Luận văn : NGHIÊN CỨU SUGARCANE YELLOW LEAF VIRUS GÂY BỆNH VÀNG GÂN LÁ TRÊN MÍA (YLS) BẰNG KÍNH HIỂN VI HUỲNH QUANG VÀ KỸ THUẬT RT-PCR part 2 ppsx

15
với cấu trúc GFP reporter, protein P0, và PTGS, Albert và cộng sự (2006) đã chỉ ra
rằng protein P0 của SCYLV cũng im lặng ở vị trí PTGS bị gây ra bởi cấu trúc sense
GFP (sGFP). Không giống nhƣ protein P0 của BWYV, PLRV và CABYV, protein P0
của SCYLV ức chế ảnh hƣởng của PTGS bởi sGFP nhƣng nó không đƣợc gây ra bởi
cấu trúc inverted repeat GFP (irGFP). Phân tích chức năng protein P0 bằng cách xóa
bỏ cấu trúc P0 của SCYLV cho thấy protein này có nhiều vùng cần thiết cho chức
năng ức chế của protein này. Thấm lá với protein P0 của SCYLV, kết quả là xuất hiện
những vết hoại tử ở trên những đốm đƣợc thấm, sự hủy bỏ hoạt tính ức chế cũng mất
đi sự hoại tử, điều đó chứng tỏ những hoạt tính này có thể đƣợc liên kết.
Những nghiên cứu về đa dạng di truyền gần đây đã thừa nhận sự tồn tại một vài
kiểu gene của ScYLV. Để xác định và mô tả chính xác các kiểu gene của ScYLV, Abu
và cộng sự (2006) đã giải trình tự toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân
lập từ 6 vùng khác nhau (Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion). Bốn kiểu
gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã
đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng
này. Những cặp primer đặc hiệu đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của
ScYLV bằng RT-PCR. Kết quả cho thấy một vài kiểu gene của ScYLV có thể cùng
tồn tại trên một vùng địa lý hoặc trên cùng một cây (Abu Ahmad và cộng sự, 2006).
2.2.3 Ảnh hƣởng về kinh tế của bệnh vàng gân lá
ScYLV là một tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley,
Colombia. Trong năm 2004, tỉ lệ nhiễm virus này trên toàn bộ cánh đồng trồng mía
nguyên liệu là 12,2% (S, J.C Angel và cộng sự, 2006). Ở Brazil virus này đã nhiễm
25% trên giống SP 71-6163 và 750 000 ha trên toàn bộ diện tích trồng mía (Vega và
cộng sự, 1997). Giống SP 71-6163 mẫn cảm cao với ScYLV, ƣớc tính làm mất 40-
60% lƣợng đƣờng (Lockhart và cộng sự, 1996). ScYLV đã hiện diện trên toàn bộ các
cánh đồng mía công nghiệp ở Lousiana (McAllister và cộng sự, 2006). Năng suất giảm
15 đến 20% cũng đã đƣợc báo cáo do ScYLV ở Louisiana (Grisham và cộng sự,
2002). Sự giảm năng suất (lƣợng đƣờng trên đơn vị diện tích) ở giống LCP 82-89 cao

nhất ở vụ gốc thứ hai là 23% (Grisham). Ở Florida có ít nhất 65% diện tích trồng mía
thƣơng mại bị nhiễm với ScYLV (Irey và cộng sự, 1997; ). Ở Nam Phi và Hawaii ảnh
hƣởng của YLS trên mía đã làm giảm đáng kể hàm lƣợng phức hợp polysaccharide
(gums) đƣợc tách chiết (Lockhart và cộng sự, 2000).


16
2.2.4 Những nghiên cứu về tính kháng ScYLV trên mía
Marker phân tử liên kết với tính kháng đã đƣợc sử dụng để chọn lọc kiểu gene
của những cá thể và có thể cung cấp công cụ để xác định tính kháng ở trên mía. Mục
tiêu là tìm những quần thể có những cá thể kháng lại bệnh vàng lá. Kết quả là tìm thấy
39 dòng trong quần thể lai Green German x Ind 81-146 là không có bệnh SCYLV
trong suốt quá trình thí nghiệm (Comstock và cộng sự, 2005).
Comstock và cộng sự (2006) đã nghiên cứu về marker phân tử liên kết với tính
kháng bằng cách sử dụng microsatellite primer. Mục đích là phát triển phƣơng pháp
xác định các dòng kháng với ScYLV một cách nhanh chóng và chính xác. Với 216
microsatellite primer đã xác định đƣợc 12 cây nhiễm và 11 cây kháng từ quần thể 65
cây con lai từ Green German (nhiễm) và IND 81-146 (kháng). Trong số 216
microsatellite primer có 167 primer cho ra ít nhất 4 band. Kết quả đã chỉ ra rằng có 3
band đa hình microsatellite liên kết với tính kháng ScYLV. Phân tích kiểu gene trên 47
cây con cho thấy có 2 loci SSR liên kết với tính kháng nhƣng không liên kết với locus
SSR khác.
Trên một vài giống mía có khả năng kháng lại với ScYLV và tính kháng này có
thể di truyền đƣợc (Schenck và Lehrer, 2001). Những nghiên cứu về tính kháng trên
mía đã chỉ ra rằng các giống CC 84-75, CC 87-505, PR 61-632 mẫn cảm với ScYLV,
nhƣng giống CC85-92 thì kháng tốt với ScYLV (Angel và cộng sự, 2006). Ở Hawaii
các giống H 78-4153, H 78-3567, H 78-7750 và H87-4319 đƣợc báo cáo là kháng với
ScYLV (Schenck và Lehrer, 2000).
Các giống mía mới, Saccharum officinarum ít mẫn cảm (nhƣ là S. robustum.
Saccharum spontaneum, S. sinensis và Erianthus sp.) thƣờng không có virus ở trên

cánh đồng mía ở Maunawili, nó đƣợc cho là liên quan đến tính kháng (Schenck và
cộng sự, 2001).
2.2.5 Tạo cây mía chuyển gene kháng ScYLV
Giống mía kháng ScYLV có thể đƣợc tạo ra thông qua biến nạp. Sự bất hoạt
gene đƣợc coi nhƣ một cơ chế phổ biến cho sự kháng của cây trồng đối với sự nhiễm
của virus. Bất hoạt gene sau sao mã (posttranscriptional gene) đã đƣợc hƣớng tới trong
cây mía bởi biến nạp với vùng không giải mã của ScYLV. Bộ gene của ScYLV và
chức năng các protein của virus đã đƣợc biết đến (F. Moonan, 2000), vì thế chiến lƣợc
tạo ra cây mía kháng ScYLV có thể dễ dàng.


