Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV so với kỹ thuật đọc trình tự gen

-
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
HOÀNG XUÂN SỬ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - RFLP
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B
LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh y học
Mã số : 62.72.68.05
Hướng dẫn khoa học: TS. BS. NGUYỄN LĨNH TOÀN
Hà Nội 2009
2
-
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những
nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiều
quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mặc dù đã có vaccine phòng
nhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao.
Theo ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV,
trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6%
dân số thế giới [23]. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ
người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gan
tối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan
(UTBMTBGUTTBG) [8], [243] [53], [72]. Ước tính mỗi năm có hơn một
triệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính [Lee57, 1997]. Vậy câu
hỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khác
nhau. Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch của
vật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt về
kiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng có
liên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc kháng

virus cũng như tiên lượng bệnh [Song và CS, 200590].
Kiểu gen của HBV được mô tả lần đầu bởi Okamoto và CScs năm 1988.
Các tác giả thấy rằng giữa các kiểu gen khác nhau có số lượng các nucleotide
khác nhau tối thiểu là 8% trên toàn bộ bộ gen (genome) của chúng. Cho đến
nay có ít nhất là 8 kiểu gen khác nhau của HBV đã được phát hiện và ký hiệu
từ A đến H (HBV - A đến - H) [22], [35], [64], [67], [86]. Gần đây, Tran và
CS đã chứng minh ở Việt Nam HBV có thể tồn tại thêm một kiểu genegen
mới là kiểu gen I [Tran và cs, 200889].
Nhiều nghiên cứu cho thấy các kiểu gen khác nhau của HBV đều có ảnh
hưởng khác nhau đối với diễn biến lâm sàng bệnh lý gan do HBV. Nghiên
3
-
cứu của Suzuki và cộng sựCS (2005) thấy rằng kiểu gen B thường gặp ở bệnh
nhân viêm gan mạn, trong khi kiểu gen A lại thường thấy ở trong viêm gan
cấp [8286]. Trong khi đó nhiều nghiên cứu khác gần đây cho thấy kiểu gen C
thường gây tổn thương gan nặng nề hơn so với kiểu gen B, kiểu gen A thường
gây viêm gan mạn hơn kiểu gen D. Người mang HBV mạn tính có nguy cơ
phát triển thành xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan thường gặp hơn ở kiểu
gen C so với kiểu gen B và kiểu gen C khó điều trị hơn kiểu gen B cũng được
quan sát thấy ở nhiều nghiên cứu [3235], [46], [48], [49], [50], [52], [58],
[6670].
Hiện nay, có nhiều phương pháp xác định kiểu gen của HBV đang được
áp dụng. trên thế giới. Như phương pháp chuẩn là đọc trình tự gen và phân
tích loài (Sequencing and Phylogenetic analysis) [2223],, [64]; tiếp đến là
phương pháp realtime - PCR hoặc realtime - PCR kết hợp phân tích đường
cong nóng chảy (melting curve) dựa vào trên nguyên lý đếm thời gian thực và
phân tích sự khác nhau về nhiệt độ nóng chảy của các sản phẩm PCRDNA
[8185], rồi đến các phương pháp lai đầu dò (line probe assay, LiPA) [2830],
PCR đa mồi (Multiplex - PCR) [4144], [68], phản ứng dot blot ngược dòng
(FT - RDB: flow through reverse dot blot ) [7478], oligonucleotide

microarray [8692] và đặc biệt là phương pháp PCR - RFLP (PCR - restriction
fragment length polymorphism) [38], [39], [57]. Ở Việt Nam phổ biến hiện
nayđang sử dụng phương pháp đọc trình tự gen, lai đầu dò và multiplex -
PCR [5], [8], [19]. Tuy nhiên, các phương pháp này giá thành khá cao, cần
nhiều trang thiết bị đắt tiền và mất khá nhiều thời gian.
Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen
HBV có ý nghĩa quan trọng góp phần làm giảm giá thành xét nghiệm, phổ
biến kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và đầu tư trang thiết bị cũng như mang lại
4
-
lợi ích về kinh tế và tiết kiệm chi phí điều trị cho người bệnh. Chính vì những
lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
1. Xác định điều kiện tối ưu và lựa chọn enzyme giới hạn thích hợp
cchoủa kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV.
2. Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác
định kiểu gen HBV so với kỹ t
huật đọc trình tự gen.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nhiễm virus viêm gan B
1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus,
HBV) đặc hiệu, nhưng nhiễm HBV vẫn đang là vấn đề mang tính toàn cầu.
Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus
không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục đến viêm gan mạn, xơ gan
và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBGUTTBG) [Acharya SK và CS,
200021], [23], [5357]. HBV có thể lây qua đường tình dục, đường máu, từ mẹ
sang con. Ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm
HBV, trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính.

