Luận văn : ĐÁNH GIÁ TÁC ĐỘNG CỦA CHẾ PHẨM VIÊN NÉN TỪ NHÂN HẠT NEEM (Azadirachta Indica A. Juss) LÊN NGÀI GẠO (Corcyra Cephalonica St.) part 2 ppsx

Ngoài ra chúng còn tấn công hạt giống làm hạt mất khả năng nảy mầm. Tập
tính sinh sống núp trong các hạt nông sản cũng là nguyên nhân gây khó khăn trong
công tác phòng trừ loài côn trùng gây hại này


Hình 2.3. Thành trùng ngài gạo


Hình 2.4. Vòng đời của ngài gạo



Trứ ng
Ấ u trùng
Nhộ ng
Thành trùng





Hình 2.5. Tác hại của ngài gạo

2.6.4. Các phƣơng pháp bảo quản kho nông sản hiện nay
2.6.4.1. Các phƣơng pháp chung
Theo Trần Minh Tâm (2002) để bảo quản kho nông sản hiện nay có 5 phƣơng
pháp chung:
* Bảo quản nông sản ở trạng thái thoáng: để khối nông sản tiếp xúc với môi
trƣờng không khí bên ngoài nhằm điều chỉnh nhiệt độ, ẩm độ trong kho một cách kịp

thời thích ứng với môi trƣờng, do đó giữ đƣợc ẩm độ và nhiệt độ của khối nông sản ở
trạng thái an toàn.
* Phƣơng pháp bảo quản kín: đình chỉ sự trao đổi không khí giữa nông sản với
môi trƣờng bên ngoài giữ cho khối nông sản luôn ở trạng thái an toàn. Mặt khác có
nghĩa là bảo quản trong điều kiên thiếu oxy, do đó hạn chế quá trình hô hấp của hạt,
hạn chế sự phát sinh phát triển của vi sinh vật và côn trùng phá hại.
* Bảo quản nông sản ở trạng thái lạnh: nguyên tắc dùng nhiệt độ thấp làm tê liệt
các hoạt động của vi sinh vật và côn trùng
* Bảo quản nông sản bằng phƣơng pháp hoá học: dùng thuốc hoá học để bảo
quản nông sản, mục đích kìm hãm những hoạt động của khối nông sản và tiêu diệt mọi
hoạt động của sâu mọt, vi sinh vât, các loài gặm nhấm. Đây là phƣơng pháp có hiệu


quả cao, ngày càng đƣợc sử dụng rộng rãi với quy mô lớn.
* Bảo quản trong khí quyển điều chỉnh: bảo quản nông sản trong khí quyển có
điều chỉnh thành phần các chất khí, đồng thời giảm nhiệt độ kho bảo quản nhằm làm
chậm các hoạt động sống của nông sản mà chủ yếu là quá trình hô hấp.
2.6.4.2. Bảo quản nông sản bằng phƣơng pháp hoá học
Là phƣơng pháp sử dụng các chất hoá học, chủ yếu là các chất độc để phòng
chống, bao gồm các chế phẩm hoá học, các sản phẩm có nguồn gốc thực vật. Hiện nay
đây là phƣơng pháp đƣợc sử dụng phổ biến, thông dụng, hiệu quả nhất trên thế giới và
ở Việt Nam. Có nhiều loại khác nhau, mỗi loại có công dụng riêng biệt và tính chất sử
dụng cũng khác nhau. Muốn sử dụng tốt và hiệu quả cần phải đạt các yêu cầu sau:
* Hoá chất đƣợc dùng phải có độc lực cao ( hiệu quả cao đối với côn trùng)
* Dễ sử dụng và ít nguy hiểm đối với con ngƣời, rất ít hoặc không ảnh hƣởng
đến chất lƣợng của hạt và sản phẩm trong kho.
* Hoá chất đƣợc sử dụng không ăn mòn vật liệu xây dựng và các dụng cụ thiết
bị trong kho.
* Có tính ổn định cao, khó nổ, khó cháy, rẻ tiền.
Trong thực tế hiện nay chƣa có loại thuốc nào có thể đáp ứng đầy đủ những yêu

cầu trên, nhƣng căn cứ vào tính chất đầu độc và con đƣờng nhiễm độc của thuốc mà
ngƣời ta chia các loại thuốc thành 3 loại: chất độc tiếp xúc, chất độc vị độc, chất độc
xông hơi.
Hiện nay các hoá chất đƣợc sử dụng phổ biến trong công tác bảo quản nông sản
hiện nay là các hoá chất xông hơi do chúng có thể áp dụng cho nhiều đối tƣợng khác
nhau, chúng sinh ra khí, khói, mù, tác động vào đƣờng hô hấp làm côn trùng bị ngạt
hoặc bị ngộ độc chết. Ƣu điểm là sát trùng triệt để vì chúng có thể xâm nhập bất cứ
chỗ nào trong kho, tuy nhiên nó cũng rất nguy hiểm cho ngƣời và gia súc.
2.6.4.3. Một số loại thuốc kiểm soát côn trùng kho hiện nay
- Thuốc có nguồn gốc hoá học:
Là những loại có độc tính cao, không chỉ đối với sâu mọt mà còn đối với ngƣời
và gia súc…Do đó khi sử dụng phải tuân thủ quy định cho từng loại thuốc. Một số hoá
chất xông hơi thƣờng dùng hiên nay:
* Methyl bromide (CH
3
BR): là chất lỏng không màu, không mùi, d = 3,24, có


tính thẩm thấu mạnh, có độc tính cao đối với côn trùng và cũng rất nguy hại đối với
ngƣời và gia súc. Methyl bromide hiện nay đã bị cấm sử dụng ở nhiều nƣớc do hậu
quả phá hủy tầng ozone và đƣợc công bố là một trong những tác nhân gây ung thƣ.
* Phosphine: khí, không màu, không mùi, trong sản xuất có lẫn tạp chất nên có
mùi tỏi hay mùi đất đen, tỉ trọng 1,181 gần bằng tỉ trọng không khí (dễ thẩm thấu).
Phosphine đƣợc coi là thuốc xông hơi rất độc đối với côn trùng hại kho, bên cạnh đó
cũng rất độc cho ngƣời và gia súc. Phosphine tuy ít độc hơn methyl bromide nhƣng
sau một thời gian dài sử dụng, hiện nay cũng đang gặp trở ngại do tình trạng kháng
thuốc mạnh của nhiều loài côn trùng.
- Thuốc có nguồn gốc thảo mộc
Thuốc thảo mộc diệt trừ sâu hại gồm các chất có trong thực vật nhƣ nicotin
trong thuốc lá và thuốc lào, rotenone trong rễ cây dây mật, pakyziron trong củ đậu,

