Luận văn : KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG KHÁNG MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT ĐƯỜNG RUỘT CỦA CÂY XUÂN HOA (Pseuderanthemum palatiferum) part 6 doc

34

3.4. Phƣơng pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc,
dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
3.4.1. Điều chế các loại cao
3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia
thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành
2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na
2
SO
4
, cô cạn dưới áp suất thấp thu được
cao ete dầu hỏa.
3.4.1.2 Điều chế cao CHCl
3
Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi
CHCl
3
vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm
khan với Na
2
SO
4
và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl
3
.
3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol
Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl
3

, được tiếp tục cho 1500 ml n-
butanol vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên trên, làm
khan với Na
2
SO
4
, cô cạn dung dịch dưới áp suất thấp thu được cao n-Butanol.
3.4.1.4. Điều chế cao nƣớc
Phần nước cái còn lại tiến hành cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao thô H
2
O.
















35

Sơ đồ 3.2: Sơ đồ điều chế các loại cao thô từ lá Xuân Hoa

Lá khô 500 g
- Xay nhỏ, đun Soxhlet 72h với EtOH 70 %; 4lít, lọc


Bã
Dịch trích EtOH
- Cô dưới áp suất thấp còn 1 lít, thêm 1 lit nước cất
- Tận trích với ete dầu hỏa 1,5 lít.

Pha nước
Dịch trích CHCl
3
Cao ete dầu hỏa

Pha nước

Dịch trích
Ete dầu hỏa


Cao CHCl
3

Dịch trích
n - Butanol
Cao n - Butanol

Pha nước
Cao nước

Tận trích với
CHCl
3
; 2 lít


- Làm khan với Na
2
SO
4
, Lọc
- Cô cạn dưới áp suất thấp
- Lọ c
- Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

- Làm khan với Na

2
SO
4
- Lọc
- Cô cạn dưới áp suất
thấ p
- Lọ c
- Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

Tận trích với n-Butanol - Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

-Làm khan với Na
2
SO
4
, lọc
- Cô cạn dưới áp suất thấp
- Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

Cô cạn dưới áp suất thấp - Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

36

3.4.2. Cô lập một số hợp chất trong cao ete dầu hỏa
Thực hiện sắc ký cột trên cao ete dầu hỏa, chất hấp phụ silicagel, dung môi giải
ly là ete dầu hỏa, EtOAc và hỗn hợp của chúng với độ phân cực tăng dần.
Theo dõi quá trình sắc ký cột bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi giải ly là
CHCl
3
: E 9 : 1, thuốc thử hiện vết là dung dịch H

2
SO
4
10 %/EtOH.
Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký
cột tiếp theo các phân đoạn giống nhau, kết tinh thu được hợp chất sạch.
3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập đƣợc
Sử dụng phương pháp phổ nghiệm IR, MS,
1
H-NMR,
13
C-NMR…để xác định
cấu trúc.
3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
[12],[23],[24],[25]26],[28]

Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp để xác định nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa
đã cô lập được có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường
ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella
typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ công ty Nam
Khoa.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là môi trường
BHI.
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao
chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước.
Dung môi sử dụng để hòa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO)
3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng
Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để môi

trường tan đều. Cho vào 2 bình tam giác, làm nút bông đậy lại. Sau đó tiến hành hấp
vô trùng môi trường ở điều kiện 121
0
C trong vòng 20 phút bằng Autoclave.
3.5.2. Pha loãng cao Xuân Hoa
Pha loãng cao chloroform
Cân 0,04 g cao chloroform bằng cân điện tử cho vào 1 ống nghiệm chứa 2ml
dung môi DMSO. Đun nhẹ ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn để cao hòa tan hoàn
37

