Luận văn : NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM part 1 pdf

1
Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Salmonella là một trong những nguyên nhân gây ra các bệnh ngộ độc thực
phẩm cho người trên diện rộng và luôn là mối đe dọa cho sức khỏe cộng đồng. Vi sinh
vật này phân bố rộng rãi trong đất, nước, gia súc, thực phẩm… trong đó thịt và các sản
phẩm gia cầm là các nguồn bệnh quan trọng. Các báo cáo của Ủy Ban Châu Âu năm
1995 xác định rằng các tác nhân gây ngộ độc thực phẩm, đặc biệt là Salmonella và
Campylobacter là vấn đề quan trọng cho sức khỏe cộng đồng. Vì tính chất rất nguy
hiểm của Salmonella, tất cả các tiêu chuẩn an toàn vệ sinh thực phẩm của các nước
trên thế giới đều xếp Salmonella vào nhóm không được phép có mặt.
Hiện nay, khoảng 2500 kiểu huyết thanh về Salmonella đã được xác định. Qua
các nghiên cứu cho thấy không phải tất cả các chủng mà chỉ có một số ít có khả năng
gây bệnh. Nếu có phương pháp phân biệt được các dòng Salmonella gây bệnh với các
dòng lành tính thì sẽ tạo thuận lợi hơn trong việc mua bán và trao đổi hàng hóa thực
phẩm giữa các nước. Đồng thời việc phân biệt các dòng trên còn giúp ích nhiều trong
việc điều tra và kiểm soát dịch bệnh do vi khuẩn này gây ra.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, Trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, dưới sự hướng dẫn của Th.S Nguyễn Tiến Dũng, TS.
Nguyễn Ngọc Hải, chúng tôi thực hiện đề tài: “NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GÂY
BỆNH CHO CHUỘT Ở CÁC CHỦNG SALMONELLA CÓ NGUỒN GỐC TỪ BỆNH
PHẨM, THỰC PHẨM”.
1.2. Mục đích
Nghiên cứu khả năng gây bệnh của các chủng Salmonella có nguồn gốc bệnh
phẩm và thực phẩm.
1.3. Nội dung
Khảo sát khả năng gây bệnh, gây chết ở chuột do các chủng Salmonella.
Khảo sát khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào gan và lách chuột.
Nghiên cứu khả năng xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan
thuộc hệ tiêu hóa chuột gồm: dạ dày, gan, lách, ruột non và ruột già.

Khảo sát khả năng tái xâm nhiễm của các chủng Salmonella vào các cơ quan
thuộc hệ tiêu hóa chuột.
2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ĐẠI CƢƠNG VỀ SALMONELLA
2.1.1. Đặc điểm sinh vật học
2.1.1.1. Đặc điểm hình thái và cấu tạo
Salmonella là một trong 32 giống của họ vi khuẩn đường ruột
Enterobacteriaceae do Salmon và Smit phân lập ra đầu tiên vào năm 1885 từ lợn mắc
bệnh dịch tả. Salmonella là vi khuẩn gram âm, dạng hình que, hai đầu tròn, có kích
thước khoảng 0,4 - 0,6 x 1,0 - 3,0 m, không hình thành giáp mô và nha bào [1, 6, 25,
31].

Hình 2.1. Vi khuẩn Salmonella [23]
Phần lớn vi khuẩn thuộc giống Salmonella có thể di động nhờ vào những tiên
mao, mỗi vi khuẩn có từ 7 đến 12 tiên mao chung quanh thân, trừ S. gallinarum và S.
pullorum không có lông nên không di động [6, 11, 35].
2.1.1.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella là vi khuẩn hiếu khí tùy nghi nhưng phát triển tốt trong điều kiện
hiếu khí, chúng có thể sống ở nhiệt độ từ 5 – 46
o
C và pH từ 3,7 - 9,5 nhưng phát triển
tốt nhất ở 37
o
C và pH từ 6,8 - 7,2. Salmonella dễ phát triển trên các môi trường dinh
dưỡng thông thường khi nuôi cấy trong khoảng 24 giờ, nhưng trên môi trường thạch
BSA (Bismuth Sulfite Agar) thì phải nuôi cấy trong 48 giờ [1, 3, 6, 11].
Trên môi trường canh sau khi nuôi cấy Salmonella từ 5 - 6 giờ thì làm đục nhẹ
môi trường, sau 18 giờ làm đục đều, nếu nuôi cấy lâu hơn 24 giờ thì môi trường có

lắng cặn.