Khoảng ba phần tư số người mang HBV mạn tính đang sống ở Châu Á và khu
vực Sub - Sahara của Châu pPhi với tỷ lệ cao số người mang virus trong cộng
đồng. Tỷ lệ lưu hành HBV ở mức trung bình tại vùng Ðịa Trung Hải, Nhật
Bản và một phần Ðông Âu. Trong khi đó tỷ lệ này tương đối thấp dưới 2%
dân số tại phần lớn các nước Tây Âu, Châu Úc và Bắc Mỹ. Các nghiên cứu
gần đây cho thấy rằng những người nhiễm HBV mạn tính có nguy cơ tiến
5
-
triển UTBMTBGUTTBG cao hơn 100 lần so với người bình thường. Trung
bình mỗi năm có hơn 1 1 triệu người chết do nhiễm HBV gây nên [23],
[5357]. Sự khác nhau về tỷ lệ lưu hành toàn cầu có khả năng là do có sự khác
biệt về các đường lây truyền HBV chính, điều kiện kinh tế và khả năng chăm
sóc y tế. Ở các vùng bệnh lưu hành địa phương như Châu Á và Tây Phi, lây
truyền HBV thường xảy ra trong thời kỳ chu sinh, với tỷ lệ lây truyền cho trẻ
sơ sinh cao đến 90% từ các bà mẹ có HBsAg và HBeAg (+). Người ta thấy
rằng có trên 95% các trường hợp trẻ lây nhiễm HBV từ mẹ trở thành người
mang HBV mạn tính [23], [5357].
Căn cứ vào các số liệu điều tra dịch tễ học WHO đã chia các khu vực
nhiễm HBV trên thế giới thành 3 khu vực dịch lưu hành.
Bảng 1.1. Các khu vực nhiễm HBV trên thế giới [xx] (E.PILLY - 1998)
Khu vực
lưu hành
thấp
Khu vực lưu hành
trung bình
Khu vực lưu
hành cao
Tỷ lệ HBbsAg (+) 0,1 - 0,5% 2 - 7% 8 - 15%
Tỷ lệ aAnti - HBs (+) 3 - 5% 20 - 50% 70 - 95%
Nhiễm HBV ở trẻ sơ

sinh
Hiếm Không phổ biến Phổ biến

Phân bố
Tây Âu,
Bắc Mỹ,
Australia
Địa Trung Hải,
Liên Xô cũ, Đông
Âu, Trung Đông,
Nam Mỹ, Nhật Bản
Trung Quốc,
Đông Nam Á,
Hạ Sahara,
Châu Phi
1.1.1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam
Ở Việt Nam rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV đứng
hàng cao nhất thế giới. Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%
6
-
thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người
mang HBV mạn tính [3], [4], [16], [20], [6266]. Tỷ lệ mang anti - HBs trên
60%. Tuy vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng
tác giả cũng khác nhau [6266].
Theo Phạm Song và cộng sự CS thấy tỷ lệ nhiễm HBsAg ở 6 - 14%,
anti - HBs ở 35 - 37% số người không mắc bệnh gan và tăng theo lứa tuổi.
Nguyễn Anh Tuấn bằngvới kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA:
Radioimmunoassay) đã phát hiện 11% số người khỏe mạnh có HBsAg (+)
[3], [16]. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam được các nghiên cứu công bố
gần đây tóm tắt ở bảng 1.2.

Bảng 1.2. Tỷ lệ HBsAg (+) ở một số quần thể dân cư nước ta
Địa
phương
Tác giả Cộng đồng
Tỷ lệ %
HBsAg(+)
Năm
Miền Bắc Lê Hồng Quang Công nhân 13, 62 1993
Hà Nội Lê Vũ Anh
Trần Thị Chính
Phan Thị Phi Phi và
CS.
Dân cư
35 - 59 tuổi
Người lớn khỏe mạnh
11, 35
14, 4
13, 9
1988
1993
1993
Hồ Chí
Minh
Trần Văn Bé,
Trương Xuân Liên
Người lớn khỏe mạnh
Công nhân viên
9, 3
16, 6
1994

1994
Tiền
Giang
Trần Minh Phụng Người tự nguyện và
công nhân
21, 28 1995
Lâm Đồng Hoàng Công Long Số liệu của phòng xét
nghiệm
16, 74 1994
Bình
Thuận
Lê Khai Thọ Số liệu của phòng xét
nghiệm
17, 68 1994
An Giang Châu Hữu Hầu Cộng đồng
Bệnh viện
11, 0
16, 2
1995
1995
7
-
Thanh
Hóa
David B. Hipgrave,
Nguyen Thu Van và
CS.
Cộng đồng (n=1579)
Sơ sinh
Trẻ em