toàn vào dung môi. Lúc này nồng độ của cao chloroform trong ống nghiệm là
0,02 g/ml.
Tiến hành pha loãng dung dịch cao với môi trường dinh dưỡng theo tỉ lệ 1 ml
dung dịch cao : 9 ml môi trường dinh dưỡng lỏng BHI. Lúc này ta thu được dung dịch
cao hòa tan trong môi trường dinh dưỡng với nồng độ 0,002 g/ml (2000 μg/ml)
Lấy 12 ống nghiệm, chia làm 2 nhóm, đánh số thứ tự từ 1C đến 6C mỗi nhóm.
Cho vào các ống nghiệm dung dịch cao chloroform đã pha loãng trên lần lượt:
- Ống nghiệm 1C, 100 μl mỗi ống.
- Ống nghiệm 2C, 200 μl mỗi ống.
- Ống nghiệm 3C, 300 μl mỗi ống.
- Ống nghiệm 4C, 400 μl mỗi ống.
- Ống nghiệm 5C, 500 μl mỗi ống.
- Ống nghiệm 6C, 600 μl mỗi ống.
Dùng pipette hút hút môi trường dinh dưỡng BHI đã chuẩn bị ở trên cho vào 6
ống nghiệm ở trên theo thứ tự:
- Ống số 6C 400 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 1200 μg/ml.
- Ống số 5C 500 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 1000 μg/ml.
- Ống số 4C 600 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm

lúc này là 800 μg/ml.
- Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 600 μg/ml.
- Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 400 μg/ml.
-Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 200 μg/ml.
Pha loãng các loại cao còn lại
Tiến hành tương tự như qui trình pha loãng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B
đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao
nước.

38

3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục
Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối
BaSO
4
.2H
2
O.
a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M)
BaCl
2
.2H
2
O 11,75 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml
b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N)
H

2
SO
4
1%
c. Dung dịch chuẩn độ đục:
Dung dịch A 0,5 ml
Dung dịch B 99,5 ml
Chia vào các tube nút vặn có cùng kích cỡ với tube nuôi cấy hay pha cấy mầm
mỗi ống 4 – 6 ml, vặn chặt nút. Giữ trong tối ở nhiệt độ phòng.
Trước khi dùng lắc mạnh tube chứa độ đục chuẩn trên máy rung. Hằng tháng
phải thay các tube độ đục chuẩn.
3.5.4. Chuẩn bị mầm cấy
Tiêu chuẩn cần đạt được là 5x10
5
CFU/ml.
Hai chủng vi sinh vật: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium được cấy
sang ống nghiệm chứa môi trường thạch TSA, ủ ở 37
0
C qua đêm.
Sau khi vi khuẩn mọc đều trên mặt thạch, tiến hành cấy chuyền vào môi trường
lỏng đã chuẩn bị ở trên. Ủ ở 37
0
C trong vòng 16-24 giờ.
Điều chỉnh độ đục của canh vi khuẩn cấy ngang với độ đục của ống chuẩn Mc
Farland 0.5 (tương đương 10
8
CFU/ml) bằng nước muối sinh lí 0,85 %.


Hình 3.1: chuẩn độ đục vi khuẩn

BHI
Đ/C
Huyền dịch
Salmonella
Dung dịch
Mc Farland 0,5
Huyền dịch
E. coli
39

Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml môi trường lỏng BHI. Trộn đều
vi khuẩn vào môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp
canh vi khuẩn và môi trường BHI.
Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha loãng ở trên cho vào 3
ống nghiệm chứa 9 ml môi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào
môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn
và môi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là
10
6
CFU/ml.
Tiến hành pha loãng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC
25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha loãng ta thu được 3 ống nghiệm chứa
30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 10
6
CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch
vi khuẩn Salmonella 10
6
CFU/ml.
3.5.5. Thử nghiệm
Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung môi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống

0,06 ml dung môi DMSO và 0,94 ml môi trường BHI. Sau đó cho vào ống thứ nhất 1
ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, cho vào ống thứ hai 1ml huyền dịch vi khuẩn
Salmonella.
Dùng 2 ống nghiệm để làm đối chứng, mỗi ống chứa 1ml môi trường BHI. Cho
vào ống thứ nhất 1ml huyền dịch vi khuẩn E. coli, ống thứ hai 1ml huyền dịch vi
khuẩn Salmonella.
Chia các ống nghiệm đã pha loãng các loại cao trên thành 2 nhóm giống nhau,
mỗi nhóm dùng để thử nghiệm một chủng vi khuẩn.
Cho vào các ống nghiệm của nhóm thứ nhất, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn E. coli
đã pha loãng 10
6
CFU/ml.
Cho vào các ống nghiệm của nhóm thứ hai, mỗi ống 1 ml huyền dịch vi khuẩn
Salmonella đã pha loãng 10
6
CFU/ml.
Như vậy trong mỗi ống nghiệm mật độ vi khuẩn là 5 x 10
5
CFU/ml. Nồng độ của
các loại cao trong ống nghiệm lần lượt là 600 μg/ml, 500 μg/ml, 400 μg/ml, 300 μg/ml,
200 μg/ml, 100 μg/ml đối với mỗi nhóm



