Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM part 3 pptx

19
thì 11 kiểu huyết thanh trên đã chiếm 80% các chủng Salmonella phân lập được từ các
mẫu bệnh phẩm [5].
Trong khi đó, sự hiện diện của Salmonella trong môi trường và trong thực phẩm
là rất cao, chúng phân bố ở mọi nơi khắp thế giới. Theo nhiều cuộc điều tra ở Anh, Mỹ
cho thấy tỷ lệ nhiễm Salmonella trong phân khoảng 9 – 14,4%, manh tràng nhiễm
44,8%, hạch màng treo ruột 27%, xúc xích 28 – 29,7% và thịt heo tươi nhiễm 4,15%
[15]. Salmonella hiện diện trong 65% mẫu nước được phân lập ở dọc theo Peavine
Creek ở Decatur [3]. Trong một cuộc khảo sát sự hiện diện của Salmonella tại các
sông ở Địa Trung Hải, các nhà nghiên cứu cũng phân lập được hơn 574 chủng
Salmonella thuộc hơn 40 kiểu huyết thanh khác nhau [5]. Tại Việt Nam, trong cuộc
điều tra về sự ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm trên thị trường Hà Nội, kết quả cho
thấy: tỷ lệ nhiễm Salmonella trong thịt lợn vào khoảng 33,33%, thịt bò khoảng 40%,
thịt gà khoảng 39,29% và giò sống khoảng 46,67% [13]. Theo Nguyễn Thị Oanh và
Tiêu Quang An (2003), tỷ lệ nhiễm Salmonella ở trâu, bò tại Đắc Lắc vào khoảng
45,36% và 41,25% [9]. Tại hội thảo 2004 về vệ sinh an toàn thực phẩm, chi cục Thú y
Tp.HCM cho biết kết quả xét nghiệm năm 2003 với 299 mẫu thịt tươi tại các chợ cho
thấy khoảng 18% nhiễm Salmonella [20]. Các tỷ lệ nhiễm Salmonella trong môi
trường và thực phẩm cao như trên cho thấy khả năng hiện diện Salmonella trong thành
phẩm chế biến có ít hay nhiều là không tránh khỏi.
Tuy nhiên, vấn đề đặt ra có phải tất cả Salmonella hiện diện trong thực phẩm,
môi trường đều gây nguy hại cho người. Theo AFSSA, số kiểu huyết thanh Salmonella
phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm chỉ chiếm dưới 4,4% số kiểu huyết thanh phân
lập được từ môi trường [5]. Đồng thời, các nghiên cứu của Reilly et al., 1992 tại xứ
Wales và Australia cho thấy S. weltevreden là kiểu huyết thanh thường xuyên phát
hiện trong các hồ nuôi tôm nhưng kết quả thống kê của CDC Hoa Kỳ cho thấy kiểu
huyết thanh này rất hiếm khi được phân lập từ mẫu bệnh phẩm của người [5]. Điều đó
có nghĩa là khả năng gây bệnh của các kiểu huyết thanh này là rất thấp. Một nghiên
cứu khác, xác định độc lực trên chuột của các chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh
phẩm và thực phẩm cho thấy 20/20 chủng có nguồn gốc từ thực phẩm đều không có
khả năng gây bệnh và gây chết cho chuột [3, 5]. Như vậy, chúng ta có thể nói rằng chỉ

có một số ít trong khoảng 2500 kiểu huyết thanh Salmonella thì có khả năng gây bệnh.

20
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Thời gian thực hiện: từ tháng 3/2005 – 7/2005.
Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện tại Trạm xá Thú Y- Khoa Chăn Nuôi
Thú Y và Phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học Môi trường- Khoa Công Nghệ Môi
Trường- Trường ĐH Nông Lâm TP. HCM.
3.2. DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ
- Đĩa petri
- Ống nghiệm
- Erlen các loại
- Ống đong các loại
- Becher các loại
- Pipetman các loại 100 µl, 1000 µl
- Pipet 10 ml
- Đèn cồn
- Que cấy vòng, thẳng, trang
- Bao PE vô trùng
- Khay mổ
- Kéo mổ
- Kẹp gắp
- Máy lắc
- Tủ ấm
- Tủ sấy
- Cân
3.3. HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƢỜNG
3.3.1. Hóa chất