azadiarchtin trong cây xoan Ấn Độ, artemisinin trong cây thanh hoa vàng (Phạm văn
lầm, 2005)
Các chế phẩm có nguồn gốc thảo mộc cũng có tác dụng diệt trừ côn trùng hại
kho nhƣng hiệu lực không cao bằng thuốc hoá học, tuy nhiên ƣu điểm là ít độc đối với
ngƣời và gia súc, không ảnh hƣởng xấu tới môi trƣờng, dễ phân hủy.
2.7. Phƣơng Pháp Sắc Ký Lỏng Hiệu Năng Cao (HPLC) (Phùng Võ Cẩm Hồng,
2004)
Đây là phƣơng pháp thƣờng sử dụng để định lƣợng hợp chất thứ cấp, trong đó
có các hoạt chất trích từ cây neem.
2.7.1. Nguyên tắc
Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC - High performance liquid
chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn
vào nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng yên (pha
tỉnh). Pha tỉnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thông thƣờng là dung môi
phân cực, pha động thƣờng là nƣớc hoặc dung môi hữu cơ. Đôi khi pha tĩnh là những
chất lỏng ít phân cực lúc đó pha động phải là dung môi phân cực hơn.
2.7.2. Những yếu tố ảnh hƣởng
* Phƣơng pháp chuẩn bị mẫu.
* Nguồn cung cấp (điện, khí, nƣớc, hoá chất).


* Môi trƣờng (gây nhiễm thêm hoặc mất mẫu, gây ảnh hƣởng sức khoẻ, gây
nhiễm bẩn môi trƣờng xung quanh).
2.7.3. Ứng dụng
Phƣơng pháp HPLC có khả năng tách các hợp chất đặc thù nhƣ:
* Các hợp chất cao phân tử và ion thuộc các đối tƣợng nghiên cứu y học , sinh
học.
* Các hợp chất tự nhiên không bền.
* Các hợp chất kém bền nhiệt, các chất dễ nổ.
Ngoài ra phƣơng pháp HPLC còn có những ƣu điểm hơn sắc kí cổ điển nhƣ tốc

độ nhanh, độ tách tốt, độ nhạy cao, cột tách dùng đƣợc nhiều lần, mẫu chất thu lại dễ
dàng vì hầu hết các detector không phá huỷ mẫu.
Do có nhiều tính năng ƣu việt nên đƣợc ứng dụng phổ biến trong các lĩnh vực:
tách các acid nucleic, tách các dƣợc phẩm, tách các steroid, tách các vitamin, tách các
chất bảo quản thực phẩm, tách chất bảo vệ thực vật….
2.7.4. Các bộ phận chính của máy HPLC






. 2.222

2.8. Sơ lƣợc về một số chất phụ gia và bảo quản
2.8.1. Các chất chống oxy hoá giúp tăng cƣờng bảo quản (Antioxydant)
Các chất chống oxy hóa phải đảm bảo các điều kiện sau:
* Không độc.
* Có hoạt tính cao ở nồng độ thấp (0,01 – 0,02 %).
* Nằm ở bề mặt phân cách, có tính kỵ nƣớc khá mạnh, tiếp xúc với không khí.
* Ổn định với các điều kiện chế biến.
Pha
độ ng
Hệ thố ng
chuyể n dung
môi
Hệ
thố ng
bơ m
mẫ u

Cộ t
Detector
Chuẩ n
bị mẫ u
Hệ thố ng
xử lý dữ
liệ u


Một số antioxydant quan trọng : BHT, BHA, tocopherol, axit ascorbic… Trong
đó BHT, BHA là những chất chống oxy hoá đƣợc sử dụng phổ biến nhất.

BHT (butylated hydroxytoluen) có công thức phân tử 2,6 – di – tert – butyl – 4
– methylphenol), là tinh thể màu trắng với mùi khó ngửi, không hoà tan trong nƣớc và
propylene glycol nhƣng hòa tan tốt trong cồn. BHT đƣợc sử dụng nhƣ một tác nhân
chống oxy hóa, do đó nó đƣợc dùng trong công tác bảo quản thực phẩm, mỹ phẩm,
dƣợc phẩm, nguyên liệu đóng gói, nói chung là những sản phẩm có chứa mỡ hoặc dầu.
Ngoài BHT, BHA (butylated hydroxyanisole) cũng có chức năng nhƣ BHT. BHT và
BHA đƣợc biết là an toàn cho ngƣời và động vật sử dụng.
2.8.2. Các chất hấp phụ
Những chất hấp phụ thƣờng đƣợc sử dụng là bột talc, cám gạo, silicagel, than
hoạt tính…
2.8.2.1. Talc
Talc là 1 loại khoáng sản, có tên là hydrated magnesium sheet silicate với công
thức hoá học Mg
3
Si
4
O
10

(OH)
2
. Một tấm talc gồm hàng ngàn phiến cơ bản chồng lên
nhau, phiến cơ bản là sự kết hợp của 1 lớp magnesium-oxygen/hydroxyl octahedra kẹp
giữa 2 lớp siliconoxygen tetrahedra, mặt ngoài chính của phiến cơ bản này không chứa
nhóm hydroxyl hoặc iôn hoạt động, điều này giải thích cho tính kỵ nƣớc và tính trơ
của talc. Có nhiều loại talc, tất cả chúng đều mềm, dẹt, kỵ nƣớc, trơ về mặt hóa học.
Trên thực tế talc không hòa tan trong nƣớc, tan yếu trong axit và kiềm, không gây nổ
hay gây cháy. Mặc dù rất ít hoạt động về mặt hoá học nhƣng talc lại có một ái lực lớn
với các chất hữu cơ.
Công dụng của talc:


