định chính xác trình tự của nucleotide trên gen phát sinh độc tố của nấm ký
sinh trên côn trùng gây hại cho hoa màu, ta có thể chủ động hơn trong quá trình tác
động lên gen gây độc, nhằm diệt nấm đạt hiệu quả cao nhất, giảm thiệt hại do côn
trùng phá hoại, nâng cao năng suất cây trồng, tạo sản phẩm sạch, an toàn và thân
thiện với môi trƣờng.
1.2. Mục đích và yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích

Làm cơ sở khoa học cho việc xác định đa dạng di truyền và xác định gen gây
độc nhằm tạo ra đƣợc thuốc trừ sâu sinh học có hoạt tính ổn định và hiệu quả đối với
từng loại cây trồng, đáp ứng nhu cầu trong công tác bảo vệ thực vật hiện nay.


2

1.2.2. Mục tiêu
Bằng kỹ thuật RFLP và đọc trình tự cho phép xác định gen Pr1 và vùng gen
ITS1 - 5.8S - ITS2 sau đó tìm sự khác biệt trong trình tự nucleotide của đoạn gen Pr1
giữa các dòng nấm Metarrhizium anisopliae, và trình tự nucleotide của vùng gen
ITS1- 5.8S -ITS2 giữa các dòng nấm Beauveria bassiana.
1.2.3. Yêu cầu nghiên cứu
Phục hồi các dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana từ
nhiều cây trồng khác nhau.
Phát hiện gen gây độc Pr1 của nấm Metarrhizium anisopliae và vùng ITS1 –
5.8S – ITS2 của nấm Beauveria bassiana bằng phƣơng pháp PCR.
Sử dụng kỹ thuật RFLP thực hiện phản ứng enzyme cắt giới hạn để phát hiện
sự đa hình trong phạm vi vùng gen độc Pr1 của các dòng nấm Metarrhizium
anisopliae và ITS1 – 5.8S – ITS2 của các dòng nấm Beauveria bassiana.
Xác định trình tự nucleotide của vùng gen gây độc Pr1 và ITS1 – 5.8S – ITS2
trên hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria basisiana.
1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Một số loài thuộc hai dòng nấm Metarrhizium anisopliae và Beauveria bassiana
vuille thu thập ở các tỉnh thành khác nhau nhƣ: Long An, Trà Vinh, Tây Ninh, Tiền
Giang, Bến Tre, Quận 2 thành phố Hồ Chí Minh, Quận 9 thành phố Hồ Chí Minh gây
hại cho côn trùng trên các đối tƣợng cây trồng khác nhau.

3

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vai trò của biện pháp phòng trừ sinh học trong bảo vệ thực vật hiện nay
Dƣới áp lực tạo ra nguồn sản phẩm nông nghiệp với sản lƣợng cao, chất lƣợng
tốt, giảm giá thành và giảm ảnh hƣởng đến môi trƣờng, chúng ta phải tăng cƣờng sử
dụng biện pháp sinh học một cách có hệ thống.
Quản lý dịch hại tổng hợp (IPM) trên cây trồng nông lâm nghiệp theo định
hƣớng tăng cƣờng sử dụng các tác nhân sinh học và chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc
là một hƣớng nghiên cứu ứng dụng mới mang lại hiệu quả kinh tế cao, góp phần xây
dựng một nền nông nghiệp bền vững, bảo vệ môi trƣờng và cân bằng sinh thái.
Có nhiều cách để sử dụng biện pháp sinh học, bao gồm:
Sử dụng ký sinh thiên địch chuyên tính, thƣờng là ký sinh.
Sử dụng ký sinh thiên địch không chuyên tính, thƣờng là các loài ăn thịt sâu
hại.
Biện pháp dòng hoá đực làm cho sâu hại không thể sinh sản đƣợc.
Sử dụng vi sinh vật có ích.
Biện pháp dẫn dụ giới tính để phòng trừ sâu hại.
Biện pháp sinh học trong IPM giúp cho việc loại bỏ một số nhƣợc điểm của các
biện pháp hoá học thƣờng dùng trƣớc đây.
Ƣu điểm của biện pháp vi sinh vật gồm:
Ngăn chặn sự phát triển tính kháng trong quần thể sâu bệnh và cỏ dại. Giảm bớt
hoặc giảm hoàn toàn sử dụng thuốc hoá học, giữ đƣợc quần thể sâu hại phát
triển ở mức thấp nhất, tránh bộc phát thành dịch.

Bảo vệ đƣợc côn trùng có ích và các vi sinh vật có ích khác, hạn chế sâu bệnh
thứ cấp trở thành sâu bệnh chính.
Bảo vệ đƣợc sức khỏe con ngƣời và tránh ô nhiễm môi trƣờng. (Trần Văn Mão,
2004).
2.2. Giới thiệu về nấm ký sinh trên côn trùng
Cũng nhƣ vi khuẩn, nhiều nấm liên quan với côn trùng nhƣ sinh vật cộng sinh
hoặc hoại sinh, nhƣng có nhiều loài nấm thực sự là ký sinh, gây hiện tƣợng bệnh lý và
dẫn đến sự chết của côn trùng. Theo Steinhaus (1949) (trích dẫn Nguyễn Lân Dũng,
4

