Luận văn : BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT BỘT CACAO BẰNG PHƯƠNG PHÁP LÊN MEN CÓ BỔ SUNG VI SINH VẬT part 5 ppsx

31
H
3
BO
3
HClO
3
Lactose
Na
2
HPO
4
CaCl
2
CuSO
4
Na
2
CO
3

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm

3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên
men
Nuôi cấy hai giống Asp. niger nghiên cứu trên hai môi trường có cùng điều kiện.
Giống Asp. niger được cấy truyền trên môi trường thạch malt. Sau đó hai giống Asp.
niger nghiên cứu được nhân giống trên môi trường bán rắn có thành phần 75 % cám

gạo, 15 % trấu, 9 % bột cà rốt và 1 % (NH
4
)SO
4
, độ ẩm 64 % trong 40 giờ. Sau khi kết
thúc quá trình nhân giống chúng tôi tiến hành xác định họat tính của 2 loại enzyme:
cellulase, pectinase.
3.5.1.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ: giống Asp. niger/bột mì rang
của chế phẩm lên men đến độ hòa tan và cường độ màu
Kết quả tuyển chọn giống vi sinh vật ở trên được áp dụng cho thí nghiệm này.
Giống Asp. niger đã tuyển chọn sau khi thu từ môi trường nhân giống được trộn với
bột mì rang. Tỷ lệ giống Asp. niger so với bột mì rang sử dụng trong thí nghiệm là 1:1,
1:2, 1:3 và 1:4. Độ ẩm của chế phẩm là 55 %, giữ chế phẩm ở 34.5
o
C trong 5 ngày.
Độ ẩm khối lên men là 55 %. Cố định lượng chế phẩm dùng lên men là 3 % khối
lượng khối hạt ca cao lên men.
3.5.1.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của lượng chế phẩm enzyme sử dụng để
lên men đến độ hòa tan và cường độ màu
Kết quả khảo sát thu được từ hai thí nghiệm trên tiếp tục được sử dụng trong thí
nghiệm này. Cố định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm tối ưu, giữ độ ẩm chế phẩm ở

32
55 %. Độ ẩm khối lên men được giữ ở 55 % trong suốt quá trình lên men. Thay đổi
lượng chế phẩm lên men như sau: 0.5 %, 1 %, 3 %, 5 % so với khối lượng hạt ca cao
đem lên men. Thời gian lên men là 5 ngày.
3.5.1.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của độ ẩm của khối lên men đến độ hòa
tan và cường độ màu
Áp dụng những kết quả tối ưu thu được từ các thí nghiệm trước đó chúng tôi cố
định giống vi sinh vật, tỷ lệ chế phẩm, lượng chế phẩm sử dụng. Chúng tôi bố trí các

mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên
men là 5 ngày.
3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và
cường độ màu
Sử dụng các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cố định các yếu tố sau: giống vi
sinh vật, tỷ lệ chế phẩm lên men, lượng chế phẩm lên men sử dụng và độ ẩm của chế
phẩm. Bố trí thí nghiệm lên men các mẫu cacao kết thúc ở các thời điểm: 3 ngày, 4
ngày, 5 ngày, 6 ngày và 7 ngày.
3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương
pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên
men có bổ sung vi sinh vật
Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong việc lên men
Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ hộ nông dân Nguyễn
Văn Lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre.
Tiến hành qui trình sản xuất bột ca cao trong cùng điều kiện cho cả hai mẫu hạt
ca cao nói trên

3.5.2 Phương pháp vi sinh vật

3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống
Môi trường PGA pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121
o
C trong
15 phút, lấy ra và để nghiêng 45
o
cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử dụng que cấy
móc đã thanh trùng cấy truyền sang môi trường PGA. Giống sau khi cấy được nuôi ở
nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 3 ngày sau đó được bảo quản ở 4
o
C. Sau 2 tháng

phải cấy truyền sang môi trường giữ giống mới.