- NaCl 0,85% vô trùng
- Cồn 60 – 70
o

- Nước cất.
3.3.2. Môi trƣờng
- Môi trường BHI (Brain Heart Infusion Broth): Dùng để phục hồi và tăng sinh
các chủng Salmonella trong quá trình nghiên cứu. Thành phần môi trường gồm: Dịch
não bê 200g, Dịch tim bê 250g, Proteose peptone 10g, NaCl 5g, Na
2
HPO
4
2,5g,
Dextrose 2g, Nước cất 1lít.
- Môi trường TSA (Trypticase Soy Agar): Môi trường thạch dùng để giữ giống.
Thành phần môi trường gồm: Tripticase peptone 15g, Phytone peptone 5g, NaCl 5g,
Agar 15g, Nước cất 1lít.
21
- Môi trường XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar): Môi trường dùng để
định lượng Salmonella. Thành phần môi trường gồm: Cao nấm men 3g, L- lysine 5g,
Xylose 3,75g, Lactose 7,5g, Sucrose 7,5g, Sodium desoxycholate 2,5g, Ferric
ammonium citrate 0,8g, NaCl 5g, Agar 15g, Phenol red 0,08g, Nước cất 1lít. Môi
trường XLD tổng hợp được pha chế trong nước cất vô trùng, đun sôi cho tan đều, để
nguội đến 50 – 60
o
C và sau đó đổ vào đĩa petri.
Tất cả các môi trường trên (trừ XLD) đều được hấp khử trùng ở 121
o
C trong 15
phút.

3.4. NGUYÊN VẬT LIỆU
3.4.1. Chủng vi sinh vật
Bảng 3.1. Các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu
STT
CHỦNG
NGUỒN GỐC
NGUỒN PHÂN LẬP
1
Salmonella enteritidis 99.303
Viện Pasteur
(1)

Bệnh phẩm người
2
S.enteritidis 02.158
Viện Pasteur
Bệnh phẩm heo
3
S. typhimurium
Viện Pasteur
Bệnh phẩm heo
4
S.typhimurium 02.157
Viện Pasteur
Bệnh phẩm heo
5
Salmonella SP 1b
TT.CL,ATVS 4
(2)

Thịt heo
6
Salmonella SP 2a
TT.CL,ATVS 4
Thịt heo
7
Salmonella SP1a
TT.CL,ATVS 4
Thịt heo
8
Salmonella SB 10
TT.CL,ATVS 4
Thịt bò
9
Salmonella SB11
TT. CL,ATVS 4
Thịt bò
10
Salmonella Ô13
CNSHMT
(3)

Ốc
11
Salmonella B34
CNSHMT
Thịt bò
12
Salmonella M14
CNSHMT

Mực
13
Salmonella VTr11
CNSHMT
Vỏ trứng
14
Salmonella H51
CNSHMT
Thịt heo

(1)
Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh,
(2)
Trung Tâm Chất lượng, An toàn vệ sinh và Thú y thủy sản
vùng 4, TP. Hồ Chí Minh,
(3)
Phòng Công Nghệ Sinh Học Môi Trường, Trường Đại Học Nông Lâm,
TP. Hồ Chí Minh.


22
3.4.2. Chuột
Thuộc loài chuột bạch Mus musculus trọng lượng khoảng 18 – 20 g, được mua
tại Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Chuột thí nghiệm khỏe mạnh, sạch bệnh.
3.5. PHƢƠNG PHÁP
Nguyên tắc chung: Mọi thao tác thí nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện
vô trùng. Mọi dụng cụ thí nghiệm, môi trường dinh dưỡng phải được vô trùng trước
khi sử dụng.
3.5.1. Phƣơng pháp pha loãng vi sinh vật
Chủng vi khuẩn được hoạt hóa trên môi trường BHI, ủ ở 37

