Luận văn : ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP IN SITU HYBRIDIZATION ĐỂ CHẨN ĐOÁN MẦM BỆNH WSSV (White Spot Syndrome Virus) TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) VÀ TSV (Taura Syndrome Virus) TRÊN TÔM THẺ CHÂN TRẮNG (Penaeus vannamei) part 3 doc

54


Hình 4.5: Đối chứng âm
trên gan tụy tôm lớn, X40
Hình 4.6: Đối chứng dƣơng
trên mang tôm lớn, X10
Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV
trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10
Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV
trên mẫu mang tôm lớn, X40
nhuộm bổ sung.
nhuộm bổ sung.
Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau:
Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những
tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to và
bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).
Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu
thuốc
nhuộm
bổ
sung)
và có
màu
cam
sau quá
trình lai.

55


Nhƣ vậy sau hai lần thực hiện thí nghiệm, chúng tôi nhận thấy rằng các mẫu 1,
2, 3 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính đều cho kết quả ISH dƣơng tính khi đối
chứng với mẫu đối chứng dƣơng và đối chứng âm, xác suất trùng hợp giữa ba phƣơng
pháp 100% (3/3). Mẫu số 3 sau khi lai cho kết quả tƣơng đối mờ có thể do trong quá
trình thao tác chúng tôi rửa mẫu chƣa đƣợc sạch lắm, lát cắt mẫu trên lame sau khi lai
bị dơ. Điều này cũng có thể do quá trình bắt cặp không đặc hiệu giữa probe và trình tự
không phải DNA đích trong mẫu mô, tạo ra các tín hiệu nền hoặc do thời gian cắt mẫu
với Proteinase K quá lâu, cũng có thể do thao tác nhuộm màu bổ sung chƣa tốt.
Trong quá trình thực hiện, ta thấy mẫu đối chứng âm sau hai lần thí nghiệm đều
không xuất hiện những thể kết tủa màu xanh đậm trong nhân, không bị ngoại nhiễm và
cũng không có hiện tƣợng dƣơng tính giả; trên đối chứng dƣơng thì cấu trúc mô rõ

ràng, tín hiệu lai thu đƣợc rất nhiều và rõ khi quan sát dƣới KHV quang học chứng tỏ
rằng quá trình lai đƣợc tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm.
Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấy
rằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phƣơng pháp này rất hiệu
quả, với độ chính xác cao và kết quả thu đƣợc ổn định. Do đó, chúng tôi tiến hành ứng
dụng phƣơng pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú
nuôi ở các giai đoạn postlarvae và thƣơng phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạn
chế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại. Chẩn đoán theo phƣơng pháp này sẽ
khắc phục đƣợc tính kém đặc hiệu của mô học và tránh đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính
giả của PCR.
IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng
trong phòng thí nghiệm
IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một
số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit
Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1,
2 và 3 trên, đối chứng dƣơng và đối chứng âm. Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối
(Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai. Sau khi
thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau:





56

Bảng 4.9: Kết quả thí nghiệm thực hiện theo quy trình và có thay đổi hoá chất
Mẫu
WSSV
Mô
học
PCR
ISH
Lần 1
Lần 2
1
+
+
Mẫu dƣơng (+) và rất rõ
khi quan sát dƣới KHV.
Mẫu dƣơng (+) và rõ khi
quan sát dƣới KHV.
2
++
++
Mẫu dƣơng (++), lát cắt
mẫu trên lame không bị
trôi và rất rõ khi quan sát
dƣới KHV.
Mẫu dƣơng (++), cấu trúc

mô rõ khi quan sát dƣới
KHV.
3
+++
+++
Mẫu dƣơng (+++), lát cắt
không bị trôi và nhuộm
màu rõ.
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ khi quan sát
dƣới KHV.
Đối
chứng
dƣơng
+++
+++
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ và nhuộm
màu tốt.
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ và lát cắt
không bị trôi.
Đối
chứng
âm
-
-
Không phát hiện tín hiệu
lai, mẫu không bị nhiễm
bẩn và chỉ bắt màu thuốc

Không phát hiện tín hiệu
lai, mẫu không bị nhiễm
bẩn và chỉ bắt màu thuốc



57


nhuộm bổ sung.
nhuộm bổ sung.
Sau khi thực hiện thí nghiệm này, chúng tôi nhận thấy rằng tiến hành lai theo
trƣờng hợp này cho kết quả lai tốt trên cả ba mẫu và hai đối chứng khi quan sát dƣới
KHV quang học. Kết quả thí nghiệm dựa vào phƣơng pháp ISH cho kết quả trùng hợp
hoàn toàn với mô học và PCR, xác suất trùng hợp đạt đến 100% (3/3). Nhìn chung kết
quả mà chúng tôi thu đƣợc không có sự khác biệt nhiều giữa thí nghiệm theo quy trình
và hóa chất của bộ kit với thí nghiệm theo quy trình bộ kit nhƣng có thay đổi một số
hóa chất thông dụng rẻ tiền hơn. Đây là một bƣớc thành công mới, tạo tiền đề cho việc
phát triển phƣơng pháp ISH phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện. Do đó,
chúng tôi sử dụng các hoá chất thay thế này trong các thí nghiệm tiếp theo sau để giảm
bớt chi phí trong chẩn đoán và phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện.