33
3.5.2.2 Phương pháp nhân giống
Cho 10 ml nước cất đã thanh trùng vào ống nghiệm chứa nấm mốc đã cấy
chuyền ở trên, dùng que cấy đã thanh trùng cào nhẹ trên mặt thạch để bào tử hòa vào
trong nước càng nhiều càng tốt. Sau đó đổ dung dịch đó môi trường bán rắn đã chuẩn
bị ở trên, trộn đều, nuôi ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày để sử dụng tiếp.

3.5.3 Phương pháp hóa lý

3.5.3.1 Xác định độ ẩm
Sấy khô đĩa petri đến khối lượng không đổi rồi đem cân xác định trọng lượng đĩa
(m
1
). Cân một lượng chính xác 10 g mẫu cần phân tích đựng trên đĩa petri. Đem sấy
khô mẫu ở 100-105
o
C đến trọng lượng không đổi (m
2
). Thời gian sấy khô có thể lên
đến 3 - 4 giờ. Trong quá trình sấy có thể dùng đũa thủy tinh đảo trộn để nước bốc hơi
hết. Sau khi sấy xong đem ra để nguội trong bình hút ẩm trong 30 phút, sau đó đem
cân. Trọng lượng được coi là không đổi khi chênh lệch giữa 2 lần cần kế tiếp không
quá 0.03g.
Độ ẩm được tính theo công thức:
W(%) = (10 – (m
2
– m
1

)) x 100/10
Trong đó:
W: độ ẩm của mẫu (%)
10: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m
1
: khối lượng đĩa petri (g)
m
2
: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g)
m
2
– m
1
: khối lượng mẫu sau khi sấy
3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung
dịch ca cao
Độ hòa tan trong luận văn này được định nghĩa là lượng chất tan (tính bằng g) có
trong 10 g bột ca cao, chỉ tiêu này được xác định bằng khúc xạ kế
Cân 10 g bột ca cao cho vào một becher, bổ sung 30 ml nước sôi, lọc lấy dịch giữ
lại cặn, thêm 20 ml nước sôi vào cặn trên, lọc lấy dịch. Dung dịch này được đem đi
xác định độ hòa tan bằng cách dùng khúc xạ kế.

34
Cũng dung dịch trên được đem đi xác định cường độ màu bằng máy đo độ hấp
thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp
3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu
mạnh nhất
Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành
6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp

thụ ánh sáng bằng máy đo quang phổ ở các bước sóng khác nhau. Bước sóng mà cho
giá trị hấp thụ cao nhất được xác định là bước sóng để đo độ hấp thụ của dung dịch ca
cao.

3.5.4 Phương pháp hóa sinh


3.5.4.1 Các phương pháp xác định các thành phần chủ yếu của hạt
cacao
i. Phương pháp xác định độ tro của hạt cacao
Cân chính xác khoảng 2 – 5 g hạt cacao trong một chén sứ đã biết trọng lượng
khô tuyệt đối, cho thêm vào chén sứ 5 giọt HNO
3
đậm đặc và 1 – 2 giọt H
2
O
2
30%,
cho vào lò nung ở 500 – 550
o
C cho đến khi nguyên liệu biến thành tro trắng như tàn
thuốc lá. Lấy chén sứ ra và cho ngay vào bình hút ẩm, để nguội và cân chính xác.
Tổng lượng tro được tính như sau:
Tổng lượng tro (%) = Trọng lượng tro x 100/ trọng lượng mẫu khô
ii. Tổng hữu cơ
Cấu trúc hữu cơ của sinh vật dễ bị phá huỷ bởi các tác nhân kiềm hay acid
mạnh có tính oxy hoá ở nhiệt độ cao. Các chất hữu cơ bị oxy hoá hoàn toàn chuyển
thành CO
2
và nước bay ra khỏi chén sứ. Vì thế cách tính tổng hữu cơ như sau:

iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao
Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%)
N tổng số = N protein + N phi protein
Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng
nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH
4
)SO
4
Vô cơ hóa
Nguyên tắc

