Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN part 1 doc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***00***





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP Ở LỢN








Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005

Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC




Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 - 2005




BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***00***










ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT - PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN
VÀ HÔ HẤP Ở LỢN

Giáo viên hƣớng dẫn:
TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
PGS.TS TRẦN THỊ DÂN



Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9 - 2005
Sinh viên thực hiện:
NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC




LỜI CẢM TẠ


Chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Các Thầy Cô và anh chị tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trường Đại Học
Nông Lâm TP.Hồ Chí Minh đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi

trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp.
Cô Bích Liên, Thầy Ngọc, chị Trang và các Thầy Cô khoa Chăn Nuôi Thú Y đã
tận tình giúp đỡ và chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực tập tốt nghiệp
Các bạn lớp Công Nghệ Sinh học 27 đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá
trình học tập.
Đặc biệt xin chân thành cảm ơn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS.TS Trần Thị Dân đã tận tình dạy bảo, hướng
dẫn, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Con xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến bố mẹ, những người đã sinh thành, nuôi
dưỡng, dạy dỗ và luôn bên con trong mọi thời điểm.

Thủ Đức, ngày 25 tháng 08 năm 2005
Nguyễn Nhất Bảo Quốc







i




TÓM TẮT

NGUYỄN NHẤT BẢO QUỐC, Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Đề tài:
“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT RT-PCR ĐỂ PHÁT HIỆN VIRUS GÂY HỘI CHỨNG
RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN”. Đề tài được thực hiện từ ngày

10/03/2005 đến ngày 15/08/2005 tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh
Trường Đại Học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
Hội đồng hướng dẫn:
TS. Nguyễn Ngọc Hải
PGS.TS. Trần Thị Dân
Mục tiêu của đề tài là thăm dò khả năng sử dụng quy trình RT-PCR để phát
hiện virus gây bệnh PRRS trên lợn. Nội dung nghiên cứu bao gồm:
- Xây dựng quy trình RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn của virus gây bệnh PRRS
đồng thời kiểm tra khả năng của ba loại Taq dự kiến sử dụng (Taq Beat Hot Start của
công ty Promega, Taq polymerase của công ty Biorad, Taq polymersa của công ty
ABgene).
- Ly trích RNA trên các mẫu phổi bằng quy trình dùng TRIzol và điện di RNA
tổng số nhằm kiểm tra khả năng sử dụng quy trình này trong việc ly trích RNA của
virus.
- Ly trích RNA từ các mẫu huyết thanh và dịch nuôi cấy tế bào từ những lợn
nghi ngờ bị nhiễm bệnh PRRS dựa vào kết quả ELISA. Sau đó thực hiện phản ứng
RT-PCR để kiểm tra sự hiện diện RNA của virus gây bệnh PRRS trong các mẫu này.
Kết quả, đã thành công trong việc xây dựng quy trình phát hiện RNA chuẩn của
virus gây bệnh PRRS và đã áp dụng thành công trong việc sử dụng TRIzol để ly trích
RNA. Tiến hành RT-PCR với sản phẩm ly trích RNA từ các mẫu thu nhận bằng cả hai
quy trình sử dụng bộ kit và sử dụng TRIzol, kết quả thu nhận là tất cả các mẫu xét
nghiệm đều không có sự hiện diện của virus tại thời điểm xét nghiệm.




ii

MỤC LỤC

Tên mục Trang
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC v
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT viii
DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix
Phần I: MỞ ĐẦU 1
1.1 Đặt vấn đề 1
1.2 Mục đích và yêu cầu 2
PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn 3
2.1.1 Giới thiệu 3
2.1.2 Lịch sử bệnh 3
2.1.3 Dịch tễ học 4
2.1.4 Các con đường lây nhiễm 5
2.1.4.1 Sự lây truyền dọc 5
2.1.4.2 Sự lây truyền ngang 6
2.1.5 Triệu chứng lâm sàng 7
2.1.6 Bệnh tích 8
2.2 Các phương pháp dùng trong chẩn đóan bệnh do virus PRRS gây ra 8
2.2.1. Phân lập virus sống 8
2.2.2. Phân lập virus hoặc kháng nguyên virus 9
2.2.3. Phương pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh 10
2.2.4. Phương pháp RT- PCR để phát hiện virus gây bệnh PRRS 12
2.3. Phương pháp PCR 13
2.3.1. Nguyên tắc 13
2.3.2. Các thành phần tham gia phản ứng PCR 13

