Báo cáo: Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA pdf

Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
Luận văn
Đề tài: Nghiên cứu ảnh hưởng của
nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phat
triển của bi khuẩn sinh IAA
- 1 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
Mục lục
- 2 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
IAA là một hocmôn sinh trưởng thực vật thuộc nhóm auxin. Nguồn
nguyên liệu giàu IAA là các phần non và hạt của cây. Một số vi khuẩn cũng
có khả năng tổng hợp loại auxin này. Phát hiện 3 chủng có khả năng tổng hợp
IAA.
Azotobacter có khả năng cố định nitơ, tiết vào môi trường các vitamin,
axit amin cũng như cáac chất kích thích sinh trưởng thực vật (indol axit
axetic, gibberelic).
Nuôi cấy giống vi khuẩn sinh IAA (Azotobacter chủng T5) vào môi
trường peptone, thử nghiệm trên mức nhiệt độ khác nhau: 25
o
C; 30
o
C; 35
o
C;
40
o
C. Xác định IAA sinh ra trong mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau từ đó xác
định nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA.

2. Mục tiêu:
Xác định nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn
sinh IAA( Azotobacter chủng T5) được thu thập tại BMT- Đăklak.
3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn
Ý nghĩa khoa học: Việc xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh
trưởng của vi khuẩn sinh IAA sẽ tìm ra được nhiệt độ tối ưu cho sự sinh
trưởng và phát triển của chúng. Từ đó sẽ tạo ra môi trường có nhiệt độ thích
hợp trong nuôi cấy để vi khuẩn sinh nhiều IAA.
Ý nghĩa thực tiễn: Do chất IAA chiết xuất từ thực vật sẽ có giá thành
cao, ngoài ra nông dân lạm dụng IAA trong trồng trọt, làm sản phẩm không an
- 3 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
toàn vệ sinh thực phẩm. Vì vậy dùng VSV cung cấp IAA cho thực vật sẽ ổn
định cho đất và không gây ảnh hưởng cho môi trường.
4. Giới hạn:
Ở phạm vi đề tài này chúng tôi chỉ thực thí nghiệm trên đối tượng
khuẩn Azobector chủng T5 được phân lập và tuyển chọn tại Buôn Ma Thuột.
- 4 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
PHẦN THỨ NHẤT
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1. Vi khuẩn sinh IAA : Azotobacter T5
Azotobacter là một loại vi khuẩn (VK) hiếu khí, sống tự do trong đất,
chúng có khả năng cố định đạm cao và không phụ thuộc vào cây chủ. Ngoài
đặc điểm trên thì một số chủng thuộc chi này còn có khả năng sinh tổng hợp
nên IAA (chất kích thích sinh trưởng ở thực vật). Chính nhờ đặc điểm quan
trọng đó VK Azotobacter được ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm phân
bón vi sinh làm tăng năng suất cây trồng.
2. Vai trò của IAA
IAA( acid-3- indolaxetic),trong thực vật,IAA có thể tồn tại ở dạng tự do

hoặc liên kết với glucose hay peptide. IAA và các dẫn xuất của nó thường
được gọi là auxin hay hormon sinh trưởng. Đây là hormon thực vật được biết
sớm nhất.
Ở thực vật bậc cao, IAA tập trung nhiều trong các chồi, lá đang sinh
trưởng, trong tầng phát sinh, trong hạt đang lớn, trong phấn hoa. IAA được
- 5 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
tổng hợp tại đỉnh sinh trưởng của thân. Tiền chất để tổng hợp nên IAA là acid
amin tryptophan. Trong cây IAA di chuyển từ đỉnh xuống gốc với tốc độ 10
-15mm/ h
Auxin có tác dụng sinh lý đến quá trình sinh trưởng của tế bào, hoạt
động của tầng phát sinh, sự hình thànhrễ, hiện tượng ưu thế ngọn, tính hướng
của thực vật, sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt Auxin kích thích
sự sinh trưởng giãn của tế bào, đặc biệt giãn theo chiều ngang của tế bào làm
tế bào to vềchiều ngang, vì vậy làm cho các bộ phận của cây to về chiều
ngang.
Auxin hoạt hoá bơm proton, bơm cácion H+ vào trong màng tế bào làm
giảm pH của màng tế bào nên hoạt hóa enzyme phân hủy các polisaccaritliên
kết giữa các sợi cenlulose làm cho chúng lỏng lẻo và tạc điều kiện
cho thành tế bào giãn ra dưới tácdụng của áp suất thẩm thấu của không
bào trung tâm. Ngoài ra auxin còn kích thích sự tổng hợp các hợp cáccấu tử
cấu trúc nên thành tế bào như các chất cenlulose, pectin,
hemicenlulose Auxin còn ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào, tuy nhiên ảnh
hưởng của auxin lên sự giãn và sự phân chia tế bào trong mối tác động tương
hỗ với các phytohormone khác. Auxin còn có tác dụng hoạt hóa quá trình
sinhtổng hợp các chất như protêin, cenlulose, pectin và kìm hãm sự phân giải
chúng, nhờ thế có thể kéo dài tuổithọ của các cơ quan, đồng thời làm tăng quá
trình vận chuyển vật chất (nước, muối khoáng, chất hữu cơ) ở trong cây, đặc
biệt về các cơ quan sinh sản và cơ quan dự trữ của cây.
Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng auxin ảnh hưởng