IV.2.2.2 Trường hợp xử lý mẫu nhanh
Mẫu sau khi thu về phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành xử lý nhanh dùng chung
cho kiểm tra mô học và ISH. Mẫu đƣợc xử lý, đúc và cắt và đính trên 4 lame, hai lame
dùng để nhuộm kiểm tra mô học và hai lame còn lại dùng cho ISH. Sau khi thực hiện
chẩn đoán bằng mô học truyền thống và PCR cho kết quả dƣơng tính, mẫu đó sẽ đƣợc
dùng để lai theo quy trình của bộ kit. Chúng tôi tiến hành trên 5 mẫu tôm postlarvae và
5 mẫu tôm thƣơng phẩm và thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Kết quả trên tôm postlarvae

Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae
Mẫu
Mô
học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Cấu trúc mô của mẫu hơi mờ
2
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi
3
+
+
+
+
Mẫu rõ, nhuộm màu tốt
4
+
+

+
+
Mẫu lai bị mờ
5
+
+
+
+
Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ



58


Đối
chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan
sát dƣới KHV.
Đối
chứng
âm
-
-
-

-
Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu
chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ
sung.






Kết quả trên tôm thƣơng phẩm
Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm
Mẫu
Mô
học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
++
++
++
Cấu trúc mô của mẫu rất rõ, nhuộm
màu tốt.
2
+
++

++
++
Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi.
3
+
+
+
+
Mẫu rõ, nhuộm màu tốt.
4
+
+
+
+
Tốt nhƣng cấu tạo mô không rõ.
5
+
+
+
+
Cấu trúc mô mờ, lát cắt không bị
trôi.
Đối
chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu rõ, cấu trúc mô rất rõ khi quan

sát dƣới KHV.
Đối
-
-
-
-
Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu



59


Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh
chứng
âm
chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ
sung.

Qua hai bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng kết quả chẩn đoán thu đƣợc
từ ba phƣơng pháp trên trùng hợp hoàn toàn với nhau. Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu
1 và 4) và một mẫu tôm thƣơng phẩm (mẫu 5) khi xử lý nhanh cho kết quả lai chƣa tốt
có thể do một số khâu trong quy trình xử lý mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt. Mẫu số 5
trên postlarvae và mẫu số 4 trên tôm thƣơng phẩm cho kết quả lai tốt, nhƣng cấu tạo
mô không rõ có thể do ta thực hiện xử lý mẫu chƣa tốt làm hƣ cấu tạo của mô. Điều
này cũng có thể do trong quá trình lai, chúng ta cắt mẫu bằng Proteinase K quá lâu
hoặc thao tác cắt mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt nên cấu trúc mẫu mô không còn rõ nhƣ
ban đầu.

Nhƣ vậy qua hai lần thực hiện thí nghiệm nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả
lai đều dƣơng tính. Khi đối chiếu với kết quả lai trong trƣờng hợp mẫu xử lý theo quy
trình bình thƣờng, chúng tôi nhận thấy rằng kết quả lai trong cả hai quy trình xử lý
mẫu không khác nhau. Các mẫu làm theo quy trình xử lý nhanh, khi quan sát dƣới
kính hiển vi đều cho kết quả tƣơng đối rõ và đẹp. Nếu làm theo quy trình xử lý mẫu
nhanh thì cả quá trình xử lý mẫu chỉ mất khoảng 3 – 4 giờ thay vì trƣớc đây chúng tôi
làm theo quy trình xử lý mẫu bình thƣờng mất khoảng 12,5 giờ, thời gian đƣợc rút
ngắn rất nhiều nhƣng kết quả lai không khác nhau. Do đó, chúng ta có thể áp dụng quy
trình xử lý nhanh này trong chẩn đoán bằng phƣơng pháp ISH, giúp rút ngắn đƣợc thời
gian rất nhiều.



60


Quy trình xử lý mẫu nhanh có ƣu điểm là rút ngắn đƣợc thời gian xử lý mẫu rất
nhiều, tuy nhiên nó có một số nhƣợc điểm so với phƣơng pháp xử lý mẫu bình thƣờng.
Mẫu đƣợc xử lý theo phƣơng pháp này dễ bị hƣ cấu trúc của mô, nguyên nhân của sự
cố này là do nƣớc trong mẫu mô chƣa đƣợc khử hoàn toàn làm cho mô và tế bào bị co
lại hoặc làm thành phần cấu tạo trong mô bị thay đổi. Một lý do khác làm hƣ cấu trúc
của mô là do cồn trong mô không đƣợc tẩy hoàn toàn, mẫu mô không trong suốt nên
rất khó quan sát cấu tạo của mô dƣới kính hiển vi. Cả giai đoạn khử nƣớc và tẩy cồn ra
khỏi mô nếu không đƣợc thực hiện tốt thì giai đoạn ngấm paraffin cũng bị thất bại. Do
đó, khi áp dụng quy trình xử lý mẫu nhanh, ta phải thật cẩn thận khi thao tác, làm tốt

các giai đoạn quyết định nhƣ giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene và từ
xylene qua paraffin. Nếu tuân thủ đúng các bƣớc này, mẫu mô thu đƣợc sau xử lý sẽ
giống với mẫu mô xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng.


IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai
Nếu lai theo quy trình của bộ kit thì probe phải đƣợc biến tính ở 95
0
C trong 10
phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 4
0
C cho đến khi cho lên mô lai. Khi lai, ta cho mẫu dò
lên mẫu mô và thực hiện biến tính một lần nữa ở 95
0
C trong 6 phút. Trong thí nghiệm
này, chúng tôi thực hiện biến tính mẫu lai và probe đồng thời trên lame ở 95
0
C trong 6
phút. Quy trình này đƣợc thực hiện trên bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ. Mẫu thực hiện
thí nghiệm này đƣợc xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng và đã đƣợc phƣơng pháp
mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV. Thí nghiệm thực hiện nhƣ bố trí
trên và thu đƣợc kết quả sau hai lần thực hiện nhƣ sau:
Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên
postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét

Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame



61


không bị trôi
2
+
+
+
+
Mẫu bị dơ
3
+
+
-
-
Không phát hiện
4
+
+

+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi
5
+
+
+
+
Mẫu rõ
Đối chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu rất rõ, cấu trúc mô
giữ đƣợc hình dạng đầu.
Đối chứng âm
-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp.





Kết quả trên tôm thƣơng phẩm

Bảng 4.13: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên tôm
thƣơng phẩm
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi.
2
+
+
+
+
Mẫu hơi mờ.
3
+
+
+
+
Mẫu rõ nhƣng màu bổ
sung nhuộm không rõ.
4

+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi.
5
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame



62


không bị trôi.
Đối chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu lai tốt, cấu trúc mô
giữ đƣợc hình dạng đầu.
Đối chứng âm
-
-

-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp,
cấu trúc mô rõ và chỉ
nhuộm màu bổ sung.
Sau hai lần lặp lại thí nghiệm nhƣ trên, ta thấy kết quả thực hiện chẩn đoán
bằng ISH theo cách biến tính mẫu và probe trên cùng một lame trƣớc khi lai nhƣ trên
đa số cho kết quả trùng hợp với phƣơng pháp mô học và PCR. Chỉ có một trƣờng hợp
mẫu số 3 trên tôm postlarvae cho kết quả lai ISH là âm trong khi đó kết quả mô học và
PCR là dƣơng tính. Điều này có thể do mẫu dò của chúng ta đã bị bất hoạt nên không
bắt cặp đƣợc với trình tự đích có trong mẫu, nhƣng khả năng này rất ít xảy ra vì trên
đối chứng dƣơng chúng tôi vẫn nhận đƣợc tín hiệu lai rất tốt. Sự không phù hợp này
cũng có thể do trong quá trình làm PCR bị ngoại nhiễm hoặc khi làm mô học có thể bị
nhầm lẫn với một tác nhân gây bệnh khác nhƣng cũng có biểu hiện tƣơng tự nhƣ bệnh
đốm trắng.
Dựa vào kết quả trên, ta thấy tỷ lệ tƣơng thích của phƣơng pháp ISH thực hiện
theo quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame với mô học và PCR là 90%
(9/10), tỷ lệ này khá cao và chính xác. Khi so sánh với trƣờng hợp lai bình thƣờng theo
quy trình của bộ kit, thì hình dạng cấu trúc mô không khác nhau giữa hai trƣờng hợp
khi chúng tôi quan sát dƣới kính hiển vi quang học. Do đó, chúng ta có thể áp dụng
quy trình biến tính mẫu và probe đồng thời trên mẫu mô khi thực hiện lai. Cách làm
này vừa đơn giản, dễ thực hiện lại vừa tránh đƣợc khả năng gây sốc probe khi lai,
probe chỉ đƣợc biến tính một lần thay vì hai lần nhƣ trong quy trình của bộ kit.
IV.2.2.4 Trường hợp kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe
trước khi lai
Sau khi thực hiện lai theo từng trƣờng hợp riêng rẽ, chúng tôi đều thu đƣợc kết
quả rất tốt, nhƣng khi chúng tôi áp dụng đồng thời hai quy trình trên vào trong chẩn
đoán thì sẽ cho kết quả ra sao? Do đó chúng tôi kết hợp cả hai quy trình trên để chẩn
đoán bệnh đốm trắng, thực hiện trên 5 mẫu tôm thƣơng phẩm và 5 mẫu tôm postlarvae

63


có kết quả mô học và PCR dƣơng tính với WSSV. Kết quả sau hai lần thí nghiệm nhƣ
sau:
Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe
trƣớc khi lai trên tôm postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Tín hiệu lai rõ, không có
màu nền.
2
+
+
+
+
Cấu trúc mô rất rõ, màu

bổ sung nhuộm rất tốt.
3
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi.
4
+
+
+
+
Mẫu bị dơ
5
+
+
+
+
Mẫu rõ
Đối chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Kết quả lai rất tốt, cấu
trúc mô rõ và đẹp, không
có màu nền.
Đối chứng âm

-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp,
chỉ nhuộm màu bổ sung.

