Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật RT - PCR xác định Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) và Extra small virus (XSV) trên tôm càng xanh (Macrobrachium rosenbergii) part 2 docx

9















Hình 2.2: Vị trí của MrNV trong họ gia đình Nodavirius (Bonami và cộng sự, 2005).

Họ Nodaviridae chia làm hai nhóm: Alphanodavirus gây bệnh chủ yếu cho côn
trùng và Betanodavirus gây nhiễm cho cá. Thể virus này không có màng bao, hình đa
mặt, đƣờng kính 25 - 30 nm, bộ gen gồm hai sợi RNA(+) đơn. Trong đó, RNA - 1 (3,1
kb) mã hoá cho một protein không cấu trúc có kích thƣớc 100 kDa với chức năng nhƣ
là RNA polymerase. RNA - 2 (1,4 kb) mã hoá cho hai phân tử protein vỏ lớn có kích
thƣớc lớn khoảng 43 kDa và 41 kDa đƣợc hình thành do quá trình đồng sao chép một
chuỗi polypeptide. Một RNA - 3 cũng đƣợc phát hiện trong các tế bào bị nhiễm nhƣng
không tồn tại trong thể virus. Hiện nay, sản phẩm của RNA phụ này (0,4 kb) vẫn chƣa
xác định chức năng (Mori và cộng sự, 1992).
XSV là một satellite virus có kích thƣớc nhỏ hơn virus MrNV với đƣờng kính
15 nm, có vật liệu di truyền là RNA với chiều dài khoảng 0,8 - 0,9 kb (Qian và cộng

sự, 2003). Sau khi giải trình tự bộ gen của XSV cho thấy virus có chiều dài sợi đơn
RNA dài 796 nucleotide và đuôi ngắn poly (A) khoảng 15 - 20 nucleotide kết thúc ở
đầu 3’(GenBank acc.no.AY247793). Phân tích protein bằng SDS - PAGE cho thấy thể
XSV chứa hai polypeptide là capsid 17 kDa (CP - 17) và capsid 16 kDa (CP - 16)
(Qian và cộng sự, 2003). So sánh trình tự của CP - 17 của XSV với cấu trúc protein
của họ satellite virus đã biết từ trƣớc, kết quả cho thấy có sự khác biệt rất xa với họ
satellite virus (Ban,1995; Zhang và cộng sự, 1991).
Sự hiện diện đồng thời của XSV và MrNV trong bệnh trắng đuôi đặt ra giả
thuyết là vai trò mỗi virus nhƣ thế nào trong việc phát triển cũng nhƣ trong sự phát
SjNNV
AhNNV
GNNV
beta-nodaviruses
MrNV1B5A
PaV
alpha-nodaviruses

FHV


BoV

NoV
o
V

BBV


10

sinh mầm bệnh. Theo Widada và Bonami (2004) giả thuyết rằng XSV không có gen
mã hoá cho RNA polymerase. Vậy yếu tố nào cung cấp và cần cho XSV cộng hƣởng.
Hay XSV cộng hƣởng và làm giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh. Sự cộng hƣởng
này ít thấy trong những virus. Những virus cộng hƣởng (dependovirus) này vừa đƣợc
biết trong khoảng thời gian gần đây (Van Regenmortel và cộng sự, 2000), và chúng
phụ thuộc vào hiệu quả sự sao chép của những virus giúp đỡ (helper virus) nhƣ
adenovirus hoặc herpes virus. Những virus giúp đỡ này có đƣờng kính 20 nm, có vật
liệu di truyền là ss - DNA (4,7 kb), chứa một gen DNA polymerase. Một nhóm virus
khác là thể satellite virus, nhóm virus này thì sống sót khi thiếu một gen polymerase
cần cho sự sao chép của chúng (Van Regenmortel và cộng sự, 2000). Điều này cho
thấy là XSV sử dụng enzym RNA polymerase của MrNV nhƣng XSV sẽ mã hoá một
chức năng cần thiết cho sự phát triển của MrNV hay làm phát sinh thêm mầm bệnh
của MrNV thì không biết đƣợc (Widada và Bonami, 2004). Nhƣng XSV thiếu một
enzym sao chép thì XSV thật sự là một satellite virus (Widada và Bonami, 2004).
XSV liên quan gần phân nhóm 2 (tobacoo nercrosis satellite virus - like) hơn là phân
nhóm 1 (chronic bee - paralysis associated satellite virus - like) của satellite virus. Đến
bây giờ các nhà khoa học chỉ quan sát đƣợc những satellite virus trong những ký chủ
là thực vật. XSV là kiểu virus satellite đầu tiên đƣợc báo cáo là gây bệnh trong động
vật. XSV cũng đƣợc ghi nhận là satellite-nodavirus cộng hƣởng đầu tiên (Widada và
Bonami, 2004).