mạnh đến hô hấp và quá trình photphorylhóa trong tế bào (Ðioding, 1955;
- 6 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
Audus, 1959; Bonnet, 1957 ). Nồng độ auxin ở mức sinh lý thì tỷ
lệ NADH2/NAD, ATP/ADP tăng lên và ngược lại khi nồng độ auxin cao thì
tỷ lệ đó lại giảm.Auxin gây ra tính hướng động của cây (tính hướng quang và
tính hướng địa). Bằng phương pháp sử dụngnguyên tử đánh dấu cho thấy
AIA phóng xạ được phân bố nhiều hơn ở phần khuất sáng cũng như ở
phầndưới của bộ phận nằm ngang và gây nên sự sinh trưởng không đều ở hai
phía cơ quan nên gây tính hướngđộng của các cơ quan, bộ phận của cây.Auxin
gây hiện tượng ưu thế ngọn: Hiện tượng ưu thế ngọn là một hiện
tượng phổ biến ở trong cây. Khichồi ngọn hoặc rễ chính sinh trưởng
sẽ ức chế sinh trưởng của chồi bên và rễ bên. Ðây là một sự ức
chếtương quan vì khi loại trừ ưu thế ngọn bằng cách cắt chồi ngọn và rễ chính
thì cành bên và rễ bên được giải phóng khỏi ức chế và lập tức sinh trưởng.
Hiện tượng này được giải thích rằng auxin được tổng hợp chủ yếuở ngọn
chính và vận chuyển xuống dưới làm cho các chồi bên tích luỹ nhiều auxin
nên ức chế sinh trưởng.Khi cắt ngọn chính, lượng auxin tích luỹ trong chồi
bên giảm sẽ kích thích chồi bên sinh trưởng. Auxin kích thích sự hình thành rễ
của cây
Sự hình thành rễ phụ của các cành giâm, cành chiết có thể chia làm ba
giaiđoạn: Giai đoạn đầu là phản phân hóa tế bào trước tầng phát sinh, tiếp
theo là xuất hiện mầm rễ và cuối cùngmầm rễ sinh trưởng thành rễ phụ chọc
thủng vỏ và ra ngoài. Ðể khởi xướng sự phản phân hóa tế bào mạnhmẽ thì cần
hàm lượng auxin khá cao. Các giai đoạn sinh trưởng của rễ cần ít auxin hơn
và có khi còn gây ứcchế. Nguồn auxin này có thể là nội sinh, có thể xử lý
ngoại sinh. Vai trò của auxin cho sự phân hóa rễ thể hiện rấtrõ trong nuôi cấy
- 7 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
mô. Trong kỹ thuật nhân giống vô tính thì việc sử dụng auxin để kích thích sự