2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR 14
2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR 15
iii




2.4 Phương pháp RT-PCR 16
2.4.1. Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR 16
2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngược 16
2.4.3. Các primer trong phiên mã ngược 18
PHẦN III: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP 20
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 20
3.2. Nội dung nghiên cứu 20
3.3. Vật liệu và hóa chất 20
3.3.1. Mẫu xét nghiệm 20
3.3.2. Cặp primer trong phản ứng RT-PCR 20
3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA 21
3.3.4. Vật liệu và hóa chất cho điện di RNA 21
3.3.5. Vật liệu và hóa chất cho RT-PCR 21
3.3.6. Vật liệu và hóa chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 22
3.4. Thiết bị và dụng cụ 22
3.5. Các phương pháp 22
3.5.1. Bảo quản dịch nuôi cấy tế bào 22
3.5.2. Chẩn bị và bảo quản mẫu huyết thanh 23
3.5.3. Tách chiết RNA từ dịch nuôi cấy tế bào và huyết thanh theo quy trình
sử dụng TRIzol 23
3.5.4. Phương pháp điện di RNA trên gel biến tính 24
3.5.5. Phương pháp RT-PCR trên RNA virus 25
3.5.6. Điện di sản phẩm RT-PCR 27

PHẦN IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28
4.1. Kết quả RT-PCR trên mẫu chuẩn của PRRSV 28
4.1.1. RT-PCR với Taq beat hot start (Promega) 28
4.1.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene 29
4.2. Kết quả RT-PCR trên mẫu RNA ly trích 30
4.2.1. RT-PCR với Taq beat hot start trên RNA ly trích từ huyết thanh bằng
phương pháp sử dụng TRIzol 30
4.2.2. RT-PCR với Taq polymerase của Biorad và ABgene trên các mẫu ly trích
từ dịch nuôi cấy tế bào sử dụng quy trình ly trích theo bộ kit 31
iv




4.3. Điện di RNA trên mẫu ly trích 32
4.4. Kiểm tra độ đặc hiệu của các cặp primer 33
4.5. RT-PCR sử dụng cặp primer P1, P2 33
PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35
5.1. Kết luận 35
5.2. Đề nghị 35
TÀI LIỆU THAM KHẢO 36
PHỤ LỤC x

v




DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
- AMV: Avian myeloblastosis virus
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
- dNTP: Deoxynucleotide triphosphate
- EAV: Equine arteritis virus
- EDTA: Ethylene diamine tetra acetid acide
- ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
- FAb: Fluorescent antibody
- FA: Formaldehyde agarose
- IHC: Immunohistochemistry staining
- IMPA: Immunoperoxidase monolayer assay
- LDV: Lactase dehydrogenase elevating virus
- MDS: Mystery swine disease
- MOPS: 3- morpholine propane sulphonate
- ORF: Open reading fraction
- PAMs: Pulmonary alveolar macrophage
- PRRSV: Porcine reproduction and respiratory syndrome virus
- RT-PCR: Reverse transcriptase polymerase chain reaction
- SHFV: Simian hemorrhagic fewer virus

- SNV: Serum neutralization virus
- TBE: Tris borate EDTA
- TE: Tris EDTA
- μl: Micro lit




vi




DANH MỤC CÁC HÌNH, BẢNG VÀ SƠ ĐỒ

Tên mục Trang
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoặt động của các primer trong phiên mã ngược 19
Bảng 3.1. Cặp primer sử dụng trong phản ứng 21
Bảng 3.2. Thành phần phản ứng RT-PCR 25
Bảng 3.3. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RT-PCR 26
Hình 4.1. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng với Taq Beat Hot Start 28
Hình 4.2. Sản phẩm RT-PCR trên mẫu RNA chuẩn khi dùng Taq polymerase của công
ty Biorad và Abgene. 29
Hình 4.3. Sản phẩm RT-PCR với Taq Beat trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
TRIzol 30
Hình 4.4. Sản phẩm RT-PCR dùng Taq ABgene trên mẫu chuẩn và 5 mẫu ly trích theo
bộ kit 31
Hình 4.5. Sản phẩm điện di RNA sau ly trích 32
Hình 4.6. Sản phẩm RT-PCR dùng cặp primer P1, P2 trên một mẫu RNA chuẩn và 5
mẫu huyết thanh ly trích theo quy trình dùng TRIzol 34

vii