Thanh niên
Người lớn
18 ± 2,4
12,5 ± 2,8
18,4 ± 5
20,5 ± 5,3
16,8 ± 1,8
1995
1.1.2. Đường lây nhiễm của HBV
HBV có ở trong máu và các chế phẩm từ máu, các dịch tiết như tinh
dịch, dịch âm đạo, nước bọt, nước mắt, sữa mẹ [20], [4246]. Khi tiếp xúc
với các nguồn bệnh trên thì sẽ có nguy cơ cao nhiễm HBV.
Có 3 con đường lây nhiễm cơ bản HBV [20], [23].
+ Lây truyền từ máu và các chế phẩm từ máu thông qua tiêm, truyền,
các thủ thuật, phẫu thuật, lọc máu Hiện nay, những người sử dụng ma túy
đường tiêm chích là đối tượng có nguy cơ nhiễm HBV cao nhất.
+ Lây truyền từ mẹ sang con: Đây là con đường truyền bệnh nguy hiểm
bởi vì có từ 90 - 95% số trẻ bị nhiễm theo con đường này có nguy cơ tiến
triển thành nhiễm HBV mạn tính. Tỷ lệ lây nhiễm cho trẻ cao khi người mẹ
nhiễm HBV cấp ở 3 tháng cuối của thai kỳ và, xung quanhgần thời gian đẻ
đối với người mẹ nhiễm HBV mạn tính. Nếu người mẹ có đồng thời HBsAg
(+) và HBeAg (+) thì nguy cơ nhiễm cho con lên tới 90% [23].
+ Lây truyền qua đường tình dục: Sinh hoạt tình dục với người nhiễm
HBV, dù khác giới hay đồng giới bằng các đường âm đạo, hậu môn hay
đường miệng đều có khả năng nhiễm bệnh. Khả năng lây bệnh cao khi người
nhiễm có HBeAg (+), hoặc khi nồng độ HBV - DNA trên 10
5
copies/ml.
8
-

1.1.3. Cấu trúc của HBV
1.1.3.1. Hình thể và cấu trúc của HBV
HBV là một thành viên thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus
hướng gan (hepatotropic) có bộ gen (genome) là chuỗi xoắn kép DNA đóng
vòng không kín, có capside và quá trình nhân lên không gây tan tế bào gan
nhiễm virus [3639]. Dưới kính hiển vi điện tử (Hình 1.1A) quan sát thấy HBV
tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau:
+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm.
+ Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm.
+ Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây
chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp [3336]:
- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các
kháng nguyên bề mặt (HBsAg).
- Lớp lõi: Capside đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi
HBcAg. Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng
không kín, enzyme DNA phiên mã ngược- polymerase và protein kinase
(A) (B)
9
-
Hình 1.1. (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử (ABock CT &
Zentgraf, 1992) và (B) mô hình hóa cấu trúc (BLee, 1997), Tiểu thể Dane
(C)
10
-
1.1.3.2. Cấu trúc bộ gen của HBV
Bộ gen (Genome) của HBV là một phân tử DNA đóng vòng không kín
gồm 2 sợi có kích thước khác nhau. Sợi ngoài nằm bên ngoài mang cực tính
âm tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base và mã
hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của HBV. Sợi ngắn nằm bên trong cực
tính dương có chiều dài thay đổi bằng 50 - 80% so với sợi âm [2], [11],

[4246] .
Cấu trúc vòng của DNA được đảm bảo là nhờ sự ghép nối 2 đầu 5’ của 2
hai sợi DNA trên một đoạn có chiều dài 200 nucleotide (Nu.), được gọi là
vùng liên kết (cohesive region). Vùng này nằm giữa 2 trình tự DR1 và DR2
(Directly repeated sequence) gồm có 10 - 11 Nu, trong đó DR1 nằm ở đầu 5’
của sợi DNA âm và cũng hiện diện ở đoạn thừa ra (redundant) của đầu 3’, còn
DR2 nằm ở đầu 5’ của sợi DNA dương. Hai trình tự này có vai trò chủ yếu
trong việc khởi phát quá trình tổng hợp của các chuỗi DNA tương ứng. Thứ
tự của các Nu. được đánh số bắt đầu từ 1 tương ứng ở vị trí cắt trên bộ gen
HBV của enzyme EcoRI (Hình 1.2). Chiều dài của bộ gen thay đổi tùy theo
từng kiểu gen khác nhau, [11], [23].
11
-