o
C trong khoảng 18
– 24 giờ. Hút 1 ml dịch sau tăng sinh cho vào ống nghiệm chứa 9 ml NaCl vô trùng để
được độ pha loãng 10
-1
, lắc đều, hút 1 ml từ nồng độ này cho vào một ống nghiệm
khác chứa 9 ml NaCl để được độ pha loãng 10
-2
, cứ tiếp tục tương tự ta được các độ
pha loãng tiếp theo. Các thí nghiệm trong nghiên cứu này sử dụng đến độ pha loãng
10
-8
.
3.5.2. Phƣơng pháp xác định mật độ tế bào bằng cách đếm khuẩn lạc
Hút 0,1 ml dịch vi khuẩn sau khi pha loãng cho vào đĩa môi trường XLD đã
được chuẩn bị trước. Dùng que tam giác trải đều dịch trên môi trường. Mỗi độ pha
loãng được trải ít nhất trên 2 đĩa. Ủ ở 37
o
C trong 18 - 24 giờ. Chọn các đĩa có số đếm
từ 25 – 250 khuẩn lạc để tính kết quả. Số lượng vi sinh vật trong 1 ml mẫu được tính
theo công thức sau: [2, 3, 4]



Trong đó: C: Số lượng Salmonella trong 1 ml mẫu (CFU/ml)
N: Số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn
n
i
: Số lượng đĩa được đếm tại độ pha loãng thứ i
V

i
: Thể tích dịch mẫu cấy vào trong một đĩa
f
i
: Độ pha loãng tương ứng.


N
n
1
x V
1
x f
1
+ … + n
i
x V
i
x f
i

(cfu/ml)
C =
23
3.5.3. Phƣơng pháp gây nhiễm trên chuột
Khử trùng sạch bề mặt khu vực tiến hành gây nhiễm bằng cồn. Người tiến hành
gây nhiễm phải đeo găng tay cao su. Chuẩn bị một cái khay sạch. Dùng xy-lanh hút
lượng dịch vi khuẩn cần cho chuột uống.
Cách gây nhiễm vi khuẩn vào chuột qua đường miệng được tiến hành như sau:
Đặt chuột bò trên bề mặt lồng, tay phải nắm lấy đuôi, ngón tay trỏ và ngón tay cái bên

trái nắm lấy hai tai và gáy chuột, ngón tay út trái kẹp lấy đuôi của chuột. Lật ngửa
chuột lên và để theo chiều thẳng đứng. Tay phải lấy xy-lanh có dịch vi khuẩn và cho
chuột uống. Thao tác được tiến hành nhẹ nhàng để tránh làm tổn thương chuột. Chuột
sau khi được gây nhiễm, theo dõi biểu hiện bệnh hằng ngày. Quá trình theo dõi được
thực hiện liên tục trong 14 ngày.
3.5.4. Phƣơng pháp khảo sát sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày,
ruột non và ruột già
Chuột bị chết sau khi gây nhiễm hoặc sau thời gian theo dõi được tiến hành giải
phẫu để xác định sự hiện diện của Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột
già.
Cách tiến hành: Sau khi chuột chết, dùng kim ghim bốn chân của chuột trên
mảnh cao su được đặt trên khay mổ. Dùng kéo cắt da theo đường thẳng dọc theo chiều
dài chuột và mở ra hai bên. Dùng kéo vô khuẩn để mở cơ hoành và lật ra hai bên để
quan sát nội tạng, gan, lách. Cắt lấy gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già cho một bao
PE vô trùng. Cho một thể tích xác định nước muối NaCl 0,85% tùy theo khối lượng
gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già thu được vào bao PE. Dùng vật nặng có bề mặt
nhẵn để nghiền nát các bộ phận đó. Toàn bộ dịch trong bao PE được cho vào bình tam
giác vô trùng có nắp đậy (mỗi bộ phận được cho vào những bình khác nhau), bình này
được lắc trên máy lắc khoảng 1 giờ.
Dịch đồng nhất sau khi lắc được đem trải đều trên môi trường XLD để định
lượng mật độ Salmonella trong gan, lách, dạ dày, ruột non và ruột già.