2.3. NHỮNG PHƢƠNG PHÁP DÙNG TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐUÔI
TRẮNG DO VIRUS GÂY RA TRÊN TÔM CÀNG XANH
2.3.1. Phƣơng pháp mô học.
Mẫu phải đƣợc cố định trong Davidson trong 24 giờ. Cắt thành từng lát mỏng
rồi đặt trên lam kính, nhuộm bằng Pryonin methyl green, đậy lam và quan sát tiêu bản
trên kính hiển vi thấy thể vùi của virus có hình mắt lƣới trong mô tế bào kế cận của tất
cả các cơ quan và các mô (Tung và cộng sự, 1999). Thể vùi của virus MrNV nằm
trong nhân tế bào hồng cầu bắt màu xanh với thuốc nhuộm Pryonin methyl green
(Tung và cộng sự, 1999).

11
2.3.2. Phƣơng pháp lai Dot - blot
Probe sử dụng trong phƣơng pháp lai Dot - blot là một đoạn DNA thu đƣợc
từ RNA - 1 của MrNV. Đoạn DNA đƣợc đánh dấu bằng phƣơng pháp PCR với tác
nhân digoxygenine. Probe này lai với đoạn RNA - 1 từ mô bị nhiễm hoặc từ dịch chiết
virus. Mỗi mẫu (1 l) là mỗi điểm trên màng lai. Sau khi qua các công đoạn xử lý
bằng dung dịch lai (hybridization) và tiền lai (prehybridization), mẫu dò đƣợc thêm
vào để quá trình lai xảy ra, rửa phần mẫu dò không lai ra khỏi màng lai. Tiếp đó thêm
vào phản ứng kháng thể kháng DIG (anti digoxygenine antibody) có gắn enzyme
alkaline phosphatase, ở quá trình này nếu có sự hiện diện của mẫu dò thì kháng thể sẽ
kết hợp với mẫu dò. Cuối cùng loại bỏ phần kháng thể không phản ứng và thêm cơ
chất của enzyme alkaline phosphatase để thực hiện phản ứng tạo màu ngay trên màng
lai. Phản ứng dƣơng tính (tạo màu) chỉ xảy ra khi có RNA của MrNV trên màng lai
(Widada và cộng sự, 2003).

2.3.3. Phƣơng pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Mẫu tôm càng xanh đƣợc cố định Davidson và đƣa vào trong paraffin. Mẫu
tôm đƣợc cắt khoảng 7 m và đƣợc đặt trên lam kính và đƣợc làm khô trong tủ sấy ở
(60
0
C). Lát cắt qua nhiều bƣớc xử lý, cho lai với mẫu dò DNA đƣợc đánh dấu
digoxigenin có gắn Alkaline phosphatase (AP), Anti - Digoxigenin sẽ kết hợp với
Digoxigenin theo nguyên tắc phản ứng kháng nguyên - kháng thể. Sau bƣớc này
những phân tử lai đặc hiệu giữa DNA/RNA của mẫu đính trên lame và mẫu dò đƣợc
gắn thêm Anti - DIG kết hợp với enzyme Alkaline phosphatase. Sau bƣớc rửa Anti -
DIG thừa và nhuộm màu, quan sát dƣới kính hiển vi thấy những tế bào kết tủa màu tím

đen, màu này cho biết sự hiện diện tƣơng ứng RNA của MrNV, mẫu âm tính có màu
vàng cam sau quá trình lai. Việc kết tủa đã đƣợc quan sát trong tế bào chất, vài phản
ứng dƣơng thì cũng đƣợc quan sát xung quanh vùng cơ hoại tử. Không có dấu hiệu của
virus đƣợc quan sát trong mang, gan, tụy tạng hoặc biểu mô ống tiêu hoá và biểu bì cơ
(Widada và cộng sự, 2003).





12









Hình 2.3: Lai tại chỗ bằng cách sử dụng probes MrNV (Widada và cộng sự, 2003).
Hình a: tổng thể phần đầu ngực của tôm postlarvae bị nhiễm MrNV.
Phần 1a: vùng mang không bị nhiễm có màu vàng cam.
Phần 2a: vùng đầu ngực bị nhiễm MrNV có màu tím đen.
Phần 3a: vùng tụy tạng không bị nhiễm có màu vàng cam
Hình b: lai dƣơng tính với những sợi cơ.
phần 1b: vùng cơ bị nhiễm MrNV có màu tím đen.