17
Giống H62-4671 đã đƣợc biến nạp với một vùng trình tự DNA không dịch mã
(non-traslatabe DNA sequence piece) của protein vỏ virus mà nó làm bất hoạt gene
RNA của virus để chống lại sự nhiễm virus. Mía có một hệ thống bất hoạt gene rất hữu
hiệu (Y. J. Zhu, 2003).
Phôi phát sinh từ mô sẹo của giống lai CC 84-75 đƣợc bắn với plasmids
pFM395 và pFM396 chứa một đoạn DNA mã hóa protein vỏ của ScYLV. Những cây
đã biến nạp đƣợc ủ với ScYLV bởi Melanaphis sacchari. Sự nhiễm đƣợc kiểm tra sau
một vài tháng bằng kỹ thuật TBIA và RT-PCR. Kết quả thu đƣợc 37 cây từ 66 cây
đƣợc kiểm tra là âm tính với ScYLV (Rangel và cộng sự, 2005).
2.2.6 Tạo cây mía sạch bệnh bằng kỹ thuật nuôi cấy mô
Có 3 phƣơng pháp để loại bỏ virus đƣợc sử dụng là xử lý nhiệt, nuôi cấy mô, xử
lý bằng hóa chất. Tuy nhiên, xử lý nhiệt và hóa chất thì không có hiệu quả trong việc
loại bỏ virus ScYLV (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Có thể tạo cây sạch ScYLV
bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô (M. Chatenet và cộng sự, 2001; Y. Parmessur và cộng
sự, 2002). Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng là phƣơng pháp hiệu quả nhất trong việc sản xuất
cây sạch virus và cũng là phƣơng pháp đƣợc chọn để loại bỏ virus khỏi cây bị nhiễm.
Nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng có thể tạo ra 92% cây sạch virus, nhƣng chỉ đạt 29% khi
nuôi cấy bằng chồi đỉnh (M. Chatenet và cộng sự, 2001). Tuy nhiên, theo Parmessur

(2002) khi nuôi cấy đỉnh sinh trƣởng chỉ tạo ra 64% cây sạch virus, chỉ có 6% khi nuôi
cấy bằng chồi nách. Nhƣng khi nuôi cấy từ mô sẹo sẽ tạo ra 100% cây sạch virus (Y.
Parmessur và cộng sự, 2002).
2.2.7 Một số kỹ thuật trong chẩn đoán ScYLV
2.2.7.1 Phƣơng pháp chẩn đoán nhanh bằng cây chỉ thị
Cây chỉ thị thực chất cũng là cây ký chủ của virus, nhƣng đặc biệt hơn là chúng
mẫn cảm cao với virus và tạo ra các triệu chứng rất điển hình trên thân, lá, … Các triệu
chứng này giúp ta chẩn đoán khá chính xác các bệnh do virus.
Đối với virus, có 2 nhóm chỉ thị: nhóm chỉ thị theo bộ phận (necrotic) và nhóm
chỉ thị theo hệ thống (systemic). Nhóm chỉ thị theo bộ phận là những cây chỉ thị mà
khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ có vết chết cục bộ ngay trên bề mặt lá mà không di
chuyển đến những bộ phận khác của cây. Ví dụ nhƣ cây cà độc dƣợc (Datura
stramonium) khi bị nhiễm TMV sẽ xuất hiện những vết đốm chết hình tròn trên mặt lá
sau khi lây bệnh từ 3 - 5 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30
o
C. Nhóm chỉ thị theo hệ


18
thống là những cây chỉ thị mà khi ta truyền bệnh nhân tạo sẽ tạo sự chết hệ thống trên
toàn cây (Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998).
2.2.7.2 Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào triệu chứng
Triệu chứng bên ngoài: Các triệu chứng phổ biến là đốt cuối ngắn, vàng những
lá cuối, mặt dƣới của gân lá trở nên vàng hơn lá già, hoại tử bắt đầu từ chóp lá, …
Triệu chứng bên trong: Sự thay đổi tế bào và mô có thể quan sát qua kính hiển
vi quang học hay kính hiển vi điện tử. Ngƣời ta còn quan sát những cấu trúc khác nhau
do virus sản sinh ra, thƣờng là những thể vùi.
2.2.7.3 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng Brix kế
Độ brix đƣợc đánh giá vào giai đoạn mía 10 tháng tuổi bằng Brix kế trên gân
chính lá +1 và đƣợc chia thành 4 mức độ nhiễm bệnh khác nhau:

 Không bị bệnh: không có triệu chứng, độ brix nhỏ hơn 7.
 Nhiễm nhẹ: độ brix từ 7 đến 14.
 Nhiễm trung bình: Nhìn mặt trên và mặt dƣới lá có màu vàng, độ brix lớn
hơn 14, phiến lá có màu vàng lan ra từ gân chính.
 Nhiễm nặng: toàn bộ phiến lá và gân lá chính có màu vàng, triệu chứng khô
từ cổ lá xuống bẹ lá, toàn bộ cây trong bụi có triệu chứng bệnh, độ brix lớn hơn 14, bụi
có thể nhổ lên dễ dàng (Hà Đình Tuấn, 2004).
2.2.7.4 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi huỳnh quang
Những lát cắt tƣơi đƣợc cắt từ gân, bẹ lá và thân bởi dao lam đƣợc làm tiêu bản
trên một giọt nƣớc cất hai lần trên lam kính và đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi quang
học. Toàn bộ mô đƣợc nghiên cứu với sự chuyển từ ánh sáng trắng sang ánh sáng xanh
bởi đèn huỳnh quang. Sự kiểm tra huỳnh quang với ánh sáng kích thích màu xanh
đƣợc tiến hành thông qua một kính tách màu nhị sắc ở bƣớc sóng 510nm và một kính
lọc màu vàng chặn lại tại bƣớc sóng 510nm.