3
Trên môi trường thạch thường vi khuẩn tạo khuẩn lạc dạng S (Smooth) tròn,
lồi, trơn láng, bờ đều, thường không màu hay màu trắng xám. Đôi khi tạo khuẩn lạc
dạng R (Rough), kích thước khuẩn lạc thường trong khoảng 2 – 4 mm.
Trên môi trường thạch Macconkey vi khuẩn Salmonella mọc thành những
khuẩn lạc tròn, đường kính 2 – 3 mm, trong suốt, không màu, sáng, nhẵn bóng và hơi
lồi ở giữa.
Trên môi trường thạch SS (Shigella – Salmonella Agar) Salmonella hình thành
những khuẩn lạc tròn, bóng không màu hay có màu hồng và có tâm đen ở giữa.
Trên môi trường thạch XLD (Xylose Lysine Desoxycholate Agar) Salmonella
cho khuẩn lạc trong suốt, không màu hay có màu hơi nhuốm đỏ đôi khi có tâm đen,
thường xuất hiện vùng đỏ hồng xung quanh khi khuẩn lạc Salmonella phát triển mạnh.
Trên môi trường thạch BPLS (Brilliant Green Phenol Red Lactose Agar)
Salmonella cho khuẩn lạc tròn, màu trắng hồng, môi trường xung quanh đỏ hồng.
Trên môi trường thạch BSA (Bismuth Sulphite Agar) Salmonella cho khuẩn lạc
có màu nâu xám hay màu đen, thường có ánh kim bao quanh [3, 6, 12, 25, 34].
2.1.1.3. Sức đề kháng
Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50
o
C trong 1 giờ, 70
o
C trong 15 phút, 100
o
C
trong 5 phút. Chúng có thể sống sót trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10
o
C trong 115
ngày, sống từ 4 - 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ 6 – 12

o
C.
Trong xác động vật chết, đất bùn, cát khô, trong nước đóng băng Salmonella
tồn tại khoảng 2 - 3 tháng, trong nước tự nhiên chúng có thể sống 1 - 2 tháng. Ánh
sáng mặt trời chiếu thẳng có thể diệt vi khuẩn trong nước trong sau 5 giờ, trong nước
đục sau 9 giờ. Salmonella bị diệt bởi clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3%
trong 15 - 20 phút [6, 11].
2.1.1.4. Đặc tính sinh hóa
Salmonella có những biểu hiện đặc tính sinh hóa chủ yếu như Bảng 2.1, dựa
vào các đặc điểm này mà người ta có thể định hướng phân biệt với các vi khuẩn đường
ruột khác [3, 6].




4
Bảng 2.1. Các biểu hiện sinh hóa của Salmonella
Phản ứng sinh hóa
Biểu hiện
Maltose
+
Glucose
+
Lactose
-
H
2
S
+/-
Gas

+
Lysine decarboxylase
+
Citrate
-
Ure
-
Nitrate
+
Indol
-
Voges Proskauer
-
Chú thích: (-) âm tính, (+)dương tính

2.1.1.5. Đặc điểm biến dị di truyền
Trong khi nuôi cấy Salmonella, đặc biệt là nuôi cấy lâu ngày trong môi trường
tổng hợp thì Salmonella có thể biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên. Các biến dị
thường gặp là: [11, 17]
Biến dị S - R: Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S trơn, bóng láng, bờ
đều, có kháng nguyên O đặc hiệu. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến
dị, khuẩn lạc có thể trở nên nhám, xù xì, gồ ghề, người ta gọi đó là dạng R, khi biến
thành dạng này thì kháng nguyên O không còn đặc hiệu nữa.
Biến dị O - H: Trong khi nuôi cấy dưới ảnh hưởng của một số hóa chất trong
môi trường như acid fenic… vi khuẩn có thể bị biến dị vì mất lông, do đó chúng sẽ
không di động được khi chỉ còn kháng nguyên O.
Biến dị của kháng nguyên H: Vi khuẩn có lông có thể biến dị từ phase 1 sang
phase 2, có nghĩa là biến dị từ phase đặc hiệu sang phase không đặc hiệu.
2.1.2. Đặc điểm phân loại
Dựa vào sự lai giữa DNA - DNA, Bergey’s (1994) đã chia giống Salmonella