Kết quả trên tôm thƣơng phẩm
Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe
trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame



64


Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến

tính mẫu và probe đồng thời trên lame, quan sát ở X40.
không bị trôi.
2
+
+
+
+
Mẫu hơi mờ
3
+
+
+
+
Mẫu rõ nhƣng màu bổ
sung nhuộm không rõ
4
+
+
+
+
Mẫu lai tốt, tín hiệu lai
rõ.
5
+
+
+
+
Mẫu rõ, không có màu
nền.
Đối chứng

dƣơng
+++
+++
+++
+++
Kết quả lai rất tốt, cấu
trúc mô rõ và đẹp, không
có màu nền.
Đối chứng âm
-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp,
chỉ nhuộm màu bổ sung.
Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp quy trình xử lý mẫu
nhanh và biến tính mẫu và probe trên cùng một lame khi thực hiện lai đều cho kết quả
trùng hợp với kết quả của phƣơng pháp PCR và mô học. Mức độ trùng hợp giữa ba
phƣơng pháp đạt 100% sau hai lần lặp lại thí nghiệm. Mẫu mô thu đƣợc sau khi lai đa
số rõ nhƣng có một số trƣờng hợp mẫu mô không rõ do thao tác thực hiện chƣa tốt,
hoặc do hóa chất rửa mẫu lai mất hoạt tính hay có thể do nhuộm màu bổ sung chƣa đạt
yêu cầu…nhƣng những điều này không ảnh hƣởng nhiều đến kết quả lai và chúng tôi
có thể
khắc phục
đƣợc.

65




Sau thí nghiệm này, chúng tôi có thể áp dụng cả quy trình xử lý mẫu nhanh với
biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame vào quy trình chẩn đoán chính thức khi
thực hiện chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú. Nhờ hai quy trình biến đổi này
mà chúng tôi có thể rút ngắn đƣợc thời gian chẩn đoán mầm bệnh rất nhiều, thao tác
đơn giản hơn và giảm đƣợc khả năng gây sốc probe nhƣ quy trình của bộ kit đã
khuyến cáo.











66


Sơ đồ 4.1: Quy trình ISH áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện.

Xử lý mẫu
Mẫu P. vannamei
Cố định (R-F)
Xử lý mẫu trƣớc khi lai
Đúc, cắt và đính lên lame
Lai, thực hiện biến tính probe ở
95
0
C trong 6 phút, giữ lạnh ở 4
0
C.
khi lai cho dung dịch lai có probe
đã biến tính lên mẫu và biến tính
mẫu ở 70
0
C trong 5 phút .
Rửa và phát hiện tín hiệu lai
Mẫu P. monodon
Cố định (Davidson)
Xử lý nhanh giảm thời gian
Tẩm paraffin
Đúc, cắt, đính mẫu
Lai, thực hiện biến tính
mẫu và probe đồng thời
trên lame ở 95
0
C trong 5
phút, ủ qua đêm ở 42
0
C.

Rửa và phát hiện tín hiệu lai
Xử lý mẫu trƣớc khi lai
Qua các kết quả thí nghiệm trên, chúng tôi đƣa ra đƣợc quy trình lai tối ƣu để
phát hiện WSSV và TSV có thể áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Viện:



Trong đó, các bƣớc chuẩn bị mẫu lai trên hai đối tƣợng hoàn toàn giống nhau
và gồm các bƣớc nhƣ: cố định mẫu, xử lý mẫu, đúc mẫu, cắt mẫu và đính mẫu lên
lame dƣơng. Giai đoạn xử lý mẫu trƣớc khi lai trên mẫu tôm sú và mẫu TCT là giống
nhau là mềm hóa mẫu lai bằng proteinase K (15 phút trên postlarvae và 17 phút trên
tôm thƣơng phẩm). Giai đoạn lai đƣợc thực hiện nhƣ mô tả trên sơ đồ, thể tích dung
dịch lai tối ƣu trong hai trƣờng hợp là 75 µl. Giai đoạn rửa và phát hiện các tín hiệu lai
cũng hoàn toàn giống nhau trên hai đối tƣợng và thực hiện các bƣớc nhƣ trong quy
trình của bộ kit ở mục III.5.