Hình 1.2. Sơ đồ cấu trúc các genbộ gen của HBV
Bộ gen của HBV được tổ chức thành 4 đơn vị sao dịch mã dưới sự điều
khiển của 4 vùng khởi động độc lập (Promoter) tạo ra 4 chuỗi mARNA thông
tin (mRNA) với kích thước tương ứng là 3.,5,; 2.,4;, 2,.1 và 0,.7 kilobase
(Kb). Quá trình đọc mã bắt đầu từ bộ ba nucleotid ATG được gọi là codon mở
đầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) là TAG.
Những phân tử mRNA này tạo thành sẽ được vận chuyển ra bào tương tế bào
và sẽ dịch mã tạo ra các protein tương ứng là (protein capside, polymerase,
protein bề mặt vỏ lớn, vừa và HBx) ở trong bào tương của tế bào gan, cuối
cùng các protein này được lắp ghép với pregenomic HBV - RNA và tiếp tục
hoàn thành chu trình nhân lên của HBV [11], [396], [4246].
Cấu trúc bộ gen của HBV gồm 4 đoạn gen: S, P, C, X tương ứng với 4
khung đọc mở (open reading frame) là các vùng mã hóa tổng hợp các protein
của HBV. Quá trình đọc mã bắt đầu từ bộ ba Nu. ATG được gọi là codon
khởi đầu (start codon) và chấm dứt bằng codon kết thúc (stop codon) là TAG.
* Gen S (Surface) gồm 3 vùng: Vùng S, PreS1, PreS2 có chức năng mã

hóa tổng hợp phân tửprotein kháng nguyên bề mặt của HBV hay HBsAg
(Hepatitis B surface Antigen) bao gồm HBsAg nhỏ, HBsAg trung bình và
HBsAg lớn.
- Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 34 kD gồm
226 acid amin (aa). Protein này gồm 2 thành phần là p24 và gp27 (gp:
Glycoprotein). Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số. Người ta phát hiện ở
vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) của
HBsAg. Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà người ta
phân ra các phân type khác nhau. Mỗi phân type đều có chung quyết định
kháng nguyên “a” và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định
12
-
kháng nguyên “d” hoặc “y” ghép với “w” hoặc “r” để tạo nên các phân type
như adw, ayw, adr, ayr. Chính vùng “a” có liên quan đến tính miễn dịch vì nó
quyết định cho sự tổng hợp anti - HBs.
- Đoạn gen S và preS2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài
33 kD gồm 281 aa. Protein này gồm 2 loại gp33 và gp36. Người ta cho rằng
vùng preS2 có vai trò giúp cho HBV bám dính và xâm nhập vào trong tế bào
gan nhờ nó liên kết với 1 loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh
người (pSHA: polymerised Human Serum Albumin), đồng thời trên các tế
bào gan cũng có các thụ thể để gắn với pHSA. Nếu trên tế bào gan thiếu các
thụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng kháng với sự nhiễm
HBV.
- Đoạn gen S, preS1 và preS2 tổng hợp nên protein L (Large) có chiều
dài 39 kD gồm 2 loại p39 và gp42. Chuỗi protein pre S1 có chiều dài thay đổi
tùy theo phân type khác nhau. Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt
của tế bào gan sẽ liên kết với HBV, giúp HBV xâm nhập vào trong tế bào
gan. Kháng thể anti - preS1 có thể trung hòa và ức chế HBV kết dính ở tế bào
gan. Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của
virion, trong đó protein S chiếm đa số. Protein M chiếm khoảng 5 - 10% trong

các virion và các tiểu thể có kích thước 22 nm. Protein L chiếm 20% trong vỏ
bọc của virion và các tiểu thể dạng ống nhưng chỉ chiếm 1 - 2% trong các
protein của tiểu thể có kích thước 22 nm.
* Gen C (Core): Ở đầu 5’ của gen C có 2 codon khởi đầu cho quá trình
đọc mã. Trình tự Nu. nằm giữa 2 codon này được gọi là vùng preCore. Nếu
quá trình đọc mã được bắt đầu từ codon ATUG thứ nhất ở vị trí 1814 và đọc
suốt chiều dài của đoạn gen preCore và C sẽ tổng hợp nên HBeAg (Hepatitis
B early Antigen). Các Nu. đầu tiên của vùng preCore sẽ mã hóa một đoạn
peptide gồm 19 aa gọi là peptide tín hiệu (signal peptide). Peptide này giúp
13
-
cho HBeAg được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào ở bào tương của tế bào
gan, đồng thời cũng giúp cho kháng nguyên này hòa tan được trong huyết
thanh. Vì vậy, HBeAg được gọi là kháng nguyên hòa tan của HBV. Đây là
một loại protein không tham dự vào cấu trúc của virion và chức năng của nó
cho đến nay vẫn còn nhiều điều chưa được sáng tỏ. Sự xuất hiện của HBeAg
có liên quan đến tính lây nhiễm và phản ánh tình trạngcủa HBV đang ở trong
giai đoạn nhân lên. Nếu quá trình đọc mã bắt đầu từ codon ATG thứ hai ở vị
trí 1901 và đi suốt đoạn gen C sẽ tổng hợp nên kháng nguyên lõi hay HBcAg
(Hepatitis B core Antigen). Đây là kháng nguyên cấu trúc của phần
nucleocapside. Vì HBcAg không có đoạn peptide tín hiệu cho nên nó không
được bài tiết ra ngoài tế bào gan. Vì vậy, HBcAg không bao giờ xuất hiện
trong huyết thanh.
Một số trường hợp xảy ra đột biến ở vùng preCore tại vị trí 1896,
Guanosine được thay thế bằng Adenin, tạo nên một trình tự TAG là một
codon kết thúc. Chính codon kết thúc này đã chấm dứt quá trình dịch mã của
vùng preCore, cho nên sự tổng hợp của HBeAg không thực hiện được mặc dù
quá trình nhân lên của HBV vẫn tiếp diễn.
* Gen P (polymerase) chiếm 80 % chiều dài toàn bộ gen của HBV. Sản
phẩm của gen này là enzyme phiên mã ngược polymerase (revert