40




Cao nước Cao ete dầu hỏa

Cao n-butanol Cao CHCl
3


Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào
Sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào, ủ các ống nghiệm của hai nhóm, 2 ống
nghiệm đối chứng và 2 ống nghiệm thử dung môi ở nhiệt độ 37
0
C . Sau 16-20 giờ tiến
hành đọc kết quả.
Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường, sự tạo thành cặn ở đáy của ống
nghiệm và sự tạo thành váng ở bề mặt môi trường.
Sau khi ủ, xác định hai nồng độ kế cận nhau mà vi khuẩn làm đục và không làm
đục môi trường. Chia nhỏ hai nồng độ trên thành nhiều khoảng nồng độ và tiến hành
thử nghiệm như trên.
Sau quá trình thử nghiệm ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của các loại
cao đối với vi khuẩn thử nghiệm.





41

Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nguyên liệu

Nguyên liệu sau khi thu hái rửa sạch, để khô, sấy ở 50
0
C đến trọng lượng không
đổi, sau đó xay thành bột.
4.1.1. Xác định độ ẩm
Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu, cho vào chén
sứ, sấy ở 105
0
C trong 2 giờ, lấy ra để vào bình hút ẩm khoảng 15 phút, sau đó cân thu
được 1,1 g. Như vậy độ ẩm của mẫu là:
Độ ẩm mẫu = (10 - 1,1 ) x 100 % = 89 %
4.1.2. Xác định tro toàn phần
Nung chén sứ đến khối lượng không đổi. Cân chính xác 10 g mẫu trải đều thành
một lớp mỏng. Đặt vào lò nung ở nhiệt độ 600
0
C trong 3 giờ, lấy ra để vào bình hút
ẩm khoảng 30 phút, cân khối lượng tro còn lại được 1,2 g. Như vậy hàm lượng tro của
mẫu là:
Hàm lượng tro = 1,2/10 x 100 % = 12%
4.2. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật
Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật của lá cây Xuân Hoa được thu
nhận ở bảng 4.1.

42

Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa:

Tên hợp chất
Thuốc thử
Kết quả
Loại dung dịch

Ete
Cồn
Nước
Antraglycosid
KOH 10%
Dung dịch màu đỏ
-
+
-
Flavonoid
HCl

đđ
+Mg kim loại
Màu đỏ
-
+
-
Acd béo
Nhỏ dd lên giấy lọc
Để vết mờ
+


Alkaloid
Mayer
Tủa
-
+
-
Dragendorf
Tủa
-
+
-
Bouchardat
Tủa
-
+
-
Carotenoid
H

2
SO
4
Màu xanh nhạt
+


Phytosterol
Anhydric
acetic+H
2
SO
4
Chỗ tiếp xúc có
màu nhạt
++



Tinh dầu
Bốc hơi tới cắn
Mùi thơm nhẹ
+


Coumarin
Soi UV
Phát huỳnh quang
+

Polyphenol
FeCl
3
2%
Màu xanh đen

++
+
Acid hữu cơ
Na
2
CO
3
Sủi bọt
+


Đường khử
Thuốc thử Fehling
Đỏ gạch

++
+
Antracyanosid
HCl, NaOH
Không màu

+

Saponin
Lắc mạnh
Tạo bọt

Bền
Bền
Liebermann
Có vòng tím nâu
chuyển sang đỏ

++
+
Hợp chất
uronic
Pha loãng EtOH
90%
Tủa bông nhiều


++

Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: không có
Nhận xét:
- Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ
trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu,
coumarin, acid hữu cơ.
- Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid,
alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin.
- Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử,
saponin và hợp chất uronic.