Talc là một phần quan trọng trong cuộc sống hằng ngày, đá lát đƣờng đi, tạp chí
chúng ta đọc, sợi polyme, sơn… là một trong những sản phẩm làm từ talc.
* Trong nông nghiệp và thực phẩm, talc là tác nhân chống đóng bánh hiệu quả,
chống dính trong thực phẩm (kẹo gum), giúp đánh bóng gạo, trong quá trình sản xuất
dầu oliu, làm tăng sản lƣợng và sự trong của dầu.
* Trong công nghệ sản xuất giấy, làm láng bề mặt giấy.
* Sản phẩm chăm sóc cơ thể, do tính mềm và trơ, talc đƣợc dùng nhƣ phấn xoa
cơ thể, ngày nay nó đóng vai trò quan trọng trong sản xuất mỹ phẩm, phấn hồng, phấn
mắt, xà bông…

Chƣơng 3
NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu
Chế tạo và thử nghiệm chế phẩm dạng viên nén để phòng trị ngài gạo với hoạt
chất chính trích từ hạt neem trồng tại Việt Nam, bao gồm các giai đoạn nghiên cứu
nhƣ sau:
* Hoàn thiện kỹ thuật ép dầu hạt neem và chiết xuất hoạt chất trong bánh dầu
neem bằng ethanol.
* Định lƣợng ba hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu:
azadirachtin, salannin, nimbin.
* Tạo chế phẩm dạng viên nén và thử nghiệm chế phẩm trên ngài gạo trong
điều kiện phòng thí nghiệm.
3.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.2.1. Kỹ thuật ép dầu từ nhân hạt neem và chiết xuất hoạt chất sinh học từ bánh
dầu neem
Hạt neem thu tại tỉnh Ninh Thuận đƣợc rửa cồn 98

o
sau đó sấy khô ở nhiệt độ
45 – 50
o
C. Sau đó sử dụng máy tách vỏ để thu nhân hạt. Nhân hạt neem đƣợc ép dầu
bằng máy ép chuyên dụng hiệu Komet của Đức (công suất 10 kg hạt/ giờ).
Ƣu điểm của máy là giữ nhiệt độ trong quá trình ép chỉ từ 35 – 40
o
C. Dầu neem
sau khi ép đƣợc giữ ở nhiệt độ 5 – 10
o
C tránh ánh sáng, thêm chất bảo quản BHT 3 %
và tween 5 % tạo thành chế phẩm dầu neem thô, kí hiệu là DN (dầu neem).
Bánh dầu neem (phần bã còn lại sau khi ép dầu) đƣợc ngâm với ethanol 98
o
để
tách các hoạt chất còn lại theo tỉ lệ 1: 4 (bánh dầu : ethanol). Sau 24 giờ, dịch chiết thô
đƣợc loại dung môi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ 60
o
C. Thu nhận dịch
chiết và bảo quản nhƣ dầu neem, gọi là chế phẩm dịch chiết bánh dầu, kí hiệu - DCBD





Hình 3.1. Quy trình ép dầu và chiết xuất hoạt chất từ nhân hạt neem


Hạ t

neem
Tách vỏ
V
ỏ
Nhân hạ t
neem
Ép dầ u
Bánh dầ u
Ngâm bánh
dầ u
Bã neem
Cồ n
98
o

Dị ch
chiế t
neem thô
Cô quay
chân không
Cồ n thu
hồ i
Dị ch
chiế t
neem
(DCBD)
Dầ u
neem

(DN)

Cồ n 98
0

Sấ y 45-50
0

C
Khuấ y, lắ ng,
lọ c
Chấ t bả o
quả n, nhũ
hoá
Chấ t bả o
quả n, nhũ
hoá


3.2.2. Định lƣợng các hoạt chất chính trong dầu neem và dịch chiết từ bánh dầu
neem
Theo schneider và Elmer (1987) việc định lƣơng azadirachtin, nimbin và
salannin đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Mẫu sau khi qua lọc (lỗ lọc = 0,45 µm) đƣợc cho vào ống đựng mẫu có thể
tích 1,5 ml, sau đó đựng vào khay đựng mẫu trong máy HPLC (hiệu Hewlett Packard
1090, series 1 – liquid chromatography) và
Tiến hành chạy mẫu với các thông số sau:
- Lƣợng mẫu bơm vào cột: 0,5 µl.
- Cột bảo vệ: Bondapak
TM

C

18
, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 20 mm.
- Cột phân tích: Bondapak
TM

C
18
, 125 Aº, 10 µm, 3,9 × 300 mm.
- Dung môi rửa cột: CH
3
CN:H
2
O (55 – 45); tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút.
- Detector DAD, Bƣớc sóng 220 nm.
Để xây dựng đƣờng chuẩn của hoạt chất chính cần phân tích, sử dụng
azadirachtin chuẩn của công ty Sigma (USA), nimbin và salannin chuẩn của công ty
Trifolio GmbH (Germany).
Kết quả đƣờng chuẩn nhƣ sau:
- Azadirachtin: y = 3,72 x + 34,58; Hệ số tƣơng quan R = 1.
- Nimbin: y = 14,49 x + 170,5; Hệ số tƣơng quan R = 0,998.
- Salannin: y = 12,634 x + 73,83; Hệ số tƣơng quan R = 1.
Trong đó: y - diện tích pick, x - nồng độ hoạt chất (ppm).
Định lƣợng hoạt chất trong mẫu thử đƣợc tính tự động nhờ phần mềm
chemstation hãng Aligent-technology cho kết quả nồng độ hoạt chất (ppm) có trong
mẫu thử.