ra rễ là cựckỳ quan trọng .
Auxin kích thích sự hình thành, sự sinh trưởng của quả và tạo quả
không hạt:Tế bào trứng sau khi thụ tinhtạo nên hợp tử và sau phát triển thành
phôi. Phôi hạt là nguồn tổng hợp auxin nội sinh quan trọng, khuyếchtán vào
bầu và kích thích sự sinh trưởng của bầu để hình thành quả. Vì vậy quả chỉ
được hình thành khi cósự thụ tinh. Nếu không có quá trình thụ tinh thì không
hình thành phôi và hoa sẽ bị rụng. Việc xử lý auxinngoại sinh cho hoa sẽ thay
thế được nguồn auxin nội sinh vốn được hình thành trong phôi và do đó
khôngcần quá trình thụ phấn thụ tinh nhưng bầu vẫn lớn lên thành quả
nhờ auxin ngoại sinh. Trong trường hợpnày quả không qua thụ tinh và do
đó không có hạt.Auxin kìm hãm sự rụng lá, hoa, quả của cây, vì nó ức chế sự
hình thành tầng rời ở cuống lá, hoa, quả vốnđược cảm ứng bởi các chất ứ chế
sinh trưởng. Vì vậy phun auxin ngoại sinh có thể giảm sự rụng lá, tăng sựđậu
quả và hạn chế rụng nụ, quả non làm tăng năng suất. Cây tổng hợp đủ
lượng auxin sẽ ức chế sự rụnghoa, quả, lá
3. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng và phát triển của VK sinh
IAA.
- 8 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
PHẦN THỨ HAI
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Nội dung thực hiện
Xác định mối tương quan giữa nồng độ IAA và chỉ số OD. Xác định
IAA bằng phương pháp soi OD, nếu OD tăng thì nồng độ IAA tăng
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh IAA của vi
khuẩn Azotobacteria chủng T5
Nuôi cấy giống vi khuẩn sinh IAA (Azotobacter T5) vào môi trường
peptone, thử nghiệm trên 4 mức nhiệt độ khác nhau: 25
o
C; 30

o
C; 35
o
C; 40
o
C.
Xác định IAA sinh ra trong mỗi điều kiện nhiệt độ khác nhau, xem môi
trường nào sinh nhiều IAA hơn.
2. Vật liệu nghiên cứu:
Vi khuẩn sinh IAA dùng để làm thí nghiêm này là vi khuẩn
Azotobacter chủng T5.
Nguyên liệu làm môi trường pepton : Pepton, cao nấm men, nước máy
Dụng cụ: 16 ống nghiệm, 1 bình tam giác 500ml, ống đong, bông
không thấm, giấy bạc, đũa thủy tinh, que cấy, đèn cồn, pypet.
3. Phương pháp nghiên cứu:
3.1. Phương pháp xác định phương trình mối tương quan
3.1. 1.Pha môi trường
- Môi trường pepton:
+ Peptone 5g
+ Cao nấm men 2,5g
+ Nước máy 0,5lit
- 9 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
- Cho 5g pepton; 2,5g cao nấm men và 0,5 lit nước máy vào nồi inox,
sau đó đun nóng và khuấy đều cho pepton và cao nấm men tan hết. Tiếp theo
đổ vào bình tam giác 500ml.
- Riêng các dụng cụ còn lại gói giấy báo đem sấy để tiệt trùng
3.2. Chuẩn bị dung dịch giống vi khuẩn sinh IAA
Chuẩn bị ống giống vi khuẩn sinh IAA : Azotobacter chủng T5
3.3. Tiến hành thí nghiệm

3.3.1. Cấy vi khuẩn Aztobacter T5 vào môi trường nuôi giống
- Lau phòng cấy: Lau toàn bộ phòng cấy bằng cồn 90
0
,sau đó bật tia
UV trong vòng 15 phút rồi tắt.
- Tiến hành cấy giống vi khuẩn: Cấy giống vào bình tam giác chứa môi
trường đã chuẩn bị.
Hình 1- Cấy vi khuẩn vào bình để nhân giống
- Để vào nơi thoáng mát, sau2 ngày sẽ đem giống cấy lần 2 vào các ống
nghiệm.
3.3.2. Cấy vi khuẩn azotobacter T5 vào môi trường (Cấy lần 2)
- 10 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
- Gồm 16 ống nghiệm chia làm 4 lô.
- Mỗi lô gồm 4 ống nhưng chỉ cấy vi khuẩn vào 3 ống, 1 ống không cấy
vi khuẩn để làm đối chứng khi đo OD.
- Sau khi cấy giống vào môi trường giống 2 ngày ta tiến hành cấy
truyền vi khuẩn từ môi trường giống sang 12/16 ống nghiệm đã chia lô và
đánh dấu sẵn.
- Lau phòng cấy bằng cồn, và sau đó bật tia UV trong 15 phút
- Đem 16 ống nghiệm và bình vào phòng cấy, lắc đều các bình tam
giác, lấy bông và giấy bạc của bình giống, hơ nhẹ miệng bình giống, tay phải
cầm pipetman gắn đầu tip vô trùng ( chỉnh thể tích 1 ml) hút sinh khối rồi
bơm và các ống nghiệm của 4 lô đã đánh dấu( mỗi lô bơm 3 ống, 1 ống làm
đối chứng)
- Đặt nút bông các ống nghiệm của 4 lô sau đó để 4 lô ở 4 mức nhiệt độ
khác nhau:
- 11 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
Hình 2- Cấy giống vào 4 lô có chứa môi trường