67


IV.3 Kết quả thí nghiệm so sánh giữa phƣơng pháp ISH với phƣơng pháp
mô học và PCR
IV.3.1 Kết quả trên Penaeus vannamei: Các mẫu tôm postlarvae và tôm thƣơng
phẩm có dấu hiệu bệnh đƣợc thu ngẫu nhiên từ các trại sản xuất giống và các ao nuôi
thƣơng phẩm ở Phú Yên, sau khi thực hiện chẩn đoán theo quy trình của ba phƣơng
pháp mô học, PCR và ISH nhƣ trên, chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
IV.3.1.1 Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.16: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae
Mẫu

Mô học
PCR
ISH
1
-
+
-
2
-
+
-
3
-
+
-
4
-
+
-
5
-
+
-
6
-
-
-
7
-
-

-
8
-
-
-
9
-
-
-
10
-
-
-
11
-
-
-
12
-
-
-
13
-
-
-
14
-
-
-
15

-
-
-
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-



68


Sau khi thực hiện thí nghiệm so sánh trên, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các
mẫu đem kiểm tra đều âm tính với TSV. Nhìn chung, kết quả chẩn đoán của ba
phƣơng pháp đa số trùng hợp với nhau, kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp nhau
100% (15/15). Trong số 15 mẫu trên thì có 5 mẫu đầu có kết quả PCR dƣơng nhƣng
mô học và ISH đều âm tính. Hiện tƣợng không trùng hợp này có thể do hiện tƣợng
dƣơng tính giả của PCR, hoặc có thể do chúng tôi thực hiện thu mẫu chƣa đảm bảo
chính xác, mẫu thu đƣợc chƣa đại diện đƣợc cho cả quần thể tôm nuôi tại trại giống
nên cùng một mẫu khi chia thành nhiều phần, mỗi phần thực hiện một phƣơng pháp
chẩn đoán khác nhau thƣờng cho kết quả không trùng hợp với nhau. Hiện tƣợng này
cũng có thể do probe bị bất hoạt nhƣng trƣờng hợp này rất ít xảy ra vì khi lai chúng tôi
có thực hiện song song một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm, kết quả vẫn phát
hiện tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng và đối chứng âm không bị nhiễm tạp; điều này
một lần nữa khẳng định tính ổn định của phƣơng pháp ISH. Trong thí nghiệm này kết

quả giữa mô học và ISH trùng hợp với nhau hoàn toàn nên ta có thể nói rằng hai
phƣơng pháp này có tƣơng quan với nhau, trong đó ISH có độ ổn định và độ chính xác
cao hơn mô học.
IV.3.1.2 Kết quả trên tôm thương phẩm
Bảng 4.17: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng
phẩm
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
1
+
+
+
2
+
+
+
3
+
+
+
4
+
-
+
5
+
-
+

6
+
++
+
7
+
++
-
8
+
-
-



69


9
+
-
-
10
+
-
-
11
-
-
-

12
-
-
-
13
-
-
-
14
-
-
-
15
-
-
-
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-
Trên tôm lớn sau khi thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi nhận thấy rằng mức
độ tƣơng đồng giữa mô học và ISH là 73,33% (11/15), giữa mô học và PCR là 66,67%
(10/15) và giữa PCR với ISH là 80% (12/15). Nhìn vào tỷ lệ này, chúng tôi nhận thấy
độ tƣơng thích giữa PCR với ISH tƣơng đối cao và ổn định hơn so với mô học. Tuy
nhiên, cả ba phƣơng pháp trên đều có thể dùng để chẩn đoán mầm bệnh trên tôm nuôi,
trong đó PCR và ISH có độ chính xác, độ nhạy và ổn định hơn mô học truyền thống

rất nhiều. Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không chênh lệch nhiều giữa ba
phƣơng pháp, một số trƣờng hợp không trùng hợp giữa ba phƣơng pháp có thể đƣợc
giải thích nhƣ sau:
Trƣờng hợp mô dƣơng, ISH dƣơng và PCR âm nhƣ ở mẫu số 4 và 5. Trƣờng
hợp này có thể do thao tác thực hiện RT – PCR không chính xác, cũng có thể là do
lƣợng RNA tách chiết quá thấp, tạp nhiễm nhiều hay có thể do có sự hiện diện của một
tác nhân ức chế phản ứng PCR nên không phát hiện đƣợc tác nhân gây bệnh trong
mẫu. Ngoài ra hiện tƣợng này cũng có thể do tính đa hình của virus Taura, mặc dù tính
đa hình này rất ít xảy ra nhƣng khi nó xuất hiện thì có thể gây ra hiện tƣợng âm tính
giả.
Trƣờng hợp mô dƣơng, PCR dƣơng nhƣng ISH âm ở mẫu số 7. Hiện tƣợng này
có thể mẫu dò bị bất hoạt nhƣng điều này không thể xảy ra vì có tín hiệu lai trên đối
chứng dƣơng. Vì vậy, nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do hiện tƣợng ngoại



70


A
B
C
D
E
F
Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng
pháp trên tôm lớn. Hình A: ISH dƣơng tính trên chân bơi, X10; hình B: ISH dƣơng
tính trên mang, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên phụ bộ, X10; hình D: mô học
dƣơng tính trên mang, X100; hình E: ISH dƣơng tính trên gan tụy, X40; hình F: ISH
dƣơng tính trên biểu mô, X10.

nhiễm khi thực hiện phản ứng PCR, tạo hiện tƣợng dƣơng tính giả; hoặc có thể do sự
nhầm lẫn virus Taura với một loại virus khác khi quan sát trên tiêu bản mô học.
Trƣờng hợp mô dƣơng nhƣng PCR và ISH đều âm nhƣ ở mẫu số 8, 9 và 10.
Điều này có thể giải thích do sự nhầm lẫn giữa TSV với một tác nhân gây bệnh khác
có biểu hiện tƣơng tự trên tiêu bản mô học. Ngoài ra, kết quả không tƣơng đồng giữa
ba phƣơng pháp trên có thể do thao tác thu mẫu của chúng tôi không đại diện cho cả
quần thể tôm mà chúng tôi khảo sát.