2.3.4. Phƣơng pháp Sandwich - ELISA (A sandwich enzyme linked immunosorbent
assay)

Kỹ thuật này phát triển bởi Romestand và Bonami (2003) để chẩn đoán bệnh
trắng đuôi của tôm càng xanh, nguyên nhân gây ra bởi MrNV. Kháng thể đa dòng sản
xuất bằng gây sự miễn dịch trên chuột Balb/C và sau đó tinh sạch dung dịch nổi của
virus và kháng thể kháng MrNV, dịch nổi chứa kháng thể kháng MrNV đƣợc tinh sạch
từ dịch tràng ở màng bụng của chuột. Kháng thể đầu tiên bắt kháng nguyên và kháng
thể thứ hai có gắn cơ chất, dƣới tác dụng của enzym avidin - peroxidase conjugate
phản ứng với cơ chất tạo màu, sự tạo màu này cho thấy phản ứng xảy ra. Đây là một
phƣơng pháp chẩn đoán bệnh trắng đuôi nhanh, độ đặc hiệu và độ nhạy cao.

2.3.5. Phƣơng pháp PCR
2.3.5.1. Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
2a
3a
1a
1b


13
Phƣơng pháp PCR do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985 cho phép làm
tăng bội DNA cần đƣợc nghiên cứu. PCR đƣợc thực hiện in vitro theo con đƣờng
enzyme (Bùi Trang Việt, 2002).
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ
mạch khuôn đều cần hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA
ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase
sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đã đƣợc hình thành dựa
vào cấu trúc đặc tính đó của các DNA polymerase. Thực vậy, nếu ta cung cấp hai mồi
chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn
DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác
định, ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên
biệt, các mồi này gồm mồi xuôi (sens primer), mồi ngƣợc (antisnes primer).

2.3.5.2. Phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi những chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bƣớc:
Bƣớc 1: giai đoạn biến tính (denaturation), trong một dung dịch phản ứng bao
gồm các thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính cao hơn Tm
của phân tử; thƣờng là 94 - 95
0
C trong 30 - 60 giây. Mạch đôi DNA tách thành mạch
đơn.
Bƣớc 2: giai đoạn lai (anealation) nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn Tm của các mồi,
cho phép các mồi bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động
trong khoảng 40 - 70
0
C, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 - 60 giây.
Bƣớc 3: giai đoạn tổng hợp (elongation), nhiệt độ đƣợc tăng lên 72
0
C giúp
cho DNA polymerase (polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt nhất. Thời gian
của bƣớc này tùy thuộc vào độ dài trình tự DNA cần khuếch đại, thƣờng kéo dài từ 30
giây đến nhiều phút.
Một phản ứng PCR không vƣợt quá 50 chu kỳ. Vì phản ứng PCR diễn tiến qua
hai giai đoạn, trong giai đoạn đầu số lƣợng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với
lƣợng mẫu ban đầu, sau đó kết quả khuếch đại giảm hẳn nên số chu kỳ cho một phản
ứng tuỳ thuộc vào số lƣợng bản mẫu ban đầu.

2.3.5.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR


14
DNA mẫu:

Phản ứng khuếch đại tối ƣu xảy ra trên DNA thật tinh sạch, nhiều kỹ thuật
chẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế
bào. Ngoài ra phƣơng pháp PCR còn có một số ƣu điểm là có thể khuếch đại cả những
mẫu DNA không đƣợc bảo quản tốt.
Enzyme
Taq - polymerase chịu nhiệt đƣợc tách chiết từ vi khuẩn suối nƣớc nóng
Thermus aquaticus. Enzym này không bị phá huỷ bởi nhiệt biến tính và xúc tác sự
tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản ứng. Tth polymerase là một enzym tách chiết
từ Thermus thermophilus, có khả năng hoạt động nhƣ một enzym phiên mã ngƣợc khi
có mạch RNA khuôn và ion Mn
++
, nhƣng với sự hiện diện của của DNA khuôn và ion
Mg
++
, Tth - polymerase lại xúc tác cho phản ứng khuếch đại DNA. Enzym này cho
phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
Nồng độ enzyme tối ƣu trong khoảng 1 -> 5 đơn vị trên một phản ứng.
Mồi và nhiệt độ lai:
Mồi là chỉ tiêu quan trọng để đạt đƣợc sự khuếch đại đặc trƣng, chuyên biệt
và có đặc hiệu cao. Việc chọn mồi phải tuân theo một số nguyên tắc:
 Trình tự của mồi đƣợc chọn sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa
mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, cũng không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp khác
nhau của một mồi.
 Nhiệt độ nóng chảy của mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc”, không cách nhau quá
xa. Thành phần nucleotide của các mồi cân bằng, tránh các cặp G - C lặp lại quá nhiều lần.
 Các mồi chọn cần phải đặc trƣng cho trình tự DNA cần khuếch đại,
không trùng với trình tự lặp lại trên gen.
 Trình tự nằm giữa mồi “xuôi” và mồi “ngƣợc” không quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ƣu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.

2.3.5.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide thƣờng đƣợc sử dụng ở nồng độ 20 - 200 M/mỗi
nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
các thành phần trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của
polymerase.