19

Hình 2.6. Các bó mạch gân lá đƣợc kiểm tra bởi kính hiển vi huỳnh quang. (A) Chất
huỳnh quang màu vàng xanh (đầu mũi tên) trong mạch libe với triệu chứng vàng gân lá.
(B) Cây không có triệu chứng các bó mạch libe bình thƣờng (J. Vega và cộng sự, 1997).
Kiểm tra những lát cắt từ cây có triệu chứng vàng gân lá bởi phƣơng pháp phát
huỳnh quang đã phát hiện ra những bó mạch với chất phát huỳnh quang màu vàng
xanh ở trong mạch libe (hình 2.6 A). Trong những cây không có biểu hiện triệu chứng
thì hiếm khi xuất hiện màu huỳnh quang trong mạch libe (hình 2.6 B).
2.2.7.5 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử
Những lát cắt cực mỏng từ lá, gân hoặc thân mía sau khi sử lý bằng hóa chất
đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.
Virus đƣợc tìm thấy ở dạng kết tụ vô định hình trong tế bào chất của tế bào kèm
của mạch libe. Trong tế bào kèm, virus chỉ xuất hiện ở tế bào chất không thấy ở trong

nhân hay các cơ quan tử khác của tế bào chất. Đƣờng kính của hạt virus từ 22 đến 24
nm.


20

Hình 2.7. Vi ảnh điện tử của lát cắt siêu mỏng của tế bào kèm libe cây mía
(VP: virus particles, CW: cell wall, N: nucleus, tỷ lệ thƣớc 100nm).
(Nguồn: Vega, 1997)
2.2.7.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kỹ thuật DAS-ELISA
Kháng nguyên thu đƣợc (hạt virus tinh sạch) sẽ đƣợc tiêm vào thỏ New Zeland
để thu globulin miễn dịch. Kháng thể sau khi sản xuất sẽ đƣợc sử dụng cho DBIA,
TBIA, ISEM để phát hiện các mô bị nhiễm ScYLV (Angel và cộng sự, 2006).
DAS-ELISA đƣợc thực hiện trên kháng nguyên từ lá mía và dịch nƣớc mía cho
thấy kháng nguyên từ dịch nƣớc mía có chuẩn độ cao hơn kháng nguyên từ lá mía (R
Viswanathan và M Balamuralikrishnan, 2004).
2.2.7.7 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng tissue blot immunoassay (TIBA)
Cũng giống nhƣ ELISA, TIBA sử dụng kháng thể chống lại virus. Nhựa
từ cây đƣợc chuyển lên một màng nylone hay nitrocellulose và virus đƣợc phát hiện
nhờ vào mẫu dò đƣợc đánh dấu. Quy trình này không cần nhiều thao tác nhƣ ELISA,
nhanh, nhạy, đơn giản (không cần dịch chiết của virus), không đắt tiền (chỉ cần số


21
lƣợng trang thiết bị tối thiểu), thích hợp cho khảo sát 1000 - 2000 mẫu trên ngày. Kit
cũng đã sẵn có cho nhiều virus.

Hình 2.8. Kết quả TIBA của vết in gân lá khỏe (trên) và lá bị nhiễm (dƣới)
(Comstock và Gilbert)
Sự nhiễm ScYLV đƣợc xác định bằng một kháng thể đặc hiệu cho ScYLV. Lá

đƣợc cắt khỏi cây và bản lá đƣợc cắt khỏi gân lá trong một thời gian ngắn. Vị trí gốc
của gân lá đƣợc cắt bằng dao mỏng. Miếng cắt gân lá đƣợc cố định trên màng
nitrocellulose. Sau đó màng đƣợc rửa với huyết thanh sử dụng kháng thể đặc hiệu cho
ScYLV đƣợc tạo ra bởi B. E. Lockhart, Đại học Minnesota (Minneapolis) (theo
Comstock và Miller (2003)). Sau đó đƣợc phủ bởi cơ chất tạo màu. Kính hiển vi ba
chiều đƣợc dùng để kiểm tra vết lá in. Vì ScYLV đƣợc xác định ở trong mạch libe nên
mẫu dƣơng tính cho sự hiện diện của virus khi những bó mạch libe trong vết lá in có
màu xanh (Comstock và Miller, 2003) (hình 2.8 và 2.9).



22

Hình 2.9. Màng nitrocellulose đƣợc xử lý bằng kỹ thuật TBIA với huyết thanh
của BYDV-PAV. Kết tủa xuất hiện ở mạch libe của gân lá (A và B), lá (C),
thân (D). Tỷ lệ thƣớc 200µm. (Nguồn: Vega, 1997)
2.2.7.8 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật Immunoblotting (western blotting)
Sau khi điện di protein trên SDS-PAGE, polypeptides đƣợc chuyển lên màng
nitrocellulose để thực hiện Immunoblotting (western blotting). Màng đƣợc ngâm 2
phút trong 2% Tween 20 (v/v) và ủ qua đêm ở 4
0
C với kháng thể sơ cấp (toàn bộ huyết
thanh) đƣợc pha loãng với tỉ lệ 1:5000 trong TTBS chứa 1% gelatin. Những band
protein đƣợc phát hiện dựa vào 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate và nitroblue
tetrazolium (BCIP/NBT). Hạt virus ScYLV chứa protein 27 kDa, là một polypeptide
đƣợc xác định bằng cách nhuộm với Coomassie blue (hình 2.11A). Protein 58, 27 và
17 kDA (6 band) đƣợc xác định bằng western blotting với kháng huyết thanh ScYLV
(hình 2.11,lane1).