transcriptiont - polymerase). Enzyme này vừa có hoạt tính DNA polymerase
phụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA.
Enzyme DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền
genome (pregenome) mà sợi RNA tiền genome này lại được tạo ra từ khuôn
mẫu là DNA của HBV dưới tác dụng của enzyme RNA polymerase của tế
bào gan. Sản phẩm enzyme P không chỉ liên quan đến cơ chế phiên mã ngược
mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capside bao bọc bên ngoài cấu trúc
RNA tiền genome.
14
-
* Gen X mã hóa HBx protein có kích thước 154 aa, trọng lượng phân
tử 17 kD (Diao và CS, 2001) [3437] là một protein nhỏ nhất trong các protein
của HBV. Trong các protein của HBV, HBx được cho là một protein có vai
trò trung tâm trong quá trình nhiễm virus và bệnh sinh ung thư tế bào
ganUTTBG (Paterlini P và CS, 1999) [7781]. Đây là một protein điều hoà đa
chức năng; có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều gene
đích của tế bào; làm trung gian, hoặc đối lập với nhiều chức năng khác nhau
của tế bào, bao gồm điều hoà chu trình tế bào, quá trình sao chép, dẫn truyền
tín hiệu, mã hoá tổng hợp các phân tử kết dính, hoạt hoá các gene sinh ung
thư hoặc gene ức chế ung thư của tế bào (Pang R, và CS, 2006; Peng Z, và CS
2005) [740], [751]. Nhiều nghiên cứu cho thấy HBx có những vai trò chính
sau:
- HBx hoạt hoá sao chép (Transcriptional transactivation): Người ta đã
chứng minh rằng HBx-protein hoạt hoá biểu hiện các gen thông qua tác động
trên các con đường điều hoà biệt hoá tế bào. Tác động này phụ thuộc vào sự
phân bố của HBx ở các khu vực khác nhau trong tế bào. Các nghiên cứu theo
hướng này cho thấy HBx - protein phân bố chủ yếu ở bào tương, một số ít ở
trong nhân và màng nhân tế bào. Vì thế, HBx tác động tăng cường điều hoà
các dòng tín hiệu chủ yếu ở bào tương như MAPK/ERK (Mitogen Activated
Protein Kinasse/Extracellular-respone kinase), hoạt hoá các genegen tiền ung

thư như c -– Myc và, c - Jun, hoạt hóa NF - kB, AP - 1, AP - 2, RPB5 của
RNA polymerase II, TATA binding protein, CREB (ATF/cAMP response
elemenenzymet binding protein) và các genegen tăng cường (enhancers) khác
của chính HBV ở trong nhân tế bào (Pang R và CS, 2006) [7074].
- HBx điều hoà các dòng tín hiệu nội bào: Nghiên cứu gần đây chứng
minh rằng HBx tác động lên một số dòng tín hiệu như MAPK/ERK, protein
kinase B (AKT/PKB), PKC, SAPK/JNK (Stress Activated Protein Kinase),
15
-
Phosphatidyl Inositol 3-kinase (PI-3-K), và Janus kinase/Signal transducer
and activator of transcription (JAK)/STAT), pSTAT3 và Supressor of
cytokine signaling-3 (SOCS-3) (Bock, +Toan và CS, 2008) [28] Tác động
của HBx đồng thời lên nhiều dòng tín hiệu khác nhau tạo ra một đáp ứng sinh
học điển hình, đây có thể là nguyên nhân gây hoạt hoá kéo dài và thúc đẩy sự
nhân lên và sống sót của tế bào.
- HBx điều hoà tế bào chết theo chương trình (Apoptosis): HBx điều
hoà quá trình apoptosis liên quan đến một số protein như p53, retinoblastoma
protein (Rb), Fas associated death domain protein (FADD), tumour necrosis
factor (TNF) receptor associated death domain protein (TRADD) và NF - kB
ở bệnh nhân ung thư tế bào gan liên quan đến HBV (Peng Z, và CS, 2005)
[75] HBXx phân bố ở trong mitochondri của tế bào là nguyên nhân tiềm
tàng gây mất màng mitochondri, hậu quả dẫn đến tế bào chết theo con đường
phụ thuộc mitochondri (Shirakata Y, và cs, 2003) [795]. Các virus viêm
ganHBV làm biến đổi các dòng tín hiệu chống lại quá trình chết theo chương
trình của tế bào (antiapoptosis signals) như STAT - 3 và NF - kB thông qua
cơ chế cưỡng bức ER (Endoplasmic Reticulum Stress) và sản sinh phản ứng
oxy hoá thứ phát (ROS) (Lee và CS, 2004; Waris G và CS, 2001) [5458],
[960]. Ngoài ra, HBx - protein còn làm biến đổi dòng canxi bởi ức chế hoạt
hoá Pyk2 (proline rich tyrosine kinase-2) và Src kinase hoặc dòng canxi trung
gian bởi kênh canxi ở mitochondri (Bouchard và CS, 2001) [297].