24


Hình 3.1. Dụng cụ mổ chuột

Hình 3.2. Các bộ phận dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già trong đĩa







a. b.

Hình 3.3. Khuẩn lạc Salmonella trên môi trƣờng XLD

a. Môi trƣờng trƣớc khi cấy; b. Khuẩn lạc đặc trƣng của Salmonella trên XLD

25
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KHẢ NĂNG GÂY BỆNH, GÂY CHẾT Ở CHUỘT DO CÁC CHỦNG
SALMONELLA
4.1.1. Khả năng gây bệnh và gây chết chuột do các chủng Salmonella có nguồn
gốc từ bệnh phẩm
Thí nghiệm được tiến hành trên 4 chủng Salmonella được phân lập từ các
nguồn bệnh phẩm nhận từ Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh. Các chủng Salmonella được
gây nhiễm vào chuột qua đường miệng sau khi được phục hồi trên môi trường BHI
trong 18 – 24 giờ ở 37
o

C, theo dõi diễn biến bệnh lý ở chuột gây nhiễm trong thời gian
14 ngày. Mỗi chủng được gây nhiễm trên 4 chuột, mỗi chuột gây nhiễm 0,3 ml canh
khuẩn, mật độ vi sinh vật trong canh khuẩn đã được xác định trước bằng phương pháp
đếm khuẩn lạc, thí nghiệm được lặp lại 2 lần. Kết quả thí nghiệm thu được sau 14 ngày
gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.1.

Bảng 4.1. Kết quả thí nghiệm khả năng gây bệnh, gây chết cho chuột ở các chủng
Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm

STT
Chủng
Mật độ gây nhiễm
(CFU/ml)
Biểu hiện
bệnh
Số lƣợng
chuột chết
Thời gian
gây chết
1
S.enteritidis 99.303
2,8 x 10
9

+
1/2
4 ngày
2,5 x 10
8

-
0/2
> 14 ngày
2
S.enteritidis 02.158
1,4 x 10
8

+
0/2
> 14 ngày
9,0 x 10
7

-
0/2
> 14 ngày
3
S. typhimurium
1,5 x 10
8

+
0/2
> 14 ngày
1,3 x 10
8

+

0/2
> 14 ngày
4
S. typhimurium 02.157
1,4 x 10
7

+
0/2
> 14 ngày
1,8 x 10
8

+

0/2
> 14 ngày

Ghi chú: (+): có biểu hiện bệnh, (-): không biểu hiện bệnh

26
Kết quả ở Bảng 4.1 cho thấy hầu hết các chủng Salmonella có nguồn gốc từ
bệnh phẩm đều có khả năng gây bệnh cho chuột. Nhưng chỉ có chủng S. enteritidis
99.303 có nguồn gốc từ bệnh phẩm người là chủng duy nhất có khả năng gây chết 1/2
chuột thí nghiệm sau 4 ngày gây nhiễm. Mật độ để Salmonella gây nhiễm vào chuột ở
chủng S. enteritidis 99.303 là rất cao, khoảng 2,8 x 10
9
CFU/ml. Các chủng bệnh phẩm
còn lại không có khả năng gây chết chuột nhưng hầu như đều làm cho chuột bệnh.