a b

c d
Hình 3.2. Một số máy móc, trang thiết bị
a. Máy tách vỏ
b. Máy cô quay chân không
c. Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao
d. Máy ép dầu hạt neem (komet - Đức)
3.2.3. Tạo chế phẩm dạng viên nén với hoạt chất chính là dầu neem và dịch chiết
bánh dầu.
Chế phẩm đƣợc tạo thành trên cơ sở phối trộn dầu neem và dịch chiết bánh dầu
với chất hấp phụ thích hợp, có bổ sung chất chống oxy hoá. Sau đó đùng khuôn để tạo
hình chế phẩm. Tiến hành khảo sát từng bƣớc để chọn lựa loại nguyên vật liệu và nồng
độ thích hợp của chúng trong chế phẩm.
Chất hấp phụ: sử dụng bột talc, cám gạo, silicagel, và than hoạt tính. Từng chất
hấp phụ đƣợc trộn riêng với dầu neem và dịch chiết bánh dầu (nồng độ 5 %). Sau khi
ép tạo hình, các chế phẩm thô này đƣợc dùng để xử lý ngài gạo (đƣợc trình bày chi tiết
ở mục 2.6.3. phần tổng quan tài liệu). Dựa vào kết quả ấu trùng chết sau 48 giờ, khả


năng pha trộn và tạo hình để tạo ra chất hấp phụ thích hợp.
Chất hỗ trợ thăng hoa: sử dụng tinh dầu thông, tinh dầu tràm và tinh dầu bạc hà
– là những thƣơng phẩm dễ dàng mua ở thị trƣờng. Tinh dầu đƣợc chọn chủ yếu dựa
vào kết quả khảo sát sự hao hụt của chúng trong 24 giờ với cùng thể tích ban đầu (10
ml), cùng điều kiện thí nghiệm ( cốc thủy tinh 50 ml, nhiệt độ phòng) và khả năng dẫn
dụ ngài gạo lên trên bề mặt.
Thí nghiệm xác định nồng độ tinh dầu thích hợp đƣợc tiến hành trong phạm vi
từ 0,25 - 0,5 - 1,0 - 2,0 – 4,0 (%) cũng dựa vào khẳ năng dẫn dụ của chúng đối với
ngài gạo.
Chất bảo quản: Sử dụng chất BHT (butylhydroxi toluene) ở nồng độ 3 %.

Hoạt chất chính: dầu neem 10 % phối hợp với dịch chiết bánh dầu ở bốn nồng
độ 5 – 10 – 15 – 20 % trên cùng nền chất hấp phụ, tinh dầu, chất bảo quản đã xác định
trƣớc đó, tạo thành bốn công thức chế phẩm.


Hình 3.3. Quá trình tạo chế phẩm viên nén
3.2.4. Phƣơng pháp nhân nuôi ngài gạo trong phòng thí nghiệm
Ngài gạo đƣợc nuôi trong phòng thí nghiệm trong môi trƣờng nhân tạo với thức


ăn chính là cám gạo, ở điều kiện nhiệt độ phòng, ẩm độ 75 – 85 %. Sau khi vũ hoá,
những con thành trùng (bƣớm) đực và cái đƣợc cho nhốt riêng trong lồng có lƣới đậy
để đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và quét trứng thu đƣợc lên một thau cám
khác để tạo điều kiện chu trứng nở.
Tiến hành bổ sung cám thƣờng xuyên để ấu trùng có đủ dinh dƣỡng, tăng khả
năng vào nhộng.


Hình 3.4. Nhân nuôi ngài gạo trong phòng thí nghiệm

3.2.5. Thử nghiệm sinh học: đánh giá một số tác động cơ bản của 4 chế phẩm đối
với ngài gạo.
3.2.5.1. Vật liệu
- Ấu trùng ngài gạo ( tuổi 3) nhân nuôi ở phòng thí nghiệm, trong môi trƣờng
cám gạo.
- Lọ nhựa loại 1 lít và gạo sạch.
- Ống bắt cặp và thu trứng.
- Giấy đẻ trứng, chổi cọ, kẹp gắp, lọ ủ trứng.
- Chế phẩm neem viên nén.
3.2.5.2. Phƣơng pháp tiến hành

Thí nghiệm đƣợc thực hiện trong các lọ nhựa thể tích 1 lít chứa 400 g gạo sạch
và 20 ấu trùng ngài gạo. Sau khi đặt chế phẩm lên trên bề mặt gạo, đậy kín lọ để thuốc
tác dụng. Sau 3 ngày, mở nắp lọ và đếm số ấu trùng chết. Thí nghiệm đƣợc theo dõi


mỗi ngày để thu nhận số ấu trùng chết thêm và đánh giá sự sinh trƣởng của nhóm đối
tƣợng bị xử lý. Số ấu trùng ngài gạo sống sót sau đợt xử lý sẽ đƣợc tiếp tục nuôi
dƣỡng trong điều kiện bình thƣờng để theo dõi các tác động lâu dài và đa dạng của chế
phẩm neem đối với chúng.
3.2.6. Phƣơng pháp đánh giá kết quả
Đếm tổng số ấu trùng chết sau 3 ngày và 7 ngày xử lý các chế phẩm, từ đó tính
ra tỉ lệ chết của từng nghiệm thức, làm cơ sở để tính LD
50
của các chế phẩm.
Số ấu trùng còn sống sót sau đợt xử lý sẽ đƣợc theo dõi mỗi ngày để ghi nhận
một số chỉ tiêu sinh học nhƣ sau:
* Tỷ lệ thành trùng tạo thành và tỷ lệ thành trùng biến dạng.
* Số lƣợng trứng và tỷ lệ trứng nở của các thành trùng có bề ngoài bình thƣờng
và dị dạng theo cách tiến hành nhƣ sau:
- Các thành trùng đực và cái có hình dạng bình thƣờng trong cùng một nghiệm
thức sẽ đƣợc phối cặp trong các ống nghiệm có đặt sẵn băng giấy để thu trứng. Tổng
số trứng sau khi đếm sẽ đƣợc ủ trong lọ thủy tinh ( loại 15 ml) có chứa gạo để theo dõi
số lƣợng ấu trùng nở.
- Thành trùng cái biến dạng và thành trùng đực có hình dạng bình thƣờng trong
cùng một nghiệm thức cũng sẽ đƣợc phối cặp với nhau và cũng thực hiện các bƣớc
giống nhƣ trên.
3.2.7. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm gồm có 20 nghiệm thức (4 loại chế phẩm × 5 nồng độ xử lý) đƣợc
bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi nghiệm thức đƣợc lặp lại 3 lần. Mỗi nghiệm
thức có chứa 20 ngài gạo tuổi 3.