1981) nấm ký sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết thƣờng xuyên với tỷ lệ cao
cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác nhân điều hoà quần thể vi sinh vật
trong tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận biết bằng mắt thƣờng,
vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ bề mặt ngoài của cơ thể côn
trùng. Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã, mà thƣờng giữ nguyên hình dạng
ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (Nguyễn Lân Dũng, 1981).Nấm
gây bệnh cho côn trùng thuộc nhiều nhóm nấm khác nhau: từ nhóm nấm nguyên thủy
sống dƣới nƣớc đến nhóm nấm bậc cao sống trên cạn. Nấm gây bệnh cho côn trùng có
mặt ở trong cả 4 lớp nấm: nấm bậc thấp Phycomycetes, nấm túi Ascomycetes, nấm
đảm Basidiomycetes và nấm bất toàn Deurteromycetes.
- Lớp nấm bậc thấp Phycomycetes: trong lớp nấm này, các loài ký sinh trên côn
trùng tập trung ở ba bộ: Chytridiales, Blastocladiales và Entomophthorales. Đặc biệt
có những họ nấm gồm tất cả các loài đều là ký sinh trên côn trùng nhƣ
Entomophthoraceae và Coelomomycetaceae.
- Lớp nấm túi Ascomycetes: trong lớp nấm túi có bộ Laboubiniades là những
nấm ngoại ký sinh côn trùng có chuyên tính cao, còn các loài nấm túi khác đều là nội
ký sinh của côn trùng. Những giống nấm quan trọng gây bệnh cho côn trùng là:
Cordyceps, Aschersonia (bộ Hypocreales).
- Lớp nấm đảm Basidiomycetes: trong lớp nấm đảm chỉ ở hai giống có các loài
gây bệnh trên côn trùng, đó là giống Septobasidium và Uredinella.

- Lớp côn trùng đều thuộc bộ Moniliades. Những giống Beauveria, Spicana,
Metarrhizium, Cephalosporium và Sorosporella chứa các loài nấm khi xâm nhiễm vào côn
trùng đã tạo thành độc tố và gây chết vật chủ trong khoảng thời gian nhất định.
2.2.1. Giới thiệu về nấm Metarrhizium anisopliae.
Metschinikov đã phát hiện nấm này đầu tiên vào năm 1878 trên bọ hung
hại lúa mì,Chúng gây bệnh cho côn trùng sống trong đất. Bào tử của nấm sau 24 giờ
tiếp xúc với bề mặt cơ thể côn trùng thì bắt đầu mọc mầm và xâm nhập vào bên trong
các bộ phận nội quan. Sau khi vật chủ chết, sợi nấm mọc ra ngoài cơ thể côn trùng tạo
thành lớp nấm màu trắng hơi hồng nhạt. Trên đó tạo thành các khuẩn lạc màu xanh
xám. Quá trình phát triển của bệnh trong cơ thể côn trùng là 4 – 6 ngày tùy thuộc vào
loài và tuổi vật chủ cũng nhƣ nguồn bệnh ban đầu. Vào giai đoạn cuối cùng của quá
trình phát triển bệnh lý thì côn trùng chết
5

- Nấm Metarrhizium anisopliae có 2 dạng: M. anisopliae var. major có bào tử
dài với kích thƣớc bào tử túi 10,0 – 14,0 (18,0) m và M. anisopliae var. anisopliae
có bào tử ngắn với kích thƣớc bào tử túi là 3,5 – 9.0(thƣờng 5,0 – 8,0) m. Nấm xanh
(nấm Metarrhizium anisopliae) sinh ra các độc tố destruxin A và B (Bùi Xuân Đồng,
Nguyễn Huy Văn, 2000).
- Nấm Metarrhizium anisopliae ký sinh trên 200 loài côn trùng thuộc các bộ:
Orthoptera (11 loài), Dermaptera (1 loài), Hemiptera (21 loài), Lepidoptera (27 loài),
Diptera (4 loài), Hymenoptera (6 loài) và Coloptera (134 loài). Nấm xanh có thể nuôi
cấy trên môi trƣờng thức ăn nhân tạo.
- Metarrhizium anisopliae là chủng gây bệnh mạnh nhất cho côn trùng thuộc bộ
Coleoptera. Hơn 204 loài côn trùng thuộc họ Elaleridae và Curculionidae bị nhiễm
bệnh bởi Metarrhizium anisopliae (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng
Giang, 1997). Ngoài ra Metarrhizium anisopliae còn gây bệnh trên ấu trùng muỗi
Aedes aegypti, Anopheles stephensi và Clex pipiens thuộc Diptera, côn trùng hại lúa
Scotinophara coarctata thuộc họ Heminoptera, châu chấu Schistocera gragaria thuộc
họ Testigolidae, loài mối Nasutitermes exitiosus thuộc họ Termitidae. Nấm này phân

bố rộng trong tự nhiên.
- M. anisopliae với bào tử dạng trụ và khuẩn lạc xanh đen hoặc đôi khi màu
tối hoặc hồng vỏ quế. Khuẩn lạc mọc chậm, trên môi trƣờng PGA sau 10 ngày
nuôi cấy ở 20
o
C có đƣờng kính 2 cm.
Đã có nhiều nghiên cứu về sự phân bố của chúng: Nepal, New Zealand, New
Caledonia, Bahamas, Mỹ, Canada, Bắc Ireland, Italia, Turkey, Liên Xô (cũ). Ở những
nơi không có côn trùng cũng phân lập đƣợc Metarrhizium anisopliae: nang của
Nematod (Heterodenas chachatii và Globodera rostochensis), các hạt ngoài đồng và
trong đất trồng ở Canada, đất trồng chuối ở Honduras, đất trồng dâu ở Braril, đất trồng
cỏ ở New Zealand. Ngay ở những nơi có thời tiết khắc nghiệt của nƣớc Đức, ở đất
rừng sau khi đốt cháy, trong chất thải hữu cơ (chuẩn bị ô nhiễm), trầm tích cửa sông,
đất đầm lầy trồng cây đƣớc, tổ của một số loài chim và rễ của dâu tây cũng đều phân
lập đƣợc Metarrhizium anisopliae.
* Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của nấm Metarrhizium anisopliae:
Không thể sinh trƣởng tốt trên nền cơ chất không có chitin.