+ Lô 1: 25
o
C( nhiệt độ phòng)
+ Lô 2: 30
o
C
+ Lô 2: 35
o
C
+ Lô 4: 40
o
C
3.3.4. Tiến hành đo OD
- Sau khi cấy 3 ngày, ta đem 4 lô ra đo OD để xác định số lượng tế bào
vi khuẩn
- Bật máy đo OD, lắc đều các ống nghiệm số
- Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở các ống thuộc 4 lô có nhiệt
độ khác nhau.
- 12 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
+ Lô 1: 25
o
C( nhiệt độ phòng): Lấy ông nghiệm môi trường chuẩn 1 đổ
vào ống puvet ( 0/1), sau đó đổ lần lượt 3 ống nghiệm môi trường 1 có nuôi
cáy vi khuẩn vào 3 ống puvet đánh thứ tự 1,2,3. Tiếp theo ta đo OD ở bước
sóng 610nm, đặt ống puvet 0/1 sau đó bấm nút “cal” để về 0, rồi đặt ống puvet
1 vào và số OD đo được là 0,115; ống puvet 2 : 0,120; ống puvet 3: 0,111
+ Lô 2: 30
o
C: Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở bình môi

trường 2(nồng độ tryptophan 0,1%): làm các bước tương tự như trên 3 ống
puvet có số đo OD lần lượt là: 0,100; 0,103; 0,101
+ Lô 3: 35
o
C: Đo OD xác định nồng độ tế bào vi khuẩn ở bình môi
trường 4(nồng độ tryptophan 0,2%): làm các bước tương tự như trên 3 ống
puvet có số đo OD lần lượt là: 0,135; 0,138; 0,139
+ Lô 4: 40
o
C: Làm các bước tương tự như trên 3 ống puvet có số đo OD
lần lượt là: 0,148; 0,135; 0,154
Hinh 3 - Tiến hành đo chỉ số OD ở 4 lô thí nghiệm
- 13 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
Nhận xét: Lô số 2 có chỉ số OD thấp nhất điều đó có nghĩa là số lượng
vi khuẩn nhiều nhất. Như vậy với điều kiện nhiệt độ 30
o
C thì vi khuẩn sinh
IAA sinh trưởng và phát triển tốt nhất.
- 14 -
Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA
KẾT LUẬN
Qua các bước thí nghiệm và tiến hành đo OD ta thấy ở các điều kiện
nhiệt độ khác nhau thì sự sinh trưởng của vi khuẩn Azotobacter T5 cũng khác
nhau.
Ở điều kiện nhiệt độ 30
o
C là nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng và phát
triển của vi khuẩn Azotobacter T5 vì có chỉ số đo OD thấp nhất (0,100; 0,103;
0,101), điều này cũng có nghĩa là nồng độ IAA của môi trường này là cao

nhất.
Kết quả thí nghiệm cho thấy khi nhiệt độ vượt quá ngưỡng tối ưu, nếu
nhiệt độ càng cao thì sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn sinh IAA càng
giảm dần.
Như vậy điểm cực thuận về giới hạn nhiệt độ của Azotobacter T5 là
30
o
C trong nuôi cấy loại vi khuẩn này cần tạo điều kiện nhiệt độ thích hợp cho
sự sinh trưởng và phát triển của chúng để thu được sinh khối lớn nhất.
- 15 -