Qua các thí nghiệm trên chúng tôi nhận thấy cả ba phƣơng pháp trên đều có thể
ứng dụng vào chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT, trong đó PCR và ISH có độ nhạy
và độ chính xác cao hơn mô học truyền thống. Khi thực hiện chẩn đoán trên 15 mẫu
postlarvae và 15 mẫu tôm lớn thì tỷ lệ dƣơng tính với TSV là 0% (0/15) đối với
postlarvae và 40% (6/15) trên tôm lớn, các mẫu mà chúng tôi thu đƣợc có tỷ lệ nhiễm
bệnh tƣơng đối thấp.
IV.3.2 Kết quả trên Penaeus monodon



71


Để thực hiện bố trí này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên 15 mẫu tôm
postlarvae và 15 mẫu tôm thƣơng phẩm có biểu hiện nhiễm bệnh nhƣ ăn ít, rớt đáy…
Các mẫu này đƣợc thu tại các trại sản xuất giống và các ao nuôi tôm thƣơng phẩm ở

các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu và thực hiện chẩn đoán đồng thời các phƣơng
pháp mô học, PCR, ISH. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae
Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
1
+
++
+
2
++
-
+
3
+
-
-
4
+
+
+
5
-
+
-
6
+

+
+
7
+
-
+
8
-
+
+
9
+
+
+
10
+
+
+
11
-
+
+
12
-
-
-
13
-
-
-

14
-
-
-
15
-
-
-
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-




72





IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm
Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng
phẩm
Mẫu

Mô học
PCR
ISH
1
+++
-
+++
2
+
++
++
3
+
++
++
4
+
++
+
5
+
+
+
6
+
+
+
7
-
-

-
8
-
-
-
9
-
-
-
10
-
-
-
11
+
+
-
12
+
+
+
13
-
+
+
14
-
+
+
15

+
+
+
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-
Qua kết quả thực hiện chẩn đoán so sánh giữa các phƣơng pháp với nhau chúng
tôi thu đƣợc một số kết quả nhất định nhƣ sau:



73


Ở tôm thƣơng phẩm thì đa số các kết quả thu đƣợc từ ba phƣơng pháp trên
tƣơng đồng với nhau (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 80% (12/15), giữa
mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 87% (13/15) và giữa ba phƣơng
pháp là 73% (11/15)); nhƣng ở tôm postlarvae thì kết quả giữa ba phƣơng pháp có
chênh lệch nhau nhiều (mức độ tƣơng đồng giữa mô học với PCR là 60% (9/15), giữa
mô học với ISH là 80% (12/15), giữa PCR với ISH là 80% (12/15) và giữa ba phƣơng
pháp là 60% (9/15)). Mặc dù có sự khác biệt nhƣng nhìn chung, đa số kết quả chẩn
đoán của ba phƣơng pháp trên đều trùng hợp với nhau, điều này giúp chúng ta thấy
đƣợc độ ổn định của các phƣơng pháp này khi áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh trên
tôm.
Với kết quả phƣơng pháp PCR và ISH dƣơng nhƣng mô học âm ở mẫu số 8, 11

của tôm postlarvae và mẫu 13, 14 của tôm thƣơng phẩm. Hiện tƣợng này có khả năng
do tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm thấp, bệnh chỉ biểu hiện ở một số tế bào.
Trong quá trình nhuộm mô, lát cắt mô có kích thƣớc nhỏ nên không đi qua hết các tế
bào bị nhiễm bệnh nên có khả năng không tìm thấy bệnh. Ngoài ra với phƣơng pháp
mô học, ta chỉ xác định đƣợc bệnh khi bệnh đã biểu hiện ra các tế bào, còn ở giai đoạn
bệnh mới phát dấu hiệu bệnh lý chƣa đƣợc biểu hiện ở các bào quan thì mô học không
thể định dạng đƣợc bệnh. Trong khi đó, với phƣơng pháp PCR và ISH thì chỉ cần tôm
có dấu hiệu bệnh dù là ở giai đoạn đầu của qua trình nhiễm bệnh thì PCR và ISH vẫn
có thể xác định đƣợc bệnh. Qua đó ta có thể nói đƣợc là phƣơng pháp PCR và ISH có
độ nhạy cao hơn mô học truyền thống.
Trƣờng hợp PCR và ISH âm nhƣng mô học dƣơng nhƣ ở mẫu số 3 của tôm
portlarvae. Hiện tƣợng này có thể do có một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện bệnh
lý trên tế bào tƣơng tự nhƣ dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng. Do đó, bằng phƣơng
pháp mô học ta có thể dễ nhầm lẫn trong việc phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm
sú P. monodon. Điều này khẳng định một lần nữa phƣơng pháp mô học có độ chính
xác kém hơn PCR và ISH.
Trƣờng hợp PCR cho kết quả dƣơng tính nhƣng ISH và mô học cho kết quả âm
tính ở mẫu số 5 của postlarvae. Điều này có thể do hai khả năng. Thứ nhất là do ngoại
nhiễm trong quá trình làm PCR hoặc do primer bắt cặp không đặc hiệu với DNA của
tác nhân gây bệnh. Thứ hai là do mẫu dò (probe) đã bị bất hoạt nên không phát hiện