Hình 2.10. Kết quả immunoblotting (westren blotting) của protein ScYLV

(Nguồn: Scagliusi và Lockhart, 2000)


23
2.2.7.9 Real -Time PCR
Sử dụng phân tử beacon (Tyagi và Kramer, 1996; Eun và Wong, 2000) trong
chẩn đoán virus cho phép phát hiện nhanh, nhạy và đặc hiệu hơn các kỹ thuật khác.
Kết hợp kỹ thuật phân tử beacon với sự khuếch đại dựa trên trình tự acid nucleotide
(NASBA: nucleic acid sequence-based amplification, Kievits và cộng sự, 1991) cho
phép đồng thời khuếch đại và phát hiện RNA của virus trong một tube kín, đƣợc gọi là
AmpliDet RNA (Leone và cộng sự, 1998). NASBA là phƣơng pháp khuếch đại RNA
đích của virus trong điều kiện đẳng nhiệt ở 41
0
C sử dụng hai oligonucleotide primer
đặc hiệu và enzyme AMV-reverse transcriptase (AMV-RT), RNase H và T7-RNA
polymerase. Gần đây, AmpliDet RNA đã đƣợc sử dụng để xác định một số virus thực
vật (Klerks và cộng sự, 2001; Leone và cộng sự, 1998; Szemes và cộng sự, 2002).
AmpliDet RNA có độ nhạy cao và ổn định cho việc phát hiện những virus ở trong mô
cây phức tạp nhƣ vỏ, chồi, củ và quả. Hơn nữa, AmpliDet RNA phát hiện đƣợc đồng
thời nhiều virus riêng biệt trong cùng một tube (Klerks và cộng sự, 2001; Szemes và
cộng sự, 2002).

Hình 2.11. Phân tử Beacon
(Nguồn: )
Phân tử beacon MB ScYLV đƣợc thiết kế để mang trình tự 6 nucleotide tự bổ
sung với nhau ở đầu 5’ và đầu 3’. Trình tự 21 nucleoitde bổ sung cho sản phẩm
NASBA đặc hiệu cho ScYLV đƣợc chọn để lai với vùng tƣơng tự nhƣ biotinylated
probe BIO ScYLV. Phân tử beacon đƣợc kết hợp với 6-carboxyfluorescein (FAM; bị
kích thích ở bƣớc sóng 494 nm, phát sáng ở bƣớc sóng 530 nm) và quencher 4-[4 -
Vùng mang trình tự bổ sung với DNA đích

24
dimethylaminophenylazo]-benzoic acid (DABCYL) riêng biệt ở đầu 5’ và 3’. Đầu 6
nucleotide cấu trúc sợi đôi ở 41
0
C sẽ kìm hãm sự phát quang khi không có sự bắt cặp
với trình tự đích. Khi có mặt gene đích probe sẽ bắt cặp với gene đích đồng thời với sự
phát huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đƣợc đo ở bƣớc sóng 530nm sau mỗi 2 phút.
Phƣơng pháp này có độ nhạy cao với ScYLV, có thể phát hiện ScYLV ở mật độ
rất nhỏ 10fg (femtogram, 1fg = 10
-15
g). Phƣơng pháp cho phép phát hiện ScYLV sau
khi pha loãng mẫu 1000 lần (Gonçalves và cộng sự, 2002).
2.2.7.10 Chẩn đoán ScYLV bằng kỹ thuật RT-PCR
RT-PCR đƣợc thực hiện trên dịch trích mô bị nhiễm ScYLV với cặp primer
Lu1 và Lu4 đặc hiệu cho nhóm virus luteovirus (Irey và cộng sự, 1997). Cặp primer
Lu1 và Lu4 tạo ra sản phẩm có kích thƣớc 530bp đặc hiệu cho gene mã hóa protein vỏ
của virus (Robertson và cộng sự, 1991 (trích bởi Schenck, 2001)). Những primer này
đƣợc sử dụng để tách trình tự acid nucleotide của ScYLV mà nó đƣợc chứng minh
rằng có khoảng 40% tƣơng đồng với trình tự PAV của kiểu huyết thanh BYDV. Từ
trình tự của ScYLV đƣợc phân lập từ Florida, một cặp primer khác đã đƣợc tạo ra
(YLS111 và YLS462), nó đặc hiệu cho ScYLV (Irey và cộng sự, 1997). Primer này
khuếch đại gene mã hóa cho protein vỏ của ScYLV. Sản phẩm khuếch đại có kích
thƣớc 352bp. Ngày nay cặp primer này đƣợc sử dụng để phát hiện ScYLV ở các nơi
nhƣ Brazil, Colombia, Taiwan, Mauritius và Mexico Florida, Hawaii, (Irey, thông tin
cá nhân).
Ngoài ra các cặp primer khác khuếch đại gene mã hóa protein vỏ cũng đƣợc sử
dụng để phát hiện ScYLV nhƣ các cặp primer:
 RT-PCR sense primer – P1f GCT AAC CGC TCA CGA AGG AAT GT

(3660–3882bp).
 RT-PCR antisense primer – P2r GAA GGG GGC CGG GAA GAC T
(4091–4109 bp).
 RT-PCR sense primer – P3f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG
TGG A (3997–4021bp).
 RT-PCR antisense primer – P4r GAA TTG TCC TGC TAG GCT CGA
(4179–4199bp).
 NASBA sense primer – N2f CAG GTG CAA TCG CAC TTG AAG
TGG A (3997–4022bp) (Gonçalves và cộng sự, 2002).


25
2.3 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới và ở việt nam
2.3.1 Những nghiên cứu về ScYLV trên thế giới
Triệu chứng vàng lá xuất hiện trên mía ở Hamakua thuộc bờ biển của đảo
Hawaii năm 1989. Chúng đƣợc thấy ở trên những cánh đồng giống H65-7052 và nó
không giống nhƣ triệu chứng của sự thiếu dinh dƣỡng. Sau đó triệu chứng này đã đƣợc
tìm thấy ở tất cả các cánh đồng ở Hawaii (Schenck, 1990; trích bởi Schenck, 2001).
Bệnh vàng gân lá gây ra bởi ScYLV là một bệnh quan trọng tiềm tàng đƣợc
nhập vào Louisiana gần đây. Một cuộc khảo sát rộng để xác định sự phân bố của
ScYLV cho thấy virus này đã hiện diện trên tất cả các vùng trồng mía công nghiệp ở
Louisiana (McAllister, 2006).
Ở Ecuador có 2 bệnh virus chính trên mía là bệnh vàng lá do SCYLV và bệnh
khảm do Sugarcane mosaic virus (SCMV). Phạm vi tác động của bệnh vàng gân lá
trên những cánh đồng thƣơng mại cao và bệnh này đã lan rộng trong cả nƣớc (Garcés
và cộng sự, 2006).
Ở Mauritius YLS đã đƣợc tìm thấy đầu tiên vào năm 1994 trên giống CP 72
1210. Tiếp sau đó triệu chứng này đã đƣợc tìm thấy ở một vài giống khác và sự hiện
diện của ScYLV đã đƣợc xác định vào năm 1990 (S. M. Aljanabi và cộng sự, 2001).
ScYLV đƣợc phát hiện đầu tiên ở Nam Phi năm 1997. ScYLV xuất hiện và lan