Bốn chế phẩm là NV1, NV2, NV3, NV4.
Năm nồng độ xử lý là: 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 g/ dm
3
.
3.2.8. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu của các nghiệm thức đƣợc phân tích biến lƣợng ANOVA (Analysis of
variance) và phân hạng theo trắc nghiệm Duncan, thao tác trên phần mềm statgraphic
7.0. Độ độc của chế phẩm (LC
50
, LD
50
) đƣợc tính theo phƣơng pháp phân tích probit.




a b

c d

e
Hình 3.5. Quá trình tiến hành thí nghiệm
a,b. Bố trí thí nghiệm
c. Đếm sâu chết sau thí nghiệm
d. Bắt cặp ngài gạo
e. Quá trình ủ trứng

Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Hiệu suất thu nhận dầu neem bằng phƣơng pháp ép nguội
Kết quả sử dụng máy Komet (Đức) để ép nguội nhân hạt neem (ẩm độ 14,8 %) với
tốc độ 10 kg nhân/ giờ, chúng tôi thu đƣợc dầu neem màu vàng nâu với hiệu suất 30
%. Ƣu điểm của máy này là khống chế đƣợc nhiệt độ 35 - 40
o
C trong quá trình ép, vì
vậy không ảnh hƣởng đến tính ổn định của các thành phần hoạt chất có trong dầu.
Ngoài ra, khi ép còn trích ra đƣợc nhiều limonoid và hợp chất sulfur có trong nhân hạt,
góp phần làm tăng hoạt tính kháng khuẩn và côn trùng của dầu neem. Nhìn chung,
phƣơng pháp này dễ thực hiện, ít tốn kém, năng suất tƣơng đối cao và có khả năng đáp
ứng yêu cầu của sản xuất lớn.
4.2 Kết quả định lƣợng một số hoạt chất chính trong các chế phẩm neem thô
Bảng 4.1. Hàm lƣợng (ppm) của một số hoạt chất trong dầu neem và dịch
chiết bánh dầu
Hoạt chất
Chế phẩm neem thô
Dầu neem
Dịch chiết bánh dầu
Azadirachtin
Nimbin
Salannin
930,69
262,58
1027,48
7703,61
841,09
3214,56

Tổng số
2220,75
11759,26

Theo Seeni và ctv (1993), hàm lƣợng hoạt chất trong cây neem phụ thuộc chủ yếu
vào giống và điều kiện sinh trƣởng của cây. Ngoài ra, những yếu tố khác nhƣ tuổi
cây, điều kiện địa lý nơi trồng ( trong đó quan trọng nhất là điều kiện nhiệt độ, độ ẩm,


ánh sáng), thời điểm thu hoạch quả, kỹ thuật sơ chế, bảo quản nguyên liệu và kỹ thuật
chiết xuất, ly trích cũng đóng vai trò quan trọng đối với hoạt chất.
Kết quả phân tích cho thấy hàm lƣợng azadirachtin trong dầu neem Việt Nam thu
đƣợc từ phƣơng pháp ép nguội là 930,69 ppm, cao hơn nhiều so với phƣơng pháp
chiết xuất bằng dung môi hữu cơ. Theo Vũ Đăng Khánh (2003), dầu neem Ấn Độ và
Việt Nam đƣợc thu nhận bằng phƣơng pháp chiết xuất bột nhân hạt neem trong hexan
có hàm lƣợng azadirachtin thấp, tƣơng ứng là 90 ppm và 100 ppm. Tuy nhiên, do là
chất phân cực mạnh nên azadirachtin chỉ tan tốt trong dung môi phân cực nhƣ ethanol,
vì vậy trong dịch chiết bánh dầu, kết quả hàm lƣợng azadirachtin lên đến 7703,61
ppm. Hàm lƣợng nimbin và salannin trong dịch chiết bánh dầu cũng cao hơn trong dầu
neem, tƣơng ứng là 841,09 và 3214,56 ppm trong dịch chiết bánh dầu; 262,58 và
1027,48 ppm trong dầu neem. Tổng cộng 3 thành phần hoạt chất chính thì dịch chiết
bánh dầu chứa 11759,26 ppm, dầu neem chứa 2220,75 ppm.
4.3.Tạo chế phẩm viên nén
4.3.1. Chất hấp phụ
Mục tiêu là tìm kiếm các nguyên liệu ít độc, không phản ứng hóa học với chất
bị hấp phụ và phức chất tạo thành sẽ giải phóng từ từ các chất bị hấp phụ mà không
làm thay đổi hoạt tính của chúng. Ngoài ra còn ƣu tiên chọn loại vật liệu có giá rẻ và
dễ ép thành viên.
Dựa vào kết quả thí nghiệm sàng lọc trên nhiều loại vật liệu tại Viện Sinh Học
Nhiệt Đới (Lê Thị Thanh Phƣợng, 2005), chúng tôi chỉ tập trung khảo sát hai loại

nguyên liệu là bột talc và cám gạo. Các nguyên liệu trên đƣợc trộn với dầu neem và
dịch chiết bánh dầu riêng rẽ hoặc phối hợp ở nồng độ 10 %, bổ sung tinh dầu thông 1
% để hỗ trợ thăng hoa. Sau khi phối trộn, xử lí ngài gạo ở liều 2 g/ dm
3
. Kết quả trình
bày ở bảng 4.2.
Nhìn chung, sự kết hợp giữa dầu neem (DN) và dịch chiết bánh dầu (DCBD)
trên 3 loại nguyên liệu đều mang lại hiệu quả gây chết ngài gạo cao hơn so với từng
chế phẩm riêng lẽ. Trên nền bột talc, hỗn hợp DN – DCBD cho tỉ lệ chết ấu trùng cao
nhất là 81,2 %, nhiều hơn 32,3 % so với DN 10 % và nhiều hơn 12,7 % so với DCBD
10 %. Trên nền cám gạo, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 63,5 %,


nhiều hơn 39 % so với DN và nhiều hơn 22,8 % so với DCBD. Tƣơng tự, trên nền talc
– cám, hỗn hợp DN – DCBD cho tỷ lệ chết ấu trùng là 71,6 %, nhiều hơn 33,1 % so
với DN và 19,7 % so với DCBD.
Bảng 4.2. Tỉ lệ (%) ấu trùng chết sau 3 ngày