thành 2 loài cơ bản là Salmonella enterica (hay còn gọi là S. cholerasuis) và S.
bongori [10, 25, 33].
5
S. bongori là một loài hiếm, trong khi đó S. enterica thì phân bố rộng khắp mọi
nơi trên thế giới và phổ vật chủ của chúng rất rộng.
Loài S. enterica được chia thành 6 loài phụ sau:
S. enterica enterica hay còn gọi là S. enterica I
S. enterica salamae hay còn gọi là S. enterica II
S. enterica arizonae hay còn gọi là S. enterica IIIa
S. enterica diarizonae hay còn gọi là S. enterica IIIb
S. enterica houtenae hay còn gọi là S. enterica IV
S. enterica indica hay còn gọi là S. enterica VI
Loài phụ S. enterica I chiếm khoảng 99% trong số các dòng phân lập được,
chúng được tìm thấy ở hầu hết các động vật máu nóng. Các loài phụ khác hầu như chỉ
phân lập được ở các động vật máu lạnh và trong môi trường.
Loài S. bongori hay còn gọi là Salmonella V
Các loài phụ của Salmonella được phân biệt dựa trên các đặc điểm sinh hóa ở
Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của các loài phụ thuộc Salmonella
Đặc điểm sinh hóa
Nhóm phụ
I
II
IIIa
IIIb
IV
V
VI
ONPG
1

Lactose
Dulcitol
Malonate
Gelatine
KCN
-
-
+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
+
+
-
-
-
-
+
(+)
2

-
+

+
-
-
-
-
-
+
+
+
-
+
-
-
+
D
3

+
D
3

-
+
-
1
O-Nitrophenyl- -D-Glucoside,
2
Không sử dụng nhưng nếu kéo dài thời gian nuôi cấy thì chúng
có thể sử dụng,
3

Một số kiểu huyết thanh trong nhóm có thể sử dụng.

2.1.3. Phân loại dựa theo cấu trúc kháng nguyên
Hiện nay, ngoài phương pháp căn cứ vào những đặc tính sinh hóa để phân loại
Salmonella, việc dựa vào cấu trúc kháng nguyên để xác định các kiểu huyết thanh
Salmonella cũng được sử dụng khá phổ biến. Mỗi dòng Salmonella được xác định chủ
yếu thông qua 3 loại kháng nguyên sau:
6









Hình 2.2. Vị trí các loại kháng nguyên trên Salmonella
Kháng nguyên O (kháng nguyên màng tế bào, somatic): nằm trên màng của vi
khuẩn và được phóng thích vào môi trường nuôi cấy. Kháng nguyên này đặc trưng bởi
cấu trúc lypopolysaccharide - protein. Loại kháng nguyên này được coi là nội độc tố
của vi khuẩn, có tác dụng ngăn cản bạch huyết cầu đi qua mao mạch và làm thay đổi
tạm thời sự thẩm thấu của mao quản. Kháng nguyên này bền đối với nhiệt, chúng
không bị phân hủy ở nhiệt độ 100
o
C trong 2 giờ. Chúng bị phân hủy trong môi trường
acid tạo ra 2 thành phần cơ bản: [3, 28]
Phần 1 là lipide, có cấu trúc tương tự như ở tất cả các loài vi khuẩn thuộc đường
ruột khác, phần này qui định khả năng gây độc của vi khuẩn và được gọi là nội độc tố.
Phần 2 là phần có nguồn gốc từ polysaccharide, gồm các nhóm hydro nằm