- HBx điều hoà chu kỳ tế bào: Có rất nhiều yếu tố tham gia điều hoà chu
kỳ phát triển tế bào như hoạt hoá cyclin, cyclin dependent kinase (CDKs) và
CDK inhibitors (CDKIs) HBx làm tăng tỷ lệ và mức độ hoạt hoá CDK2 và
các cyclin E, A hoặc B (Bouchard và CS, 2001) [297] và gây biểu hiện quá
mức cyclin D1 (Klein và CS, 2003) [551]. GeneGen Rb là một genegen ức chế
16
-
quá trình tăng trưởng tế bào và có vai trò nhất định trong điều khiển sự nhân
lên của tế bào.
1.1.4. Sự nhân lên của HBV trong tế bào gan
Trong chu trình nhân lên của HBV có giai đoạn sao chép ngược từ RNA
để tạo nên một DNA mới nhờ enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase).
HBV có tỷ lệ đột biến rất cao vì enzyme này hay bị sai sót trong khâu sao
chép. Quá trình nhân lên của HBV gồm nhiều giai đoạn [11], [462].
* Giai đoạn tạo ra một DNA dạng siêu xoắn (supercoiled DNA): Sau khi
xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ cơ chế xâm nhập tế bào (endocytosis),
HBV đã phóng thích phần vỏ chỉ còn phần lõi có chứa phân tử DNA để đi
vào trong nhân tế bào. Ban đầu phân tử DNA vòng có chuỗi trong ngắn hơn
chuỗi ngoài nhưng khi vào trong nhân tế bào gan nhờ enzyme DNA
polymerase sẽ bổ sung cho chiều dài của chuỗi trong tạo nên một DNA vòng
khép kín với hai chuỗi dài bằng nhau và bị xoắn cuộn lại nhờ các liên kết
đồng hóa trị. DNA này viết tắt là cccDNA (covalently closed circular DNA).
Sự xuất hiện của cccDNA trong tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọng
trong việc duy trì tình trạng mạn tính của nhiễm HBV hay sự tái phát của
bệnh.
* Giai đoạn tổng hợp sợi RNA tiền genome.
Sợi RNA tiền genome được tổng hợp từ sợi âm của cccDNA dưới tác
dụng xúc tác của enzyme RNA polymerase II ở tế bào. Sợi RNA tiền genome
này có chiều dài 3,5kb và bị dư ở hai đầu của một đoạn thừa R (R: redundant)
từ 150 - 200 Nu. và bao gồm cả trình tự DR1. Sợi RNA tiền genome chứa

đựng toàn bộ thông tin di truyền của HBV và nó sẽ làm khuôn mẫu để tổng
hợp nên sợi DNA sợi âm của bộ gen HBV sau này.
Ở đầu 5’ của sợi RNA tiền genome còn có một tín hiệu “ε” rất chuyên
biệt cho HBV để khởi phát quá trình bao bọc (encapsidation) cấu trúc RNA
17
-
tiền genome và enzyme polymerase bằng các protein của phần capside. Các
protein của capside và enzyme polymerase được tổng hợp từ sợi RNA thông
tin thứ hai cũng có chiều dài là 3,5kb.
Ngoài ra trong giai đoạn này còn có sự phiên mã tổng hợptạo nên của các
sợi bán phần genome (subgenomic) chỉ mang một phần các thông tin di
truyền của HBV. các sợi RNA thông tin với kích thước 2,4; 2,1 và 0,7kb
trong nhân tế bào sau đó được vận chuyển ra bào tương và Các RNA này có
chiều dài khác nhau như 2,4kb, 2,1kb và 0,5kb sẽ thực hiện quá trình dịch mã
tổng hợp nên các protein còn lại của HBV như protein HBsAg, và protein
XHBx
* Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi dài có cực tính âm. Đây là giai
đoạn tổng hợp sợi DNA từ khuôn mẫu là RNA nên được gọi là quá trình sao
chép ngược. Quá trình này diễn ra trong bào tương của tế bào gan.
Trong lúc sợi RNA tiền genome được bao bọc bên ngoài bằng phần
capside, quá trình sao chép ngược sẽ được khởi phát nhờ việc sử dụng chất
mồi là nhóm hydroxyl của Tyrosine trên enzyme phiên mã ngược DNA
polymerase của HBV. Enzyme phiên mã ngược này sẽ đến tương tác với tín
hiệu “ε” ở đầu 5’ của sợi RNA tiền genome và nhập thêm 4 Nu. đầu tiên là
GTAA. Tiếp theo đó phức hợp enzyme polymerase và bốn trình tự đầu tiên
này di chuyển đến vùng DR1 ở đầu 3’ của sợi RNA tiền genome và tiếp tục
nối dài ra thêm để tổng hợp nên sợi DNA mang cực tính âm.
* Giai đoạn tổng hợp sợi DNA chuỗi ngắn mang cực tính dương.
Sự tổng hợp chuỗi ngắn mang cực tính dương được bắt đầu tại trình tự
DR2 của chuỗi dài nhờ sử dụng chất mồi là phần oligoribonucleotide ở đầu 5’