15
Mg
2+
là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là các DNA
polymerase chịu nhiệt. Nồng độ Mg
2+
ảnh hƣởng mạnh tới quá trình chạy PCR. Nồng
độ Mg
2+
quá thấp (< 0,5 mM) sẽ làm giảm phản ứng kéo dài mạch DNA do hoạt động
của Taq polymerase bị ức chế. Nồng độ Mg
2+
quá cao tuy ổn định mạch kép DNA
nhƣng lại hạn chế sự biến tính hoàn toàn sản phẩm trong mỗi chu kỳ dẫn đến giảm sản
phẩm cuối cùng. Quá thừa Mg
2+
dẫn đến sự bắt cặp sai giữa mồi và khuôn, kết quả là
tạo ra nhiều sản phẩm không đặc hiệu. Nồng độ tối ƣu Mg
2+
phải đƣợc xác định cho
từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm.

2.3.5.5. Số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR.

Trong thực tế sử dụng, số lƣợng chu kỳ phản ứng PCR không vƣợt quá 40
chu kỳ do sự phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng, sự xuất hiện các sản
phẩm phụ ức chế phản ứng, các bản sao vừa đƣợc tổng hợp thƣờng có khuynh hƣớng
kết hợp với nhau, kết quả là hiệu quả khuếch đại càng về sau càng giảm vì những
nguyên nhân sau:
 Sự phân huỷ cạn kiệt các thành phần phản ứng.
 Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng.
 Các bản sao kết hợp với nhau.
2.3.6. Phƣơng pháp RT - PCR (Reverse Transcription Polymerase Reaction)
Phƣơng pháp RT - PCR là sự kết hợp giữa phƣơng pháp phiên mã ngƣợc và
phƣơng pháp PCR. Phƣơng pháp này có thể phát hiện các mRNA tồn tại với lƣợng rất
thấp, mà không thể phát hiện bằng phƣơng pháp nhƣ Northern blot. Ngoài ra, RT-PCR
kết hợp với kỹ thuật RFLP có thể dễ dàng phát hiện ra các đột biến và sự đa hình trong
đoạn khuếch đại và xác định độ dài của gen biểu hiện khi một mRNA quan tâm biểu
hiện ở mức độ rất thấp. Nhờ RT - PCR sẽ khuếch đại mRNA bình thƣờng và mRNA đột
biến tạo thành các DNA, sau đó dùng cùng loại men cắt giới hạn, DNA bình thƣờng
phân biệt với DNA đột biến qua sự sai biệt trọng lƣợng phân tử (Bùi Trang Việt, 2002).
Do Taq polymerase sử dụng trong bƣớc PCR không hoạt động trên RNA nên
trƣớc hết cần chuyển RNA thành cDNA nhờ enzym phiên mã ngƣợc (reverse
transcriptase). Sau đó cDNA sẽ đƣợc nhân bản nhờ Taq polymerase (Walker, 2000).
Dấu hiệu xác định bệnh là sản phẩm nhân bản một đoạn gene đặc hiệu của virus. Sự
hiện diện của sản phẩm đƣợc nhận biết qua điện di trên gel agarose.


16
Các phương pháp khuếch đại RNA bằng PCR
 Oligo (dT) bắt cặp với đuôi poly (A) trên mRNA của động vật hữu nhũ ,
có thể dùng nhƣ mồi ngƣợc không đặc hiệu để tổng hợp sợi cDNA đầu tiên. Sau đó,
phản ứng khuếch đại bằng PCR sẽ rất có hiệu quả khi bổ sung thêm một hoặc nhiều
mồi xuôi đặc hiệu cho vùng gen mong muốn (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ;

Bespalova và cộng sự, 1998).
 Sự tổng hợp sợi cDNA đầu tiên có thể đƣợc thực hiện bằng một đoạn mồi
oligonucleotide bắt cặp đặc hiệu (gene - specific priming, GSP) với vùng đã đƣợc
chọn trên sợi RNA hoặc mRNA đặc trƣng GSP đƣợc gọi là mồi ngƣợc, sự khuếch đại
sau đó sẽ đƣợc bổ sung thêm một mồi xuôi tƣơng thích với trình tự đặc hiệu trên
cDNA (Frohman, 1995 ; Schaefer, 1995 ; Bespalova và cộng sự, 1998).
 Một đoạn gồm 6 nucleotide ngẫu nhiên có thể dùng làm mồi để tổng hợp
cDNA tại nhiều điểm dọc theo sợi RNA mẫu, tạo ra nhiều đoạn bản sao khác nhau trên
toàn bộ phân tử RNA. Phƣơng pháp này rất hữu dụng để khuếch đại sợi RNA quá dài
hoặc chứa nhiều cấu trúc bậc hai không thể tổng hợp bằng oligo (T) hoặc GSP (Lee và
Caskey, 1990).