rộng nhanh chóng trên những cánh đồng chọn lọc và lai tạo giống ở Pongola từ những
cây bị nhiễm sang những cây mẫn cảm chƣa nhiễm khi chúng đƣợc trồng gần nhau.
Ở Colombia ScYLV đã đƣợc phát hiện năm 1998. Nó đã nhiễm vào một vài
giống thƣơng mại, đặc biệt là giống CC 84-75 đƣợc trồng phổ biến thứ hai trên các
vùng trồng mía của nền công nghiệp mía Colombia. Vì sự mẫn cảm của hầu hết các
giống lai và tính quan trọng của giống CC 84-75, triển vọng tạo ra những cây chuyển
gene kháng lại ScYLV đã đƣợc nghiên cứu (Rangel và cộng sự, 2005).
Tƣơng tự triệu chứng héo vàng cũng đƣợc nhận thấy ở trung tâm và đông châu
Phi ở những năm 1960.
Ở Brazil đã xuất hiện trên giống SP 71-6163 năm 1990 với diện tích 750000 ha.
Hạt virus và kháng nguyên của ScYLV đã đƣợc xác định bởi EM, ISEM và
DAS-ELISA trên các mẫu mô lá mía có triệu chứng YLS từ Australia, Brazil,
Colombia, Mỹ, Guadeloupe, Malawi, Mauritius, Reunion Island, và Nam Phi. Kết quả


26
dƣơng tính với ScYLV ở tất cả các mẫu trên (Scagliusi và Lockhart, 2000). Chứng tỏ
đã xuất hiện ScYLV ở tất cả các nƣớc trên.
Toàn bộ bộ gene (gồm 6 ORF) của 8 ScYLV phân lập từ 6 vùng khác nhau
(Brazil, China, Colombia, Cuba, Peru, và Reunion) đã đƣợc giải trình tự. Bốn kiểu
gene của ScYLV (BRA ở Brazil, CUB ở Cuba, PER ở Peru và REU ở Reunion) đã
đƣợc phát hiện dựa vào phân tích phát sinh chủng loài với trình tự bộ gene của 6 vùng
này. Cặp primer đặc biệt đã đƣợc thiết kế để phát hiện từng kiểu gene của ScYLV
bằng RT-PCR (Abu Ahmad và cộng sự, 2006).
Ở Hawaii một vài kỹ thuật miễn dịch đã thành công trong việc chẩn đoán sự
nhiễm của ScYLV dựa trên những kháng thể đặc hiệu. Mặc dù vậy quá trình tinh sạch
virus từ cây bị nhiễm gặp phải khó khăn do virus bị hạn chế trong mạch libe và hiện
diện với nồng độ thấp. Một lƣợng nhỏ protein của mía còn lại gây trở ngại cho độ đặc
hiệu của kháng thể. Vì thế một kháng thể có hoạt tính và độ đặc hiệu cao đã đƣợc
nghiên cứu và đƣợc sử dụng trong chẩn đoán mà không bị trở ngại bởi protein của mía

và các luteovirus hay polerovirus (Wang, Schenck và Albert, 2006).
ScYLV là tác nhân gây bệnh quan trọng về kinh tế ở Cauca Valley (Colombia).
Trong suốt năm 2004, tỉ lệ nhiễm bệnh ScYLS trên các cánh đồng thƣơng mại là
12,2%. Sự hiện diện của các nòi ScYLS đã đƣợc xác định bằng kỹ thuật RT-PCR với
primer o-FM359/323. Kết quả thu đƣợc là một band 1200bp đã đƣợc khuếch đại. Khi
cắt sản phẩm này với enzyme cắt Sau 3AI thì thu đƣợc 3 band. Band 100bp và 200bp
đƣợc phát hiện thì phù hợp với nòi ở Brazil và band 300bp là đặc thù của nòi Texas-
Florida. Những mẫu xuất hiện đồng thời 3 band thì có thể là một nòi mới (Angel và
cộng sự, 2006).
Comstock và cộng sự (2005) đã sử dụng marker phân tử để xác định tính kháng
ScYLV trên mía.
2.3.2 Những nghiên cứu về ScYLV ở Việt Nam
Hà Đình Tuấn (2004) đã dựa vào triệu chứng và Brix kế để nghiên cứu về bệnh
vàng gân lá. Kết quả cho thấy hầu hết các giống đƣợc nghiên cứu đều nhiễm bệnh
vàng gân lá. Đây là nghiên cứu về bệnh vàng gân lá đầu tiên tại Việt Nam.





27
2.4 Kỹ thuật PCR và RT-PCR
2.4.1 PCR
Kĩ thuật PCR
PCR (Polymerase Chain Reaction- phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ polymerase)
do Kary Mullis và cộng sự phát minh vào 1985. Đây là một công cụ khá mới trong
sinh học phân tử, đánh dấu một bƣớc tiến cực kì quan trọng và hiện đang đƣợc sử
dụng rộng rãi nhất trong thực tiễn cũng nhƣ nghiên cứu. Thực chất nó là một phƣơng
pháp tạo dòng in vitro, nghĩa là cũng nhằm mục đích thu nhận một lƣợng lớn bản sao
của một trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).