ngoài, được dùng để phân biệt các kiểu huyết thanh của Salmonella. Nhóm
polysaccharide ở bên trong có chức năng phân biệt các dạng khuẩn lạc.
Do có sự khác nhau giữa các loài Salmonella về phương diện cấu tạo kháng
nguyên O nên người ta đã chia Salmonella thành 34 nhóm có ký hiệu như sau: A, B,
C1, C2, C3, D1, D2, E1 … E4, F, G1, G2, X, Y, Z, 49, 50. Mỗi nhóm huyết thanh học
gồm một số loài vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định.
Ví dụ trong nhóm A, S. paratyphi A, kháng nguyên O gồm 3 thành phần (I), II, XII
trong đó thành phần I có thể có hoặc không, thành phần II là thành phần đặc biệt
không thể thiếu dùng để phân biệt về mặt huyết thanh học với các nhóm khác.
Kháng nguyên H (kháng nguyên lông, flagella): có bản chất là protein rất kém
bền vững so với kháng nguyên O, bị phá hủy ở 70
o
C hay dưới tác dụng của cồn, các
enzyme phá hủy protein, nhưng không bị ảnh hưởng bởi formol 0,5%. Kháng nguyên
Pili
7
H không có tác dụng gây bệnh, không tạo miễn dịch. Salmonella chứa 2 nhóm kháng
nguyên H, chúng được mã hóa bởi 2 gen khác nhau nhưng có liên quan mật thiết với
nhau, tại cùng thời điểm chỉ có 1 trong 2 gen được biểu hiện thành hai nhóm kháng
nguyên gọi là phase 1 và phase 2.
Phase 1, phase đặc hiệu, bao gồm 28 loại kháng nguyên lông biểu thị bằng chữ
La Tinh: a, b, c,…z.
Phase 2, phase không đặc hiệu, nhiều dòng Salmonella chứa cùng một loại
kháng nguyên, gồm 6 loại biểu thị bằng số Ả Rập 1, 2, 3… hay chữ La Tinh e, n, x…
Kháng thể kháng kháng nguyên H gây ngưng kết vi khuẩn bởi các lông roi. Sự
ngưng kết này sẽ tạo thành những mảng kết tụ, chúng có thể bị tách bởi các yếu tố có
khả năng cắt lông roi của vi khuẩn [3, 11, 28].
Kháng nguyên Vi (kháng nguyên vỏ, capsule): Bọc ngoài kháng nguyên O gọi
là kháng nguyên bề mặt có liên quan mật thiết với endotoxin. Kháng nguyên Vi của
Salmonella bị biến đổi ở nhiệt độ 100

o
C trong 15 phút hoặc tác dụng với cồn 90%,
nhưng chúng ổn định trong formol 0,5%. Kháng nguyên này thường được tìm thấy
trên 3 chủng: S. typhi, S. paratyphi C và S. dublin, chúng không tham gia vào việc gây
bệnh.
Ngày nay, người ta có khuynh hướng không đặt tên cho các chủng Salmonella
nữa mà các chủng này được biểu thị thông qua kháng nguyên O và H, một số có thêm
kháng nguyên Vi. Theo hệ thống phân loại của Kaufman - White thì hiện nay có hơn
2500 kiểu huyết thanh của Salmonella đã được xác định. Mỗi kiểu huyết thanh được
xác định theo một công thức gọi là công thức kiểu kháng nguyên. Đối với những kiểu
huyết thanh thuộc loài phụ I thì thường đặt theo tên, ví dụ S. enteritidis, S. typhi… Căn
cứ vào các kiểu cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu dựa vào kháng nguyên O thì S.
enterica I được chia thành 9 nhóm: A, B, C1, C2, D, E1, E4, F, G. Trong đó,
Salmonella nhóm E thường gây bệnh nhẹ với các triệu chứng như sốt, tiêu chảy, tỷ lệ
bệnh diễn biến và tử vong thấp. Salmonella nhóm B và C thì gây bệnh với tỷ lệ cao và
tỷ lệ chết tùy thuộc vào chủng và số lượng vi khuẩn xâm nhập vào. Thường thì bé sơ
sinh có tỷ lệ bệnh và tử vong cao hơn so với các lứa tuổi khác do mất nước và các chất
điện phân [3, 25, 29, 33, 35].

8
Bảng 2.3. Cấu trúc kháng nguyên của một vài Salmonella thƣờng gặp [Jay, 2000]
Nhóm
Loài/kiểu huyết
thanh
Kháng nguyên
O
Kháng nguyên H
Phase 1
Phase 2
A

B

C1



C2
D


E1
S. paratyphi A
S. schottmuelleri
S. typhimurium
S. hirschfeldii
S. choleraesuis
S. oranienburg
S. montevideo
S. newport
S. typhi
S. enteritidis
S. gallinarum
S. anatum
1, 2, 12
1, 4, (5), 12
1, 4, (5), 12
6, 7, (Vi)
6, 7
6, 7
6, 7

6, 8
9, 12, (Vi)
1, 9, 12
1, 9, 12
3, 10
a
b
i
c
(c)
m, t
g, m, s (p)
e, h
d
g, m
-
e, h
(1, 5)
1, 2
1, 2
1, 5
1, 5
-
(1, 2, 7)
1, 2
-
(1, 7)
-
1, 6
Ghi chú: - sự có mặt của yếu tố đó là do sự đảo ngược phage, ( ) có thể vắng mặt.