Trong việc chẩn đoán bệnh trắng đuôi, phƣơng pháp Single - Step RT - PCR
dùng để khuếch đại RNA của hai virus ở trong cùng dung dịch tách chiết (Widada ,
2003, 2004 ; Sahul Hameed, 2004a và cộng sự). Phƣơng pháp này đƣợc tiến hành
bằng cách phiên mã ngƣợc và khuếch đại đoạn gen mong muốn trong một ống phản
ứng đơn cho mỗi virus (single reaction tube) bằng một chu kỳ nhiệt không liên tục. Kỹ
thuật này phát hiện MrNV bằng cách sử dụng một cặp mồi MrNV - RNA2 - F và
MrNV - RNA2 - R đặc hiệu cho RNA - 2 của MrNV đƣợc thiết kế từ trình tự của bộ
gen MrNV (Genbank accession no. AY222840) (Widada, 2003; Sahul Hameed và
cộng sự, 2004a). Phát hiện XSV bằng cách cặp mồi XSV - F và XSV - R đƣợc công
bố (Widada và cộng sự, 2004). Nguyên tắc phản ứng giống (hình 2.4) sử dụng hai mồi
MrNV - RNA2 - R và XSV - R là hai mồi ngƣợc sẽ bắt cặp với tƣơng ứng với RNA
của từng virus, sau đó sẽ tạo cDNA trong một thời gian, rồi gia nhiệt để bất hoạt
enzym phiên mã ngƣợc, chu kỳ tiếp tục đƣợc thực hiện cùng với hai mồi MrNV -
RNA2 - F và MrNV - RNA2 - R và XSV - F và XSV - R cho từng virus. Kích thƣớc
sản phẩm khuếch đại 681 bp là MrNV và 500 bp là XSV.


17

18





















Hình 2.4: Phƣơng pháp Single - Step RT - PCR để khuếch đại RNA bằng PCR
( Dieffenbach và Dveksler, 1995;Widada , 2003; Sahul Hameed và cộng sự,
2004a).


RNA tách chiết

Tổng hợp cDNA
MrNV
XSV
Tạo
cDNA
Bất hoạt
enzym RT

Khuếch đại
Tạo
cDNA
Bất hoạt
enzym RT

Khuếch đại
Tiếp tục chu kỳ
Tiếp tục chu kỳ
681 bp
500 bp


19
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 NỘI DUNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM
3.1.1. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR (Widada, 2003, 2004; Sahul
Hameed và cộng sự, 2004a) trên mẫu tôm càng xanh bệnh trắng đuôi đƣợc cung cấp từ Ấn
Độ.
 Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR nhƣ
phƣơng pháp tách chiết, nồng độ mồi, nhiệt độ lai của mồi.

 Ứng dụng qui trình khảo sát đƣợc kiểm tra sự hiện diện MrNV, XSV ở
một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa.
3.1.2. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Thời gian nghiên cứu: từ 7/3-7/8/2005.
Địa điểm thực hiện: Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trƣờng và Phòng
Ngừa Dịch Bệnh Thủy Sản Khu Vực Nam Bộ thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II.
3.2. VẬT LIỆU
3.2.1. Mẫu tôm
Các mẫu tôm càng xanh gồm: 30 mẫu ấu trùng, 2 mẫu postlarvae và 10 mẫu
tôm mẹ thu tại trại Thực Nghiệm Thủ Đức, 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL.
Trong các mẫu chúng tôi thu đƣợc có 8 mẫu tôm mẹ thu ở khu vực ĐBSCL và 1 mẫu
postlarvae có triệu chứng lâm sàng bệnh trắng đuôi .
Các mẫu tôm càng xanh đƣợc bảo quản trong tủ âm - 70
0
C.
3.2.2. Mồi sử dụng cho qui trình
Mồi đƣợc thiết kế bởi tác giả Yoganandhan và cộng sự (2005) dựa trên trình
tự của RNA virus (MrNV: Ac No. AY222840; XSV Ac No).

Bảng 3.1: Các mồi sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR

Virus
Primer
Trình tự
GenBank AC
Kích cỡ sản phẩm
MrNV
MrNV-RNA2-F
5’-GATACAGATCCACTAGATGACC-3’
AY222840

681 bp
MrNV-RNA2-R
5’-GACGATAGCTCTGATAATCC-3’
XSV
XSV-F
5’-GGAGAACCATGAGATCACG-3’
500 bp
XSV-R
5’-CTGCTCATTACTGTTCGGAGTC-3’


20

3.2.3. Hạt bead RT - PCR: READY - TO - GO (Chế phẩm sử dụng ngay)
Sản phẩm này do công ty Amersham pharmacia biotech, Mỹ sản xuất. Đây là
chế phẩm có sẵn các thành phần để thực hiện phản ứng RT - PCR, khi sử dụng ta chỉ
cần thêm bản mẫu và mồi sử dụng . Mỗi loại hạt Bead đƣợc thiết kế cho một phản ứng
với thể tích cuối 50 µl.
Thành phần của hạt bead gồm:
 2 đơn vị Taq DNA polymerase
 10 nM Tris - HCL (pH 9, nhiệt độ phòng)
 60 nM KCl
 1.5 mM MgCl
2