Nguyên liệu
Chế phẩm neem thô (10 %)
DN
DCBD
DN - DCBD
Bột talc
48,9 a
68,5 a
81,2 a
Cám gạo
24,5 c
40,7 c

63,5 c
Talc: Cám (5:5)
38,5 b
51,9 b
71,6 b
* Các trị số trong một cột có cùng kí tự không khác biệt về thống kê ở p < 0,05 (trắc nghiệm Duncan)
Mặt khác, DN 10 % kết hợp với DCBD 10 % trên nền bột talc gây chết 81,2 %
ấu trùng, khác biệt có ý nghĩa so với 2 nghiệm thức cám gạo và hỗn hợp talc-cám
(tƣơng ứng là 63,5 và 71,6 %). DCBD 10 % trên nền bột talc cho tỉ lệ chết của ấu
trùng (68,5 %) cao hơn DCBD 10 % trên nền cám gạo (40,7 %) và hỗn hợp talc – cám
(51,9 %). Tƣơng tự, DN 10 % trên nền bột talc cũng cho tỉ lệ chết của ấu trùng (48,9
%) cao hơn so với trên nền cám gạo và hỗn hợp talc - cám (tƣơng ứng là 24,5 % và
38,5 %). Tóm lại, các chế phẩm neem thô đều có hiệu lực gây chết ngài gạo mạnh nhất
trên nền bột talc, kế đến là trên nền talc - cám, còn trên nền cám gạo cho tỉ lệ chết ấu
trùng thấp nhất. Ở đây chúng ta có thể giải thích nhƣ sau: talc có cấu trúc xốp, dễ hấp
phụ và nhả hấp phụ nên nâng cao hiệu quả của thí nghiệm xông hơi, còn cám gạo có
lẫn nhiều tinh bột, khi gặp nƣớc sẽ trƣơng nở, không xốp, khó nhả hấp phụ, do đó cản
trở khẳ năng bay hơi của các hoạt chất.
4.3.2. Hoạt chất chính
Theo Võ Quang Long (2005), cho thấy DN và DCBD đều ức chế ngài gạo theo
các phƣơng thức khác nhau từ đó hƣớng đến việc nên phối hợp cả DN và DCBD trong
chế phẩm viên nén sao cho đạt hiệu quả cao, dễ thao tác và bảo quản. Kết quả nghiên


cứu trƣớc cho thấy khả năng thăng hoa của DN rất thấp, nhƣng ngoài bản thân là hoạt
chất chính, DN còn góp phần bảo vệ chế phẩm trƣớc tác động ánh sáng. Từ những kết
quả trên chúng tôi tiến hành tạo và thử nghiệm 4 công thức chế phẩm viên nén từ
neem (kí hiệu NV1, NV2, NV3, NV4) với DCBD tƣơng ứng là 5 – 10 – 15 – 20 %, kết
hợp trên nền bột talc, DN 10 % , dầu thông 1 % và BHT 3 %. Các chế phẩm xử lý
ngài gạo theo phƣơng thức xông trong lọ nhựa (mục 3.2.4.2./ phần nội dung phƣơng

pháp). Kết quả thử nghiệm đƣợc trình bày ở mục 4.4.
4.4. Thử nghiệm chế phẩm
4.4.1. Tác động gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo
Quá trình tiến hành thử nghiệm 4 chế phẩm đƣợc phối trộn bởi DN, DCBD, bột
talc và dầu thông trên ngài gạo ở những liều xử lý khác nhau, bằng cách đặt chế phẩm
vào trong lọ nhựa có sẵn 20 ấu trùng ngài gạo, bịt kín lọ và tiến hành xông trong vòng
3 ngày, sau đó mở nắp và ghi nhận kết quả sâu chết.
Ở những nghiệm thức xử lý, nhận thấy sâu chết ở các tỉ lệ khác nhau, nằm rãi
rác bên trong lớp gạo và cả trên bề mặt gạo. Ngoài tác dụng hỗ trợ thăng hoa, tinh dầu
thông 1 % trong công thức chế phẩm còn có khả năng thu hút ấu trùng ngài gạo ra
khỏi tổ của nó và bò lên bề mặt, vì vậy góp phần nâng cao khả năng thâm nhập của
chế phẩm vào côn trùng. Ở các lô đối chứng, không hề có hiện tƣợng sâu chết sau 3
ngày đóng kín nắp lọ.
Theo dõi và ghi nhận tỷ lệ chết của ấu trùng sau 3 ngày, chúng tôi thu đƣợc kết
quả ở bảng 4.3
Nhận xét: kết quả trình bày ở bảng 4.3 cho thấy tất cả các chế phẩm từ NV1 cho
đến NV4 đều có khả năng gây chết cho ấu trùng sau 3 ngày xử lý ở các tỷ lệ khác
nhau, tuy nhiên tác động này còn phụ thuộc vào nồng độ xử lý của chế phẩm. Ở đây ta
nhận thấy, chế phẩm NV1 ở liều xử lý 0,5 g/ dm
3
có hiệu lực gây chết ngài gạo thấp
nhất (25,5 %), còn chế phẩm NV4 ở liều xử lý 2,5 g/ dm
3
có hiệu lực cao nhất (85,3
%).
Trong cùng một chế phẩm, khi tăng liều xử lý thì tỉ lệ chết của ấu trùng sau 3
ngày xử lý cũng tăng lên. Cụ thể, khi liều xử lý tăng từ 0,5 g đến 2,5 g thì hiệu lực gây
chết của các chế phẩm NV1, NV2, NV3 và NV4 tăng tƣơng ứng từ 25,5 % đến 47,7
%; từ 35,8 đến 64,5 %; từ 40,2 % đến 80,7 % và từ 48,2 đến 85,3 %.

Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỉ
lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, còn NV1 cho tỉ lệ chết ấu
trùng là thấp nhất. Chẳng hạn với liều xử lý 2,5 g; chế phẩm NV4 gây chết 85,3 % ấu
trùng (cao nhất), NV3 gây chết 80,7 % ấu trùng, NV2: 64,5 %, còn NV1 chỉ gây chết
47,7 % ấu trùng (thấp nhất). Nhƣ vậy nồng độ dịch chiết bánh dầu khác nhau giữa các
chế phẩm ảnh hƣởng đáng kể tới kết quả thí nghiệm. Khi ta tăng nồng độ dịch chiết
bánh dầu thì tỷ lệ chết của ấu trùng cũng tăng theo. Nồng độ dịch chiết bánh dầu trong
chế phẩm tăng kết hợp với liều xử lý của chế phẩm tăng cho kết quả tỷ lệ chết ấu
trùng cũng tăng theo.
Bảng 4.3. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 3 ngày sau xử lý
STT
Chế phẩm
Liều xử lý (g)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1
NV 1

25,5

29,3

35,3

41,5

47,7
2
NV 2

35,8

40,5

48,6

56,8

64,5
3
NV 3

40,2

47,7

56,5

68,8

80,7
4
NV 4

48,2

56,8

67,6

75,4

85,3

Trên cơ sở tỷ lệ chết (%) ấu trùng thu đƣợc sau 3 ngày theo dõi, chúng tôi tiến
hành phân tích Probit bằng phần mềm Excel để xác định LD
50
và độ độc tƣơng đối của
các chế phẩm thử nghiệm, thu đƣợc kết quả ở bảng 4.4.
Qua phân tích probit cho thấy LD
50
ở thời điểm sau 3 ngày xử lý của các chế
phẩm là 3,5818 g/ dm
3
; 1,3452 g/ dm
3
; 0,8959 g/ dm
3
và 0,634 g/ dm
3
tƣơng ứng với
NV1, NV2, NV3 và NV4. Nhƣ vậy LD
50
của NV1 > NV2 > NV3 > NV4. Gi á tr ị
LD
50

tỷ lệ nghịch với độc tính của chế phẩm, tức LD
50
càng nhỏ thì độc tính của chế
phẩm càng cao. Nhƣ vậy, độc tính của chế phẩm NV4 là cao nhất (gấp 5,65 lần chế
phẩm NV1), kế đến là NV3 (gấp 3,99 lần NV1), tiếp đến là NV2 (gấp 2,66 lần NV1),
còn chế phẩm NV1 có độc tính thấp nhất.


Bảng 4.4. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD
50
ở thời điểm 3
ngày sau xử lý)
Stt
Chế
phẩm
Phƣơng trình
tƣơng quan
Hệ số
tƣơng
quan
P
LD
50
(g/ dm
3
)
Độc
tính
tƣơng
đối

1
NV1

Y = 3,6891 + 0,8435 X

0,9593

0,0097

3,5818
1
2
NV2

y = 3,8781 + 0,9939 X

0,9417

0,0167

1,3452
2,66
3
NV3

Y = 3,5726 + 1,4984

0,9315

0,0212

0,8959
3,99
4
NV4

Y = 3,8098 + 1,4838 X

0,9538

0,0118

0,6340
5,65


a b
c d
Hình 4.1. Kết quả 3 ngày sau xử lý chế phẩm
a. Đối chứng
b, c, d. Sâu chết ở những lô có xử lý chế phẩm


Sau khi xử lý xông hơi trong 3 ngày, các lọ thí nghiệm đƣợc thông thoáng và
tiếp tục nuôi dƣỡng để theo dõi tỷ lệ ấu trùng chết thêm ở những ngày sau đó. Tỷ lệ
chết tích lũy ở ngày thứ 7 sau xử lý đƣợc ghi nhận ở bảng 4.5 nhƣ sau:

Bảng 4.5. Tỉ lệ chết (%) của ấu trùng 7 ngày sau xử lý

STT

Chế phẩm
Liều xử lý (g)
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
1
NV 1
42,2
47,7
56,7
65,5
73,2
2
NV 2
58,7
67,7
75,5
78,7
85,3
3
NV 3
76,7
83,3
86,0
93,3
96,7
4
NV 4

76,7
80,2
86,8
93,3
95,5

Sau 7 ngày xử lý, nhận thấy tỷ lệ sâu chết là rất cao, ngoại trừ chế phẩm NV1 ở
liều xử lý 0,5 g và 1,0 g cho tỷ lệ sâu chết không cao, tƣơng ứng l à 42,2 % và 47,7 %.
Tất cả các nghiệm thức còn lại đều cho tỷ lệ sâu chết trên 50 %, trong đó chế phẩm
NV4 ở liều xử lý 2,5 g gây chết ấu trùng nhiều nhất, lên đến 95,5 %.
Trong cùng một chế phẩm, khi ta tăng liều xử lý lên thì tỷ lệ chết của ấu trùng
sau 7 ngày xử lý cũng tăng lên. Ví dụ, khi tăng liều xử lý từ 0,5 g lên 2,5 g thì hiệu lực
gây chết ấu trùng của các chế phẩm NV1, NV2, NV3, NV4 tăng tƣơng ứng từ 42,2 %
đến 73,2 %; 58,7 đến 85,3 %; 76,7 đến 96,7 %; 76,7 đến 95,5 %.
Trong cùng một liều xử lý, chế phẩm NV4 với 20 % dịch chiết bánh dầu cho tỷ
lệ chết ấu trùng là cao nhất, kế đến là chế phẩm NV3, NV2, còn NV1 cho tỷ lệ chết ấu
trùng là thấp nhất. Ví dụ với liều xử lý 2,5 g, chế phẩm NV4 gây chết 95,5 % ấu trùng
sau 7 ngày xử lý, NV3 cho tỷ lệ chết 96,7 %, NV2: 85,3 %, NV1: 73,2 %.