của sợi RNA tiền genome và bao gồm cả trình tự DR1. Quá trình nhân lên
được tiếp tục nhờ sự khép vòng (circulation) của sợi DNA thông qua hiện
tượng lai ghép (hybridation) giữa chuỗi dài với chuỗi ngắn.
18
-
Trong lúc này phần lõi của HBV sẽ được lắp ghép thêm phần vỏ bọc rồi
được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào thương để phóng thích ra khỏi tế bào
gan đi vào tuần hoàn hoặc để vào lại một tế bào gan khác để hình thành một
chu trình nhân lên mới. Mặt khác, sợi RNA tiền genomic ở trong bào tương
có thể vào lại nhân tế bào để hình thành một chu trình nhân lên mới chính trên
tế bào gan đó (Hình 1.3). Chính sự vào lại chu trình nhân lên này sẽ góp phần
duy trì sự tồn tại của dạng cccDNA trong tế bào gan. Khi phần capside được
bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của enzyme DNA polymerase, cho nên
sự tổng hợp của sợi DNA mang cực tính dương thường không hoàn toàn, do
đó chuỗi trong thường ngắn hơn chuỗi ngoài.

Hì×nh 1.3. Chu trì×nh nhâ©n lêªn củña HBV ([Ganem vൠPrince, 2004)]
19
-

Hình 1.3. Quá trình xâm nhập và nhân lên của HBV
1.1.5. Sinh lý bệnh trong nhiễm HBV
1.1.5.1. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV
* Đáp ứng miễn dịch tế bào: Đây là cơ chế chính gây tổn thương tế bào
gan và thải trừ HBV ra khỏi cơ thể [8], [11], [14], [462].
+ Đại thực bào: lưu hành trong máu và tổ chức, ở các cơ quan khác
nhau có tên gọi khác nhau như đại thực bào phế nang ở phổi, tế bào Kuffer ở
gan, tế bào thần kinh đệm ở tổ chức thần kinh, tế bào có tua (dendritic cell) ở
tổ chức hạch lympho. Đại thực bào có nhiệm vụ bắt, tiêu diệt các tế bào
nhiễm HBV và trình diện kháng nguyên HBV lên bề mặt ngay cạnh phân tử

HLA (Human Leucocyte Antigen) lớp II. Đại thực bào sau khi được hoạt hóa
bởi yếu tố hoạt hóa thì khả năng bắt, tiêu diệt các tế bào nhiễm HBV tăng lên
nhiều lần.
+ Các tế bào Lympho: - Tế bào TCD4: Là quần thể tế bào lympho T có
thụ thể CD4 có khả năng nhận diện kháng nguyên HLA lớp II trên bề mặt tế
bào đại thực bào, có thụ thể CD3 nằm ngay cạnh thụ thể CD4 làm giá đỡ cho
20
-
thụ thể dành cho quyết định kháng nguyên của HBV. Kết quả của sự tương
tác: tế bào TCD4 được hoạt hóa giải phóng các cytokine như các yếu tố hoạt
hóa đại thực bào, các yếu tố hoạt hóa tế bào lympho T, yếu tố hỗ trợ lympho
bào B để tế bào này sản xuất ra các lớp kháng thể và gia tăng trình diện kháng
nguyên HBcAg lên bề mặt tế bào gan bên cạnh phân tử HLA lớp I.
- Tế bào TCD8: Là quần thể tế bào lympho T có thụ thể CD8 nhận diện
kháng nguyên HLA lớp I trên bề mặt tế bào gan, có thụ thể CD3 làm giá đỡ
cho thụ thể dành cho quyết định kháng nguyên HBcAg. Kết quả của sự tương
tác này dẫn tới tế bào TCD8 hoạt hóa và chúng có khả năng giết các tế bào
nhiễm virus. Tế bào TCD8 bất hoạt các thành phần bên trong tế bào trước khi
tế bào bị ly giải. Điều này tránh được sự lây lan của virus tới các tế bào lành.
Đây là cơ chế chính gây tổn thương tế bào gan.
Ngoài ra tế bào TCD8 còn tiết ra các cytokine thu hút các tế bào viêm,
đại thực bào gây tăng cường phá hủy tế bào gan nhiễm HBV.
Một số nghiên cứu gần đây cho thấy ở bệnh nhân VGVR B cấp số
lượng tế bào Lympho TCD3, TCD4, TCD8 đều tăng cao trong giai đoạn toàn
phát và trở về gần như bình thường trong giai đoạn hồi phục. Có mối tương
quan chặt chẽ giữa số lượng tế bào lympho với lâm sàng và hóa sinh. Mức độ
càng nặng, enzyme transaminase, bilirubin càng cao thì số lượng tế bào
lympho càng tăng cao. Tuy nhiên, ở bệnh nhân VGVR B mạn thì số lượng tế
bào lympho T giảm hơn bình thường trong giai đoạn tiến triển của bệnh và có
sự hồi phục không đáng kể ở giai đoạn hồi phục [13].