Hình.2.12. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Nguyên tắc của phƣơng pháp PCR
DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch khuôn đều
cần sự hiện diện của những mồi.
Mồi (primer) là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu
của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Do đó
nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự
DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều đó có nghĩa là để khuếch
đại một trình tự DNA xác định ta phải có thông tin tối thiểu về trình tự đủ để thiết kế
ADN đích
1 Biến tính (94
o
)
2 Bắt cặp (55-65
o
C)
3 Kéo dài (72
o
)

1
2
3
4
n


28
các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này bao gồm một mồi xuôi (sense primer hay

forward primer) và một mồi ngƣợc (antisense primer hay reverse primer). Từ “xuôi”
và “ngƣợc” phải hiểu là “xuôi” và “ngƣợc” so với chiều phiên mã của gen.
PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp DNA theo 3 bƣớc sau:
- Biến tính phân tử DNA (Denature).
- Sự bắt cặp giữa mồi và mạch khuôn (Annealing).
- Tổng hợp mạch mới (Extension).
Ba bƣớc này hợp thành một chu kì và đƣợc lặp lại nhiều lần.
Những phản ứng này đƣợc thực hiện nhờ một enzyme polymerase chịu nhiệt
(chẳng hạn nhƣ Taq polymerase) và sự thay đổi chu kì nhiệt hợp lý, đặc biệt là nhiệt
độ cho quá trình biến tính và bắt cặp.
2.4.2 RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR (Reverse transcriptase- PCR) thì tƣơng tự nhƣ kỹ thuật PCR, nó
cho phép khuếch đại một lƣợng nhỏ RNA. Kỹ thuật này thƣờng đƣợc sử dụng để phát
hiện RNA của virus.
Nguyên tắc của phƣơng pháp này là trƣớc tiên RNA sẽ đƣợc chuyển thành cDNA
nhờ enzyme phiên mã ngƣợc (reverse trascriptase) (hình 2.13). Mồi sử dụng cho
phƣơng pháp này có thể là mồi “ngƣợc” của phản ứng PCR ở giai đoạn sau hoặc cũng
có thể là oligonucleotide T (để bắt cặp với các đuôi poly A của các mRNA) mà cũng
có thể là các mồi hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) để bắt cặp với các trình tự
ngắn trên RNA. Sau đó, cDNA sẽ đƣợc khuếch đại nhờ hoạt động của Taq
polymerase. Ngoài ra, ngƣời ta cũng có thể sử dụng một enzyme chịu nhiệt khác là Tth
polymerase. Sau khi tạo đƣợc nguồn cDNA từ mRNA, cDNA này sẽ đƣợc tiếp tục
khuếch đại thông qua phản ứng PCR nhƣ trình bày ở phần trên.
Kĩ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng rất thấp
không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp thông thƣờng nhƣ Northern blot (Hồ
Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998).



29

Hình 2.13. Sơ đồ phản ứng RT-PCR
Khuôn RNA
Sự gắn primer vào RNA để tổng hợp cDNA (primer
có thể là ngẫu nhiên, oligo-dT hay mồi chuyên biệt
cho gene).
cDNA đƣợc tổng hợp bắt đầu từ vị trí của primer
nhờ enzyme reverse trascriptase.
Sợi cDNA đƣợc tạo thành.
Khuôn RNA đƣợc loại bỏ nhờ Rnase H. cDNA
đƣợc sử dụng để thực hiện PCR.
Sự gắn của primer với cDNA.
Sợi bổ sung của cDNA đƣợc tổng hợp nhờ taq
polymerase.
cDNA sợi đôi đƣợc hình thành.
Ba bƣớc biến tính, bắt cặp, kéo dài đƣợc lặp lại nhiều
lần.


30
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 3 năm 2006 đến tháng 6 năm 2006.
Địa điểm lấy mẫu
 Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú, Bến Cát, Bình Dƣơng.
 Xã Tân An, thị xã Thủ Dầu Một, Bình Dƣơng.
 Xã Phú Lý, huyện Vĩnh Cửu, tỉnh Đồng Nai.
 Xã Mỹ Thạnh Tây, huyện Đức Huệ, tỉnh Long An.
Nơi thực hiện thí nghiệm: Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh và Trung tâm Công
nghệ và Quản lý Tài nguyên và Môi trƣờng Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ

Chí Minh.
3.2 Phƣơng pháp lấy mẫu
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu lá ở vị trí +2 (Hình 3.1). Mỗi mẫu lấy ở năm bụi
khác nhau.

Hình 3.1. Vị trí lá trên cây.
Đối với tập đoàn giống mía gốc và giống mía mới nhập từ Thái Lan chúng tôi
tiền hành lấy mỗi giống một mẫu. Đối với mía đƣợc nhân giống để sản xuất và mía
nguyên liệu, số lƣợng mẫu đƣợc lấy tùy vào diện tích canh tác.
Mẫu sau khi lấy đƣợc mã hóa, ghi nhãn và bảo quản cẩn thận (-20
0
C) trong suốt
quá trình phân tích.



31
3.3 Trang thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
3.3.1 Máy móc, thiết bị
- Máy cất nƣớc 1 lần, 2 lần (Anh).
- Máy li tâm (Sigma, Hettich).
- Tủ mát (nhiệt độ 2 - 8
o
C), tủ lạnh -20
o
C và -80
o
C (trữ hóa chất và mẫu) (Reetech,
Brandt, Sanyo).
- Tủ định ôn (cài đặt ở 37

o
C) (Memmert).
- Bồn ủ nhiệt (Water bath) (Memmert).
- Máy vortex (IKA Works).
- Máy luân nhiệt (máy thực hiện phản ứng PCR) (Eppendorf).
- Lò viba (Electrolux).
- Cân phân tích.
- Bộ nguồn và bồn điện di (Biorad).
- Máy đọc gel (Biorad).
- Kính hiển vi huỳnh quang (Olympus).
- Kính hiển vi quang học (Olympus).
- Máy chụp hình 4.0 (Olympus).
- Màn hình Sony.
3.3.2 Dụng cụ
- Cối, chày sứ dùng để nghiền mẫu.
- Kéo.
- Eppendorf 1,5 ml.
- Eppendorf 0,2 ml.
- Hộp đựng eppendorf.
- Micropipette P1000.
- Micropipette P100.
- Đầu tip 1000 μl.
- Đầu tip 100 μl.
- Ống đong 20, 50, 100ml.
- Khay đổ gel điện di.
- Bồn chứa Ethium bromide (nhuộm gel).
- Lame và lamelle.