Bảng 4.6. Độc tính của các chế phẩm đối với ngài gạo (Giá trị LD
50
ở thời điểm 7
ngày sau xử lý)

STT
Chế
phẩm

Phƣơng trình
tƣơng quan
Hệ số
tƣơng
quan
P
LD
50
(g/ dm
3
)
Độc
tính
tƣơng
đối

1

NV 1

Y = 3,9121 + 1,1431 X

0,9523

0,0123

0,8948

1

2

NV 2

Y = 4,3861 + 1,1274 X

0,9795

0,0035

0,3503

2,55

3

NV 3

Y= 4,5693 + 1,4878 X

0,9312

0,0213

0,1948

4,59

4

NV 4

Y = 4,6161 + 1,3992 X

0,9330

0,0205

0,1881

4,76

Qua phân tích Probit đã tính đƣợc giá trị LD
50
của các chế phẩm ở thời điểm 7
ngày sau xử lý là 0,8948 g/dm
3
; 0,3503 g/dm
3
; 0,1948 g/dm
3
v à 0,1881 g/dm
3
, tƣơng
ứng với NV1, NV2, NV3 v à NV4. Nhƣ vậy LD
50
của NV1 > NV2 > NV3 > NV4.
Qua đó cũng cho thấy độc tính của 2 chế phẩm NV3 và NV4 là cao nhất, gấp
4,59 – 4,76 lần so với chế phẩm NV1, kế đến là chế phẩm NV2 (cao gấp 2,55 lần chế
phẩm NV1), còn chế phẩm NV1 có độc tính thấp nhất.

Mặt khác khi so sánh giữa bảng 4.3 và 4.5 ta thấy LC
50
của mỗi chế phẩm ở
thời điểm 3 ngày cao hơn rất nhiều so với ở thời điểm 7 ngày. Cụ thể: đối với các chế
phẩm NV1, NV2, NV3, NV4, LD
50
(g/ dm
3
) ở thời điểm 3 ngày tƣơng ứng là 3,5818;
1,3452; 1,3452; 0,8959; 0,634, còn ở thời điểm 7 ngày tƣơng ứng là 0,8948; 0,3503;
0,1948; 0,1881. Điều đó gợi ra rằng, có thể rút ngắn thời gian xử lý mà vẫn bảo đảm
hiệu quả tác động nếu tăng liều thuốc lên. Ví dụ đối với chế phẩm NV4: muốn diệt 50
% ngài gạo trong 3 ngày thì phải dùng lƣợng thuốc là 0,634 g/dm
3
- gấp 0,634/ 0,1881
= 3,3 lần lƣợng thuốc so với khi xử lý trong 7 ngày.



4.4.2. Động thái gây chết của các chế phẩm đối với ngài gạo


0
25.5
36.3
42.2
0
35.8
45.4
58.7

0
40.2
68.5
76.7
0
48.2
64.8
76.7
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 ngày 3 ngày 5 ngày 7
Thời gian
Tỉ lệ chết (%)
NV1 NV2 NV3 NV4



Biểu đồ 4.1. Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 0,5 g/ dm
3


Qua biểu đồ 4.1 ta nhận thấy ở liều lƣợng 0,5 g/ dm

3
, tất cả các chế phẩm đều
có tác dụng gây chết cho ngài gạo ở các mức độ khác nhau, tuy nhiên tỷ lệ chết của ấu
trùng không cao lắm. Sau 7 ngày xử lý, chỉ có chế phẩm NV3 và NV4 đạt 76,7 %, còn
NV2 và NV1 chỉ đạt 58,7 % và 42,2 %.
Mặt khác cũng có thể thấy ấu trùng tập trung chết trong 3 ngày đầu xử lý chế
phẩm, trong 3 ngày đầu tỷ lệ chết ấu trùng của NV1, NV2, NV3, NV4 lần lƣợt là 25,5;
35,8; 40,2; 48,2 %, tuy nhiên tỷ lệ này vẫn còn thấp. Có thể do nồng độ thuốc xử lý
quá ít nên tỷ lệ chết ấu trùng không cao, chỉ những ấu trùng nào mẫn cảm với thuốc
mới chết trong vài ba ngày đầu xử lý chế phẩm, còn những ấu trùng ít mẫn cảm, thì
không chết liền ngay sau khi xử lý, mà chúng sống yếu ớt trong những ngày sau đó rồi
mới chết. Trong khoảng thời gian từ ngày 3 tới ngày 7 tỷ lệ ấu trùng chết thêm của các
chế phẩm lần lƣợt là 16,7 %, 22,9 %, 36,5 %, 28,5 %.
Ở đây có một sự khác biệt giữa chế phẩm NV3 và các chế phẩm khác, đó là
trong giai đoạn từ ngày 3 tới ngày 7, NV3 có tỷ lệ ấu trùng chết tăng đột biến, ngày 3


chỉ gây chết 40,2 % ấu trùng nhƣng ngày 3 tới ngày 7 tăng thêm tới 36,5 %, điều này
thể hiện rõ trên biểu đồ 4.1


0
29.3
38.5
47.7
0
40.5
53.1
67.7
0

47.7
65.7
83.3
0
56.8
62.5
80.2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 ngày 3 ngày 5 ngày 7
Thời gian
Tỉ lệ chết (%)
NV1 NV2 NV3 NV4

Biểu đồ 4.2. Động thái gây chết của các chế phẩm ở liều xử lý 1 g/ dm
3


Tƣơng tự nhƣ ở liều xử lý 0,5 g/ dm
3
, ở 1,0 g/ dm
3

, dƣới tác động của các chế
phẩm, ấu trùng ngài gạo cũng tập trung chết trong 3 ngày đầu, tỷ lệ chết tuy có cao
hơn ở liều xử lý 0,5 g/ dm
3
nhƣng nhìn chung vẫn còn thấp, trong 3 ngày đầu chỉ có
NV4 gây chết 56,8 % ấu trùng, còn những chế phẩm còn lại cho tỷ lệ chết của ấu trùng
đều dƣới 50 %, NV1, NV2, NV3 cho tỷ lệ chết ấu trùng tƣơng ứng là 29,3; 40,5; 47,7
%
Quan sát biểu đồ cũng thấy ở chế phẩm NV3 có sự khác biệt, trong khoảng thời
gian từ ngày 3 tới ngày 7 dƣới tác động của NV3, tỷ lệ chết ấu trùng cũng tăng lên
đáng kể, vƣợt qua chế phẩm NV4 mặc dù trong 3 ngày đầu nó gây chết ấu trùng ít
hơn.