2.1.4. Phân loại theo mục đích miễn dịch học
Về dịch tễ học, Salmonella được chia thành 3 nhóm: [29, 32]
Nhóm chỉ nhiễm trên người: Gồm các kiểu huyết thanh S. typhi, S. paratyphi A,
S. paratyphi C. Chúng là tác nhân gây sốt thương hàn và phó thương hàn. Sốt thương
hàn có thời gian ủ bệnh dài, thân nhiệt tăng cao và thường tỷ lệ tử vong cao. S. typhi
được phân lập từ máu, thỉnh thoảng từ phân và nước tiểu bệnh nhân có vấn đề về
đường ruột. Triệu chứng của bệnh phó thương hàn thì nhẹ hơn thương hàn.
Nhóm gây bệnh trên thú: Gồm các kiểu huyết thanh S. gallinarum (gia cầm), S.
dublin (bò), S. abortus-equi (ngựa), S. abortus-ovis (cừu), S. choleraesuis (heo).
Nhóm không kí chủ đặc hiệu: gây bệnh trên người và thú, thường tìm thấy
trong thức ăn.
Để có biểu hiện bệnh thì mật độ vi khuẩn đưa vào cơ thể phải đạt khoảng 10
7
-
10
9
CFU/g.
9
2.1.5. Phân loại độc tố: Salmonella có 2 loại nội độc tố: [7, 27, 32, 33]
2.1.5.1. Độc tố LT (Heat- labile toxin)
Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1975 do Koupal và Deibel. Môi trường
được tìm thấy tốt nhất để sản xuất ra độc tố này là BHI (Brain Heart Infusion Broth) có
chứa 2% casamino acid. Những yếu tố dinh dưỡng như glycerol, biotin và Mn
2+
làm
tăng khả năng tạo ra độc tố này. Đồng thời, độc tố này tạo ra nhiều hơn ở phase ổn
định của quá trình tăng trưởng, thích hợp trong khoảng pH 6 - 7 hoặc cao hơn, nhiệt độ
37
0

C và đặc biệt phải thông khí.
Độc tố LT không bền với nhiệt ở 100
o
C, có trọng lượng phân tử khoảng 110
kDa, và điểm đẳng điện vào khoảng 4,3 - 4,8.
Cơ chế tác động: độc tố LT hoạt hóa men adenylcylase trong tế bào, làm gia
tăng c-AMP (cycle-adenosin-5-monophotphate). c-AMP kích thích tăng tiết
bicarbonate ra khỏi tế bào ruột đồng thời ức chế Na
+
vào bên trong tế bào ruột. Kết
quả cuối cùng là gây tiêu chảy, mất nước, gây xung huyết và mụn loét.
2.1.5.2. Độc tố ST (Heat- stable toxin)
Vào năm 1962, các nhà nghiên cứu của Châu Âu đã chỉ ra hoạt tính của độc tố
ST ly trích từ Salmonella. Độc tố này hoạt động trong khoảng pH 6 - 9, bị phá hủy khi
xử lý với trypsin và protease. Độc tố này bền với nhiệt, mất hoạt tính ở 121
o
C trong 15
phút, trọng lượng phân tử khoảng 32 kDa.
Cơ chế tác động tương tự như LT nhưng ST hoạt hóa men guanyl cyclase làm
tăng c-GMP (Guanyl-cyclase monophotphate) trong tế bào dẫn đến nước tập trung vào
ruột non sau 18 - 24 giờ và dẫn đến tiêu chảy.
2.1.6. Dịch tễ học
2.1.6.1. Tác nhân truyền bệnh
Salmonella hiện diện khắp nơi trong tự nhiên. Thực phẩm Salmonella thường
hiện điện trong các sản phẩm có nguồn gốc từ thịt gia súc, gia cầm. Ngoài ra,
Salmonella còn hiện diện trong trứng, sữa, sản phẩm thủy sản như trai ốc sống trong
nước bẩn… Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật ít khi là nguồn gây ngộ độc
Salmonella trừ những rau quả ăn sống như rau diếp, cà chua… nếu bón phân tươi hoặc
rửa bằng nước bẩn thì sẽ rất nguy hiểm. Kem, nước đá làm bằng nước bẩn cũng có thể