32

3.4 Hóa chất
3.4.1 Hóa chất sử dụng trong RT- PCR
Hóa chất dùng trong tách chiết RNA
Sử dụng kit ly trích Aurum
TM
Total RNA Mini Kit (Catalog #732-6820) do Bio
Rad cung cấp gồm:
- Dung dịch ly giải.
- Dung dịch rửa nhẹ (5X).
- Dung dịch rửa mạnh.
- DNase I (ở dạng bột rắn, cần pha buffer trƣớc khi sử dụng).
- Dung dịch pha loãng DNase.
- Dung dịch pha loãng RNA.
- β- mercaptoethanol 14,2 M (catalog #161-0710)
(
*
)
.
- Polyvinylpyrolidone- 40 (PVP), 2 %
(
*
)
.
- Ethanol 100 % và 70 %
(
*
)
.
- Tris-base (pH 7,5, 10 mM)
(*).

- Nitơ lỏng
(*).

- NaOH 0,1M
(*).

- EDTA 1mM
(*).

- DEPC (Diethyl pyrocarbonate)
(*).

(
*
)
: Hóa chất đƣợc cung cấp riêng, không kèm theo kit.
Hóa chất sử dụng tạo cDNA và PCR
- Nƣớc không chứa nuclease.
- iTaq buffer 10X (Biorad).
- iTaq DNA polymerase (Biorad).
- MgCl
2
(50 mM) (Biorad).
- dNTP mix (10 mM) (BioRad).
- Primer: Hai primer YLS 462 và YLS 111 (trình tự primer đƣợc cung cấp bởi
TS. M. Irey).
YLS111: 5' - TCT CAC TTT CAC GGT TGA CG-3’
YLS462: 5' - GTC TCC ATT CCC TTT GTA CAG C-3’
3.4.2 Hóa chất sử dụng trong điện di

- Agarose.


33
- TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM; EDTA 0,1 mM; pH 8).
- Blue/Orange Loading dye 6X (Promega).
- Ethidium bromide (nồng độ 5.10
-3
% theo thể tích).
- Ladder 100 bp (kích thƣớc 1000 bp), nồng độ gel tƣơng ứng là 1,5 %.
3.5 Phƣơng pháp quan sát bằng kính hiển vi huỳnh quang
Gân lá và bản lá đƣợc cắt mỏng bằng dao lam mới. Sau đó, thiết vật đƣợc đặt
trong một giọt nƣớc cất hai lần đã khử trùng trên lame. Đặt lamelle lên và quan sát các
bó mạch libe ở các độ phóng đại 40X, 100X, 200X và 400X với ánh sáng đơn sắc màu
xanh (blue) bƣớc sóng 510nm.
Những bó mạch libe bị nhiễm virus sẽ phát huỳnh quang màu vàng xanh bởi
ánh sáng kích thích 510nm. Những bó mạch bình thƣờng sẽ không phát huỳnh quang.
3.6 Phƣơng pháp phát hiện bằng kỹ thuật RT-PCR
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc thực hiện là hai bƣớc (two steps): gồm giai đoạn tổng
hợp cDNA và giai đoạn khuếch đại cDNA. Virus đƣợc phát hiện dựa trên trình tự đoạn
gene có kích thƣớc 352 bp mã hóa cho protein vỏ của virus ScYLV.
Qui trình thực hiện gồm 3 giai đoạn:
 Giai đoạn ly trích RNA đƣợc thực hiện bằng kit ly trích RNA.
 Giai đoạn tổng hợp cDNA đƣợc thực hiện theo kit tổng hợp cDNA .
 Phản ứng RT-PCR đƣợc thực hiện dựa trên protocol của TS. Michael Irey cung
cấp.
3.6.1 Qui Trình Ly Trích RNA
Quy trình gồm có 15 bƣớc nhƣ sau:
1. Cắt mẫu thành những miếng nhỏ (< 5 mm), nghiền mịn trong nitơ lỏng. Chú ý
không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.

2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Hòa tan
mẫu bằng dung dịch ly giải (lysis solution) (14µl PVP 2% + 700µl dung dịch ly giải
cho mỗi mẫu). Tạo hỗn hợp dung dịch ly giải nhƣ sau: Hút 500 l -mercaptoethanol
cho vào 50 ml dung dịch ly giải, hút 700 l dung dịch ly giải đã có - mercaptoethanol
cho vào eppendorf mới, thêm 14 l PVP vào.
3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube chứa
mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần.


34
4. Ly tâm với tốc độ 13000 vòng trong 3 phút ở 4
o
C. Sau đó hút dịch nổi sang
tube 2 ml (có trong kit).
5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến
khi dịch không còn phân lớp.
6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70
o
C (chuẩn bị
cho bƣớc 15). Cho RNA binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy.
7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000
vòng trong 1 phút ở 4
o
C. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần
cho đến khi hết mẫu thì thôi).
8. Cho 80 ml ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency).
9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA
binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C. Loại phần dịch bên dƣới.

10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều.
11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution)
cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml.
Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ
phòng.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C.
12. Loại phần dịch bên dƣới.
13. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA binding
column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C.
Loại phần dịch bên dƣới.
14. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding
column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C.
Loại phần dịch bên dƣới.
Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4
o
C để loại hoàn toàn dịch rửa.
15. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy.
Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70
o
C vào RNA binding
column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây.
Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4

o
C để thu RNA tổng số.