74


đƣợc tác nhân gây bệnh và ở phƣơng pháp mô học do tôm bị nhiễm bệnh ở giai đoạn
đầu, bệnh chƣa biểu hiện ra các bào quan nên mô học không phát hiện đƣợc bệnh. Cả
hai khả năng trên đều có thể xảy ra nhƣng xác suất khả năng thứ nhất xảy ra cao hơn vì
khi thực hiện PCR rất dễ bị ngoại nhiễm và khi thực hiện lai chúng tôi có làm đối

chứng dƣơng kèm theo và thu đƣợc tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng. Chúng tôi tiến
hành kiểm tra lại mẫu trên bằng phƣơng pháp ISH một lần nữa, kết quả thu đƣợc vẫn
trùng hợp với kết quả ban đầu, chứng tỏ phƣơng pháp PCR đã bị dƣơng tính giả.
Trƣờng hợp PCR cho kết quả âm tính nhƣng mô học và ISH cho kết quả dƣơng
tính nhƣ ở mẫu số 2, 6 của tôm postlarvae và mẫu 1 của tôm thƣơng phẩm. Điều này
có thể trong quá trình tách chiết DNA, DNA tách chiết bị dơ và nồng độ quá thấp
không đủ để thực hiện phản ứng khuếch đại. Hiện tƣợng này cũng có thể là do probe
của bộ kit bắt cặp không đặc hiệu, tạo ra các tín hiệu dƣơng tính giả. Nhƣng khi chúng
tôi lặp lại thí nghiệm này lần thứ hai thì ISH vẫn cho kết quả trùng hợp với kết quả ban
đầu nhƣng PCR thì lại cho kết quả dƣơng tính. Điều này cho thấy phƣơng pháp ISH có
độ đặc hiệu cao hơn PCR và mô học.



75


A
B
C
D
E
F
Hình 4.12: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng đồng thời
bằng ba phƣơng pháp. Hình A: ISH dƣơng tính trên mang tôm postlarvae, X40; hình
B: ISH âm tính trên mang tôm postlarvae, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên mắt
tôm poslarvae, X40; hình D: mô học dƣơng tính trên mang tôm lớn, X40; hình E:
ISH dƣơng tính trên chân bơi tôm lớn, X40; hình F: ISH dƣơng tính trên gan tụy
tôm lớn, X10.
Qua thí nghiệm này chúng tôi thấy đƣợc virus đốm trắng có thể nhiễm vào bất

kỳ tổ chức nào nhƣ mang, gan tụy, dạ dày, ruột, phụ bộ…của cơ thể khi tôm bị bệnh,
nhƣng mang là cơ quan bị virus tấn công nhiều nhất. Đa số các mẫu lai thu đƣợc đều
rõ, ít có các tín hiệu nền, các cơ quan của tôm đều thấy rõ nên đây là phƣơng pháp rất
hữu hiệu dùng để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú.
IV.5 Nhận xét chung
Sau khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên P. monodon và TSV trên P.
vannamei, chúng tôi có một số nhận xét sau:
Do probe mà bộ kit cung cấp có dạng DNA mạch đôi nên khi thực hiện chẩn
đoán mầm bệnh WSSV dễ dàng hơn vì cả probe và WSSV đều có cấu trúc DNA mạch
đôi. Do đó, chúng tôi có thể bỏ qua giai đoạn biến tính probe riêng mà thực hiện biến
tính mẫu và probe đồng thời trên lame. Ở mầm bệnh do TSV thì hai thao tác này phải
thực hiện tách riêng.