Biểu hiện bệnh của chuột là xù lông, biếng ăn, gầy và ít chuyển động.
Đối với chủng S. enteritidis 99.303 và chủng S. enteritidis 02.158 với mật độ
gây nhiễm tương ứng là 2,5 x 10
8
CFU/ml và 9,0 x 10
7
CFU/ml thì biểu hiện bệnh lý
của chuột không rõ ràng.
So sánh với các nghiên cứu khác về khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các
chủng Salmonella có nguồn gốc từ bệnh phẩm trên thì trong khảo sát này cho thấy mật
độ gây bệnh gây chết chuột cao hơn rất nhiều so với các khảo sát trước đó. Theo Lu và
cộng sự (1999), mật độ gây chết 50% chuột thí nghiệm của các chủng S. enteritidis và
S. typhimurium trung bình vào khoảng 10
4
– 10
5
tế bào, một số chủng có độc lực mạnh
có khả năng gây chết chuột với mật độ dưới 100 tế bào [3]. Theo Nguyễn Tiến Dũng
và cộng sự (2004), các chủng S. enteritidis 99.303 và S. enteritidis 02.158 đều có khả
năng gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm, với mật độ gây nhiễm tương ứng là 9,5 x
10
7
CFU/ml và 2,4 x 10
8
CFU/ml [5]. Trong khảo sát này, có sự khác biệt như vậy có
thể do các lý do sau: (1) Các chủng Salmonella bị giảm hay mất độc lực do quá trình
bảo quản và cấy chuyền nhiều lần, (2) Các chủng phân lập từ các nguồn khác nhau nên
có độc lực khác nhau…
4.1.2. Khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella có nguồn gốc
từ thực phẩm

Đối với các chủng Salmonella có nguồn gốc từ thực phẩm thì cũng được tiến
hành thí nghiệm tương tự như trong các chủng từ bệnh phẩm trên. Thí nghiệm được
tiến hành trên 10 chủng có nguồn gốc từ những mẫu thực phẩm khác nhau. Kết quả thí
nghiệm thu được sau 14 ngày gây nhiễm được thể hiện ở Bảng 4.2.




27
Bảng 4.2. Khả năng gây bệnh, gây chết chuột ở các chủng Salmonella có
nguồn gốc từ thực phẩm

Kết quả ở Bảng 4.2 cho thấy, trong số các chủng Salmonella có nguồn gốc từ
thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng gây bệnh cho chuột nhưng có biểu
hiện nhẹ, không có khả năng gây chết chuột, mật độ gây nhiễm khoảng 4,8 x 10
8
– 5,9
x 10
10
CFU/ml. Các chủng còn lại sau khi gây nhiễm vào chuột, qua theo dõi trong
suốt quá trình thí nghiệm cho thấy các chuột này đều không có biểu hiện bệnh hay
giảm cân. Trái lại, các chuột sau khi gây nhiễm này đều khỏe mạnh, nhanh nhẹn và
tăng trọng sau 14 ngày gây nhiễm.
4.1.3. So sánh khả năng gây bệnh gây chết ở chuột giữa các chủng Salmonella từ
bệnh phẩm và từ thực phẩm
Kết hợp kết quả được thể hiện trên Bảng 4.1 và Bảng 4.2 cho thấy có sự khác
biệt rõ ràng về khả năng gây bệnh gây chết chuột ở những chủng Salmonella có nguồn
gốc từ bệnh phẩm và từ thực phẩm. Các chủng Salmonella từ bệnh phẩm thì có độc lực
cao như có thể gây bệnh, gây chết chuột sau 14 ngày gây nhiễm. Những chuột không
chết trong khoảng thời gian này thì đều có biểu hiện bệnh như xù lông, giảm cân…

Ngược lại, các chủng Salmonella từ thực phẩm thì chỉ có 2/10 chủng là có khả năng
gây bệnh chuột nhưng với biểu hiện nhẹ, còn 8 chủng còn lại đều không có khả năng
STT
Chủng
Mật độ gây
nhiễm (CFU/ml)
Biểu hiện bệnh
Số lƣợng
chuột chết
Thời gian gây
chết
1
Salmonella SP 1b
1,1 x 10
8

-
0/2
/
2
Salmonella SP 2a
6,6 x 10
10

-
0/2
/
3
Salmonella SP 1a
4,8 x 10

9

-
0/2
/
4
Salmonella SB 10
5,9 x 10
10

+
0/2
> 14 ngày
5
Salmonella SB11
2,5 x 10
8

-
0/2
/
6
Salmonella Ô13
1,5 x 10
9

-
0/2
/
7

Salmonella B34
2,4 x 10
11

-
0/2
/
8
Salmonella M14
1,5 x 10
8

-
0/2
/
9
Salmonella VTr11
5,7 x 10
7

-
0/2
/
10
Salmonella H51
4,8 x 10
8

+

0/2
> 14 ngày