35
RNA đem ủ ở 4
o
C để dùng sau.
3.6.2 Qui trình thực hiện phản ứng RT-PCR theo protocol của TS. M. Irey
3.6.2.1 Bƣớc chẩn bị mẫu
YLS 462 primer (60 uM stock) 0,25 μl
H
2
O 0,25 μl
Mẫu 1,00 μl
Ủ trong 5 phút sau đó làm lạnh nhanh trong đá. Ly tâm nhẹ.
3.6.2.2 Bƣớc RT
MgCl
2
(25 mM) 2,0 μl
PCR buffer10X 1,0 μl
dGTP (10 mM) 1,0 μl
dCTP (10 mM) 1,0 μl
dATP (10 mM) 1,0 μl
dTTP (10 mM) 1,0 μl
H
2
O 0,5 μl
Rnase inhibitor (20 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer)
MulV Reverse transcriptase (50 U/μl) 0,5 μl (Perkin Elmer)

Tổng thể tích 8,5 μl và thêm vào 1,5 μl hỗn hợp mẫu và primer
Chu trình nhiệt của phản ứng RT: 15 phút ở 42
0
C, 5 phút ở 99
0
C - 1 chu kỳ.
3.6.2.3 Bƣớc PCR
MgCl
2
(25 mM) 4,00 μl
10X PCR buffer 4,00 μl
H
2
O 31,50 μl
Amplitaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Perkin Elmer)
YLS 111 primer (60 uM stock) 0,25 μl
Tổng thể tích 40,00 μl thêm vào tube phản
ứng RT.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR:
94
0
C /1 phút, 54
0
C /1 phút, 72
0
C /20 phút – 1 chu kỳ.
94
0
C /1 phút, 54
0

C /1 phút, 72
0
C /2 phút -40 chu kỳ.
72
0
C 10 phút - 1 chu kỳ.
3.6.3 Qui trình RT-PCR chỉnh sửa


36
3.6.3.1 Qui trình tổng hợp cDNA
Nƣớc không chứa nuclease 10 μl
5X iScript reaction mix 4 μl
iScript reversetranscriptase 1 μl
Mẫu RNA 5 μl
Tổng thể tích phản ứng 20 μl
Chu trình nhiệt của phản ứng:
25
0
C /5 phút, 42
0
C /30 phút, 85
0
C /5 phút – 1 chu kỳ.
Giữ ở 4
0
C.
3.6.3.2 Qui trình PCR
MgCl
2

(50 mM) 2,00 μl
10X PCR buffer 5,00 μl
dNTP (10mM) 1 μl
H
2
O 39,50 μl
cDNA mẫu 1 μl
itaq DNA polymerase (5 U/μl) 0,25 μl (Biorad)
YLS 462 primer (30 μM stock) 0,5 μl
YLS 111 primer (30 μM stock) 0,5 μl
Tổng thể tích 50,00 μl
Chu trình nhiệt
94
0
C /1 phút, 54
0
C /1 phút, 72
0
C /20 phút – 1 chu kỳ.
94
0
C /1 phút, 54
0
C /1 phút, 72
0
C /2 phút - 40 chu kỳ.
72
0
C 10 phút - 1 chu kỳ.
3.7 Phƣơng pháp xử lý số liệu

Số liệu đƣợc xử lý bằng trắc nghiệm χ
2
bởi phần mền Excel XP.


37
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV
Các biểu hiện của triệu chứng vàng gân lá do ScYLV là vàng ở gân lá cả mặt
trên và mặt dƣới (hình 4.1).

Hình.4.1. Lá biểu hiện triệu chứng vàng gân lá (dƣới) và lá không biểu hiện triệu
chứng vàng gân lá (trên). (A) mặt trên của lá, (B) mặt dƣới của lá.
(Hình chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây, Đức Huệ, Long An ngày 19/03/2006).

Hình 4.2 Triệu chứng vàng gân lá bắt đầu từ lá thứ 3
(Hình chụp tại xã Phú Lý, Vĩnh Cửu, Đồng Nai ngày 25/03/2006).
Triệu chứng vàng gân lá xuất hiện bắt đầu từ lá thứ 3 ( hình 4.2) và những lá già
hơn trên toàn cây và xuất hiện những vết hoại tử trên lá (Hình 4.3).
A
B


38
Triệu chứng này biểu hiện làm cho toàn bộ cánh đồng chuyển thành màu vàng
(hình 4.4).

Hình 4.3. (A) cây biểu hiện triệu chứng vàng gân lá. (B) cây không có triệu chứng
vàng gân lá.

(Hình chụp tại Trung tâm Nghiên cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006).


Hình 4.4. Cánh đồng có triệu chứng vàng gân lá (A). Cánh đồng khỏe mạnh (B)
(Hình (A) chụp tại xã Mỹ Thạnh Tây ngày 19/03/2006, hình (B) chụp tại Trung tâm Nghiên
cứu Mía đƣờng An Phú ngày 14/03/2006).
A
B
A
B


39
Đây là những triệu chứng đặc trƣng gây ra bởi ScYLV. Các triệu chứng này
không giống với biểu hiện của sự thiếu dinh dƣỡng. Triệu chứng này giống nhau ở tất
cả mọi nơi (Schenck, 2001).
Các triệu chứng trên là cơ sở ban đầu giúp chẩn đoán tình trạng nhiễm virus
trên đồng ruộng.
4.2 Kết quả chẩn đoán dựa vào triệu chứng
4.2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng đƣợc trình bày ở Bảng 4.1 và Biểu
đồ 4.1. Tỷ lệ biểu hiện triệu chứng vàng gân lá theo các giai đoạn sinh trƣởng có sự
khác biệt lớn về phƣơng diện thống kê (P<<0.05). Tỷ lệ nhiễm bệnh gia tăng theo độ
tuổi phát triển của cây. Kết quả này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Hà Đình Tuấn
(2004) cho rằng bệnh vàng gân lá phát sinh – phát triển tăng theo các giai đoạn sinh
trƣởng của cây mía và tỷ lệ này tăng nhanh sau giai đoạn cây đẻ nhánh.
Bảng 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
Giai đoạn sinh
trƣởng
Không có

triệu chứng (cây)
Có triệu chứng
(cây)
Tỷ lệ nhiễm bệnh (%)
Đẻ nhánh
51
25
32,89
Đầu vƣơn lóng
26
14
35,00
Giữa vƣơn lóng
4
8
66,67
Thu hoạch
9
31
77,50

Biểu đồ 4.1. Tỷ lệ nhiễm bệnh theo giai đoạn sinh trƣởng
0
10
20
30
40
50
60
70

80
90
Đẻ nhánh Đầu vươn lóng Giữa vươn lóng Thu hoạch
Tuổi
Tỷ lệ (%)