35
Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu
cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH
4
)SO
4
bằng cách đun
sôi với H
2
SO
4
đậm đặc và chất xúc tác
Thực hành :
Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có
dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H
2
SO
4

đậm đặc và
khoảng 0.5 g chất xúc tác. Đun sôi hỗn hợp trong tủ hút khí độc từ 2 đến 3 giờ cho đến
khi dung dịch trở thành trong suốt và có màu xanh da trời nhạt. Để nguội và pha loãng
thành 100 ml với nước cất.
Chất xúc tác là hỗn hợp K
2
SO
4
và CuSO
4
tỷ lệ 9 : 1
Phương pháp Kieldahl
Nguyên tắc : Chất đạm đã được vô cơ hóa nằm dưới dạng amonium sulfate đem
cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH Æ 2NH
4
OH + Na
2
SO
4
Sau đó lượng amoniac được hơi nước lôi cuốn bằng dụng cụ máy Parnas-
Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H
2
SO

4
. Từ đây
cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được
lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu.
Tiến hành
Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml
H
2
SO
4
N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng
chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner,
thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi
cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun
thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào
bình tam giác đựng H
2
SO
4
N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H
2
SO
4
thừa bằng
dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu.
Tính toán
Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức
12
( ).1,42. .100
(%)

VV f
Nmg
w
−
=


36
Trong đó
V
1
: số ml H
2
SO
4
. 0,1N cho vào bình hứng
V
2
: số ml NaOH dùng để chuẩn độ acid dư trong bình hứng
f: hệ số điều chỉnh nồng độ H
2
SO
4
ở bình hứng, f=1 khi nồng độ H
2
SO
4
chính
xác 0,1 N
w: khối lượng mẫu dùng để vô cơ hóa mẫu ứng với thể tích dung dịch lấy mẫu để

định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H
2
SO
4
1,42: số mg nitơ
iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan
Nguyên tắc
Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và
nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H
2
SO
4
. Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc
thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol
Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc:
¾ Độ sạch dụng cụ
¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H
2
SO
4

¾ Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun
Tiến hành
Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg
đường
Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào.
Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần
Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro
Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi
trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa

bã lên lọc và rửa sạch 2 - 3 lần bằng rượu nóng 80
o
Rượu qua lọc được cho bay hơi ở trong nồi cách thủy
Cặn khô trong cốc được pha loãng thành 50 ml với nước cất
Thực hiện phản ứng màu
Hút 1 ml dung dịch đường cho vào ống nghiệm rồi đổ thêm 1 ml dung dịch
phenol 5 %. Sau đó cho chính xác vào ống nghiệm 5 ml H
2
SO
4
đậm đặc.

37
Để 10 phút rồi lắc và giữ trên nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30
o
C để xuất
hiện màu. Xác định cường độ màu trong quang phổ kế ở bước sóng 490 nm
Xây dựng đồ thị mẫu
Lấy 7 bình định mức 100 ml rồi cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung
dịch saccharose 0.1% mẫu trên, cho nước cất vào đến vạch định mức. Từ mỗi bình lấy
ra 1 ml cho vào ống nghiệm rồi nhuộm bằng phenol và H
2
SO
4
như đã nói ở trên.
Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương đương 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 μg saccharose.
So màu rồi vẽ đồ thị mẫu. Mẫu thử không với 1ml nước cất thế dung dịch đường
v. Phương pháp định lượng cellulose
Nguyên tắc
Phương pháp định lượng cellulose dựa vào tính chất bền đối với tác dụng của

acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất
khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với
tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý
nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic
Tiến hành
Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105
o
C), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml
Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid
acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội,
pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng
Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml)
Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml
Rửa bằng ete ethylic
Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105
o
C đến trọng lượng không
đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường
còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó
cellulose xác định gọi là cellulose thô
Tính kết quả
Hàm lượng cellulose tính bằng công thức sau