 20 M mỗi loại dNTP
 M - MulV Reverse Transcriptase
 RNA guard
TM

 Ribonuclease Inhibitor và chất ổn định không chứa Rnase/DNase

3.2.4. Bộ Kit AquaPure RNA Isolation Kit.
Bộ Kit này do công ty Bio - Rad sản xuất, dùng để tinh sạch RNA từ những
tế bào vi khuẩn và mô động vật. Thành phần của Bộ Kit gồm :
 RNA Lysis Solution
 Protein/DNA Precipitation Solution
 RNA Hydration Solution



21
3.2.5. Thang DNA X174 RF Hae III
Bảng 3.2: Thang DNA X174 RF Hae III
STT vạch
Kích thƣớc (bp)
1
1353
2
1078
3
872
4
603
5
310
6
281
7
271

8
234
9
194
10
118
11
72

3.2.6. Hoá chất khác
Trizol
Phenol (pH 4)
Guanidine thiocyanate 0,8 M
Ammonium thiocyanate 0,4 M
Sodium acetate, pH 5, 0,1 M
Glycerol 5%
 Ethanol 75%
 Isopropanol 100%
 Chloroform
 DEPC (Diethyl Prycacbonat)
 Ethidium bromide
 Dung dịch đặt mẫu (bromophenol blue 0,25%, glycerol 40%, Tris
HCL 200 mM, EDTA 200 mM)
 Agarose.
 TBE 1X (Tris - boric acid 40 nM, EDTA 0,1 mM).


22
 Nƣớc cất 2 lần có sử lý DEPC 1% (DEPC - H
2

O)

3.2.7. Dụng cụ và thiết bị
 Tủ cấy vô trùng (Laminar-Box)
 Tủ lạnh - 20
0
C (Liebherr)
 Tủ sấy dụng cụ 150
0
C (Gallenkamp)
 Máy Vortex (Zx
3
Velp)
 Máy ly tâm lạnh 15000 vòng/ phút (certrifuge 5415 C)
 Máy PCR (Thermocycle - Biorad)
 Bộ điện di (Biorab Hybaid)
 Bàn đọc UV (White/UV Transillminator)
 Pipetteman các loại 0,5 - 1000 l
 Eppendorf các loại 0,2 - 0,5 ml.
 Cân phân tích
 Kéo, đèn, cồn, chày nhựa sử dụng một lần.

3.3. PHƢƠNG PHÁP
3.3.1. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus
3.3.1.1. Tách chiết RNA bằng Trizol
Phƣơng pháp tách chiết RNA tổng số bằng Trizol theo Peter Walker và cộng
sự (2000).
Nghiền khoảng 100 mg mô trong 1ml Trizol. Ủ nhiệt độ phòng trong 5 phút.
Thêm vào 200 l Chloroform. Vortex 20 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Ly
tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút. Thu dịch nổi có chứa RNA vào ống eppendorf 1,5

ml khác (hút khoảng 600 l cho mỗi ống).Thêm vào mỗi ống 600 l Isopropanol lạnh.
Ủ nhiệt độ phòng trong 10 phút (qua đêm - 20
0
C hay để - 70
0
C trong 1 giờ). Ly tâm
12000 vòng trong 10 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Rửa cặn RNA bằng 1 ml Ethanol
70%. Vortex, ly tâm 7500 vòng trong 5 phút. Loại bỏ dung dịch nổi. Làm khô cặn
RNA ở 55
0
C. Hòa cặn RNA trong 50 l H
2
0 - DEPC. Sau đó bảo quản - 20
0
C.




23
3.3.1.2. Tách chiết bằng AquaPure RNA Isolation kit (Bio - Rad)
Lấy 5 - 10 mg mô tƣơi. Nghiền mẫu trong eppendorf với 300 l RNA Lysis.
Thêm vào 100 l dung dịch Protein - DNA để phá vỡ tế bào. Đảo ngƣợc ống 10 lần và ủ
trên nƣớc đá 5 phút. Ly tâm lạnh (4
0
C) ở 13000 vòng trong 6 phút, kết tủa protein và
DNA sẽ có màu trắng. Hút dung dịch nổi chứa RNA (loại bỏ lớp dƣới) vào eppendorf 1,5
ml sạch chứa 300 l 100% Isopropanol (trên đá). Đảo ngƣợc ống 20 - 25 lần. Ly tâm
13000 vòng trong 6 phút (4
0

C) (RNA sẽ thấy dƣới dạng kết tủa sáng). Đổ bỏ dung dịch
nổi và làm ráo nƣớc trên giấy thấm, cho vào 300 l 70% ethanol và đảo ống vài lần để rửa
RNA. Ly tâm ở 13000 vòng trong máy ly tâm khoảng 2 phút (4
0
C). Đảo và làm ráo nƣớc
trên giấy thấm sạch và cho không khí làm khô 10 - 15 phút. Thêm 50 l dung dịch RNA
Hydration. Ủ 30 phút trên nƣớc đá (hoặc trữ - 70
0
C -> - 80
0
C đến khi sử dụng). Trƣớc khi
sử dụng vortex mạnh 5s và spin down hoặc trộn mẫu lên xuống vài lần.