76


Tín hiệu lai mà chúng tôi nhận đƣợc ở tiêu bản WSSV rõ ràng hơn rất nhiều tín
hiệu lai từ tiêu bản TSV. Sở dĩ nhƣ vậy vì là do virus đốm trắng có vật chất di truyền
là DNA nên DNA của virus tập trung trong nhân và làm cho nhân trƣơng to; do đó tín
hiệu lai tạp trung trong nhân và đậm hơn rất nhiều. Còn đối với TSV, là virus RNA
nên RNA của virus tập trung trong tế bào chất, do đó các tín hiệu lai nhận đƣợc không
tập trung, rải rác trong tế bào chất nên tín hiệu lai mờ, không rõ nhƣ ở WSSV.
ISH khi thực hiện trên DNA đơn giản hơn rất nhiều khi thực hiện trên RNA.
Quy trình ISH chuẩn dùng trong nghiên cứu này gồm năm bƣớc chính: chuẩn bị
probe, chuẩn bị mẫu mô, xử lý mẫu trƣớc khi lai, lai và rửa mẫu và bƣớc sau cùng là
phát hiện các tín hiệu sau khi lai. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng bộ kit do
công ty Diagxotics của Mỹ cung cấp, nên không trải qua bƣớc chuẩn bị probe mà sử
dụng probe là DNA mạch đôi đƣợc đánh dấu bằng Digoxigenin do công ty cung cấp.

Vì probe là DNA mạch đôi nên khi biến tính probe thì hai mạch đôi luôn có xu hƣớng
tái bắt cặp lại với nhau, độ nhạy của phƣơng pháp lai không cao. Ngoài ra, trong thí
nghiệm này chúng tôi dùng dung dịch cố định mẫu là Davidson đối với tôm sú, đây là
dung dịch cố định tạo kết tủa protein để bảo tồn DNA trong tế bào và duy trì hình dạng
ban đầu của mẫu mô. Tuy nhiên, trong thành phần của dung dịch này có chứa acid nên
khả năng bảo tồn lƣợng DNA và hình dạng mẫu ban đầu chƣa tốt lắm (Hasson và ctv,
1997) nên một số mẫu lai bị mờ và không giữ đƣợc hình dạng ban đầu. Trƣớc khi lai,
chúng tôi thực hiện xử lý mẫu nhằm mục đích tăng khả năng bắt cặp của probe với
trình tự đích trong mẫu và giảm các tín hiệu nền không mong muốn. Ở đây, chúng tôi
sử dụng Proteinase K nồng độ 2 μg/ml để xử lý làm mềm mẫu, thời gian cắt mẫu với
Proteinase K thích hợp nhất là 15 phút trên tôm postlarvae và 17 phút trên tôm thƣơng
phẩm. Nếu thời gian cắt vƣợt quá mức này thì hình dạng ban đầu của mẫu không duy
trì đƣợc thậm chí mất mẫu mô, nhƣng nếu thời gian cắt quá thấp thì probe xâm nhập
vào mẫu và lai với trình tự đích không tốt nên các tín hiệu lai bị mờ (Baumgart E.,
Schad A. và ctv,1997). Quá trình lai thực hiện ở 42
0
C và ủ qua đêm thuận lợi cho
probe tìm và bắt cặp với trình tự DNA đích trên mẫu (Altar C.A. và ctv, 1989). Mẫu
sau khi lai đƣợc rửa bằng dung dịch SSC với các nồng độ giảm dần và phát hiện các
tín lai bằng cơ chất NBT/BCIP.
IV.6 Những thuận lợi và khó khăn



77


Trong quá trình thực hiện thí nghiệm trên, chúng tôi gặp một số thuận lợi và
khó khăn sau:
IV.6.1 Thuận lợi

Mẫu ít bị tạp nhiễm trong khi thao tác mẫu.
Phƣơng pháp này rất đặc hiệu, không bị nhầm lẫn với các mầm bệnh khác.
Có thể thực hiện chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu.
IV.6.2 Khó khăn
Mẫu dễ bị trôi do thao tác bơm hóa chất lên mẫu với áp lực mạnh.
Mẫu dễ bị khô trong quá trình làm, do thao tác chậm.
Nhuộm màu chƣa làm nổi bậc đƣợc mẫu do hóa chất nhuộm đã bị mất hoạt
tính.
Proteinase K có thể bị mất hoạt tính do tan giá lặp lại nhiều lần.
Probe là đoạn DNA mạch đôi nên độ nhạy kém hơn các loại probe khác.
Đối với những mẫu có mức độ nhiễm bệnh thấp, tín hiệu lai phát ra rất yếu nên.
gặp khó khăn khi phát hiện dƣới kính hiển vi quang học.




IV.7 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp In situ hybridization
IV.7.1 Ƣu điểm
Độ đặc hiệu của phƣơng pháp cao
Phƣơng pháp này không bị tạp nhiễm nhƣ PCR
Chúng ta có thể chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu
IV.7.2 Nhƣợc điểm
Mẫu dễ bị hƣ trong quá trình làm.
Đối với những mẫu nhiễm virus với nồng độ thấp, tín hiệu lai phát ra yếu nên
rất khó khăn khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học.



78

CHƢƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
V.1 Kết luận
V.1.1 Phƣơng pháp In Situ hybridization trong chẩn đoán mầm bệnh do TSV
trên P. vannamei
- Sau khi thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên P. vannamei bằng
phƣơng pháp In Situ hybridization theo quy trình bộ kit, chúng tôi nhận thấy rằng
phƣơng pháp này có thể áp dụng để chẩn đoán mầm bệnh TSV trên P. vannamei rất
hiệu quả và chính xác cao.