38
.100a
X
w
=

Trong đó

X: hàm lượng cellulose tính bằng %
a: trọng lượng cellulose (g)
w: trọng lượng mẫu thí nghiệm (g)
100: hệ số chuyển thành %
vi. Phương pháp định lượng pectin
Nguyên tắc
Phương pháp dựa trên cơ sở thu nhận muối canxi pectat ở dạng kết tủa
Tiến hành
Cân 0.15 g mẫu hạt cacao có chứa pectin vào becher 100 ml
Cho thêm 100 ml NaOH 0,1 N
Để hỗn hợp trong 7 giờ hoặc qua đêm để xà phòng hóa hoàn toàn pectin thành
acid pectic
Thêm 50 ml dung dịch CH
3
COOH
Sau 5 phút thêm 50 ml dung dịch CH
3
COOH
Đun sôi 5 phút và lọc qua giấy lọc không tro đã được sấy khô tới trọng lượng
không đổi
Rửa kết tủa canxi pectat bằng nước cất nóng cho tới khi không còn ion clo nữa
(thử nước rửa với dung dịch bạc nitrat 1 % không có kết tủa trắng)
Sau khi rửa xong cho giấy lọc có kết tủa vào chén cân và sấy ở 105
o
C cho đến
khi trọng lượng không đổi
Tính kết quả
Hàm lượng của canxi pectat bằng hiệu của trọng lượng giấy lọc có kết tủa và
giấy lọc không
Hàm lượng pectin (P) tính theo công thức sau:

.0,92.100w
P
B
=

Trong đó
w: trọng lượng kết tủa canxi pectat (g)

39
B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g)
0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm
92 % trọng lượng canxi pectat)
100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %.
3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger
i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger
Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy
tinh trong môi trường lạnh 4
o
C để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước
muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh
dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày.
ii. Xác định hoạt tính CMCase
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose)
bằng enzyme ở pH 5.0 và 40
o
C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường
khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy
đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Cách thực hiện

Phản ứng enzyme
Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40
o
C trong 5
phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.
Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều
Để phản ứng xảy ra trong khoảng chính xác 40
o
C trong 10 phút
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều thật kỹ để ngừng phản ứng
enzyme.
Để tránh bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống nghiệm
và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút.
Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa
nước lạnh
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (A
T
)
Phản ứng thử không
Hút 1 ml dung dịch mẫu vào ống nghiệm và để ổn định nhiệt ở 40
o
C trong 5
phút. Cũng để dung dịch cơ chất ổn định ở nhiệt độ này trong 5 phút.

40
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS, lắc đều.
Thêm 1 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm đựng dung dịch mẫu và lắc đều
Để tránh sự bốc hơi, dùng một miếng nilon hay parafilm dán lấy miệng ống
nghiệm và đặt ống nghiệm vào nước sôi trong 15 phút.
Đưa ống nghiệm về nhiệt độ phòng bằng cách đặt ống nghiệm vào một nồi chứa

nước lạnh.
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (A
B
)
Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm
Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm
Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều
Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút.
Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (A
G
)
Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng
nước cất. Đo OD 540 nm (A
W
)
Tính toán
Tính hệ số glucose
Hệ số glucose được tính bằng công thức
(/
G
GW
Cmgml
F
AA
=
−
)

Trong đó
F: hệ số glucose
C
G
: nồng độ của dung dịch glucose chuẩn (mg/ml)
A
G
: độ hấp thụ OD của dung dịch glucose chuẩn
A
W
: độ hấp thu OD của phản ứng với nước cất
Xác định hoạt tính enzyme
Sử dụng công thức sau:
1000 1 1 1
(/) ( ) . . .
180 10 1
TB
CMCase u g A A F
p
hut ml C
=−