3.3.2. Phƣơng pháp SINGLE - STEP RT - PCR trên RNA của MrNV, XSV
Trƣớc khi tiến hành phiên mã ngƣợc, RNA bản mẫu phải biến tính ở 70
0
C
trong 10 phút nhằm phá vỡ toàn bộ cấu trúc bậc một và hai cho RNA của từng virus.
Tiếp đó, quá trình phiên mã ngƣợc đƣợc tiến hành cho hai Mix riêng biệt của
MrNV, XSV trong eppendorf có bổ sung hạt Bead ở điều kiện 52
0
C trong 30 phút.
Thành phần hai Mix sử dụng cho phản ứng Single - Step RT - PCR trên RNA
của MrNV, XSV:
Bảng 3.3: Thành phần hai Mix của phản ứng Single - Step RT - PCR
Hai virus
Thành phần của hai Mix
Tổng Thể tích ( 50 l )
MrNV
H

2
0 – DEPC
43 l
MrNV -RNA2-F (20 pmol/ l)
1 l
MrNV-RNA2-R (20 pmol/ l)
1 l
Bản mẫu
5 l
XSV
H
2
0 – DEPC
43 l
XSV - F (20 pmol/ l)
1 l
XSV - R (20 pmol/ l)
1 l


24
Bản mẫu
5 l

Kết thúc quá trình phiên mã ngƣợc, dung dịch phản ứng đƣợc biến tính ở 94
0
C
trong 2 phút nhằm ức chế enzym phiên mã ngƣợc. Sau đó thực hiện quá trình khuếch
đại acid nucleic bằng phƣơng pháp PCR hai mồi MrNV - RNA2 - F và MrNV - RNA2
- R cho MrNV, XSV - F và XSV - R cho XSV trong 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm:

 Giai đoạn biến tính: 94
0
C trong 40s
 Giai đoạn bắt cặp: 55
0
C trong 40s
 Giai đoạn kéo dài mạch: 68
0
C trong 1 phút
 Hỗn hợp cuối của phản ứng đƣợc duy trì ở: 68
0
C trong 10 phút
Sản phẩm tạo thành có kích thƣớc 681 bp của MrNV và 500 bp của XSV.

3.3.3. PHƢƠNG PHÁP ĐIỆN DI ACID NUCLEIC TRÊN GEL AGAROSE
Phƣơng pháp điện di dựa vào đặc tính cấu trúc của acid nucleic trong dung
dịch. Đó là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trƣờng,
chúng sẽ di chuyển về cực dƣơng của điện trƣờng. Tính linh động của acid nucleic phụ
thuộc phần lớn vào hai chỉ tiêu: kích thƣớc của acid nucleic và nồng độ của chất cấu
thành gel. Gel agarose thƣờng rất thông dụng để phân tách một đoạn có kích thƣớc
khoảng 0.5 - 10 Kb. Ở các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu quả phân
tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau. Để đọc kết quả điện di ngƣời ta bổ
sung một lƣợng ethium bromide. Ethidium bromide có khả năng gắn xen vào giữa các
nucleotide của phân tử DNA. Do đó, các phân tử DNA sẽ gắn kết với ethium bromide
và phát huỳnh quang khi kích thích bằng tia tử ngoại. Dựa vào vị trí các vết huỳnh
quang này ngƣời ta biết đƣợc vị trí các đoạn DNA trên gel.
Trong kỹ thuật điện di DNA, ngƣời ta thƣờng sử dụng các thang chuẩn với mục
đích so sánh và ƣớc lƣợng kích thƣớc các phân tử điện di. Các thang chuẩn này là hỗn
hợp gồm nhiều đoạn DNA (đối với thang DNA).
Dựa vào kích thƣớc đã biết của các phân tử trên thang chuẩn và dựa vào sự so

sánh vị trí của các phân tử trên gel với thang chuẩn để xác định kích thƣớc các phân tử
mục tiêu.
Cách tiến hành:
 Đổ gel:


25
Cân 1g agarose cho vào bình tam giác 250 ml, thêm vừa đủ 100 ml TBE 1X
vào, đun nóng cho tan agarose. Để nguội khoảng 50 - 55
0
C, cho vào 2 l ethidium
bromide (10 mg/ml). Trong thời gian chờ nguội ta lắp lƣợc vào khay, đổ gel vào khay,
đợi 15 - 30 phút cho gel đông lại. Đổ TBE 1X vào bồn điện di cho ngập (cao hơn gel
khoảng 5 mm). Khi gel đã khô, rút lƣợc ra khỏi giếng, đặt gel vào bồn điện di.
 Nạp mẫu:
Cho vào eppendorf (0,2 ml) 10 l mẫu và 2 l dung dịch nạp mẫu (bromophenol
blue). Trộn đều, hút khoảng 10 - 12 l mẫu đặt vào giếng. Tƣơng tự đối với DNA chuẩn
chạy điện di ở hiệu điện thế 100 V, cƣờng độ dòng điện 2 Ampe, trong thời gian 40 phút.
 Phát hiện vạch DNA sản phẩm:
Sau khi chạy điện di, các phân tử DNA (sản phẩm của PCR và của thang chuẩn)
đƣợc nhuộm bởi ethidium bromide sẽ tập trung tại nơi có DNA, xen vào giữa hai sợi
DNA xoắn kép. Gel đã nhuộm này đƣợc xem dƣới tia tử ngoại. Phức DNA - ethidium
bromide hấp thụ tia tử ngoại ở 300 nm, còn lại một ít năng lƣợng và phát ra ở dạng tia
sáng nhìn thấy đƣợc 590 nm. Dƣới tia tử ngoại, các đoạn DNA (sản phẩm của PCR)
hiện ra có màu đỏ cam trên gel.

3.4. BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM
3.4.1. Thử nghiệm qui trình Single - Step RT - PCR phát hiện MrNV,
XSV từ mẫu tôm bệnh (chứng dƣơng) đƣợc cung cấp từ Ấn Độ.
Trong thử nghiệm này chúng tôi đã sử dụng đúng qui trình của tác giả đƣa ra.

Thử nghiệm qui trình trên 1 mẫu tôm thịt đã xác định nhiễm MrNV và XSV cung cấp
từ Ấn Độ, 1 mẫu tôm không bị bệnh đƣợc kiểm tra bằng phƣơng pháp mô học, và 1
mẫu chứng âm (RNA bản mẫu đƣợc thay bằng H
2
0 - DEPC). Các mẫu đƣợc tách chiết
theo bộ Kit.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

3.4.2. Khảo sát một số điều kiện của qui trình Single - Step RT - PCR
3.4.2.1. So sánh hai qui trình tách chiết RNA bằng Trizol (Peter Walker)
và AquaPure RNA Isolation Kit (Bio Rad).


26
Tách chiết RNA từ mẫu chứng dƣơng bằng hai phƣơng pháp Trizol và bộ Kit,
chúng tôi thực hiện phản ứng RT - PCR cho cả hai virus MrNV, XSV.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

3.4.2.2. Khảo sát nồng độ mồi
Theo qui trình của Widada, Sahul Hameed và cộng sự, nồng độ mồi sử dụng
cho phản ứng là 20 mol. Tiến hành khảo sát với dãy nồng độ mồi cho cả hai virus
nhƣ sau : 10 mol, 15 mol, 20 mol, 25 mol, 30 mol. Thử nghiệm đƣợc thực hiện
trên mẫu chứng dƣơng.
Thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.

3.4.2.3. Khảo sát nhiệt độ lai của mồi
Theo qui trình gốc nhiệt độ lai của mồi là 55
0
C. Tiến hành phản ứng với dãy
nhiệt độ từ 54 - 58

0
C cho cả hai virus theo bảng sau:
Bảng 3.4: Bảng khảo sát nhiệt độ lai của các mồi
Thí Nghiệm
1
2
3
4
5
Tm (MrNV)
54
0
C
55
0
C
56
0
C
57
0
C
58
0
C
Tm (XSV)
54
0
C
55

0
C
56
0
C
57
0
C
58
0
C

Các thành phần trong mỗi phản ứng thí nghiệm là nhƣ nhau đối với RNA
bản mẫu tách chiết từ mẫu chứng dƣơng đƣợc cung cấp tại Ấn Độ.
Thí nghiệm lặp lại 3 lần.

3.4.3. Ứng dụng qui trình Single - Step RT - PCR khảo sát đƣợc kiểm tra
một số mẫu tôm càng xanh thu thực địa.
Áp dụng thử nghiệm qui trình khảo sát đƣợc trên 50 mẫu tôm càng xanh ở
các giai đoạn khác nhau, số lƣợng mẫu đƣợc thử nghiệm theo bảng sau:
Bảng 3.5: Các loại mẫu tôm càng xanh thu ở các giai đoạn khác nhau
Giai đoạn
Số lƣợng (mẫu)
Địa điểm thu
Ấu trùng
30
Trại Thực Nghiệm TĐ
Postlarvae
2
Trại Thực Nghiệm TĐ