+ Tế bào giết tự nhiên NK (Natural Killer): Các tế bào này trực tiếp phá
hủy tế bào gan bị nhiễm HBV không thông qua quá trình mẫn cảm đặc hiệu
nào. Trong bệnh nhân VGVR B cấp, Choong và cs thấy tỷ lệ tế bào NK ở
nhóm bệnh nhân có HBsAg (+) cao hơn nhóm HBsAg (-).
21
-
* Đáp ứng miễn dịch dịch thể:
Các kháng thể đặc hiệu là: các kháng thể kháng HBV có vai trò khác
nhau trong thải trừ virus ra khỏi cơ thể.
+ Anti - HBs: Là kháng thể kháng lại kháng nguyên HBsAg. Đây là
kháng thể có khả năng giúp cơ thể bảo vệ chống lại HBV, chính nhờ có đặc
tính này vaccine dự phòng viêm gan B ra đời, trên cơ sở tạo miễn dịch chủ
động từ kháng nguyên HBsAg. Hoàng Vũ Hùng khi nNghiên cứu sự biến
động các marker dấu ấn của HBV trên bệnh nhân VGVR B cấp chođã nhận
thấy: 8,2% bệnh nhân xuất hiện anti - HBs (+) sau khi ra viện, 37,3% sau 1
tháng và 85,7% sau 3 tháng. Tất cả bệnh nhân mang HBsAg mạn tính đều
không xuất hiện Anti - HBs [13].

+ Anti – PreS1q, anti - PreS2 chỉ có vai trò tiên lượng trong VGVR B
cấp mà không có vai trò gì trong cơ chế bệnh sinh. Trong khi đó
+ A anti - HBc (anti - HBc-IgM và -–IgG) có vai trò chỉ điểm trong chẩn
đoán xác định giai đoạn của bệnh như nhiễm HBV cấp, hay mạn hay bán cấp.
+ Anti - HBe có giá trị tiên lượng bệnh, khi bệnh nhân chuyển từ
HBeAg(+) sang HBeAg(-) và anti - HBe (+) thì người bệnh đã có chuyển đảo
huyết thanh (seroconversion) tức là quá trìnhsự nhân lên của virus HBV đã bị
khống chế.
+ Các cytokine: Cytokine được sinh ra trong quá trình đáp ứng miễn dịch
với HBV rất phong phú và đa dạng. Mỗi cytokine có một chức năng khác
nhau:
- IL1 - IL13 có chức năng điều hòa miễn dịch.

- TGF, G - CSF, erythropoietin kích thích tế bào gốc tạo máu.
22
-
- Interferon, TNF có nhiều chức năng riêng biệt.
Cho đến nay việc nghiên cứu vai trò của các cytokine trong bệnh sinh của
HBV đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể. Tuy nhiên vẫn còn nhiều vấn đề
cần phải tiếp tục nghiên cứu và làm sáng tỏ.
1.1.5.2. Sự liên quan giữa đáp ứng miễn dịch và bệnh cảnh lâm sàng của
nhiễm HBV
+ Viêm gan ác tính (fulminant hepatitis )
Khi đáp ứng miễn dịch của cơ thể quá mạnh sẽ loại trừ HBV một cách
nhanh chóng, làm cho nồng độ của HBV và HBsAg giảm thấp, đáp ứng tạo
Aanti - HBs xảy ra rất sớm và nhanh. Đồng thời cũng gây tổn thương nặng nề
cho các tế bào gan và có thể đưa đến bệnh cảnh suy gan nặng bùng phát, đe
dọa tử vong. Nhưng nếu những bệnh nhân này may mắn sống sót hoặc được
can thiệp ghép gan kịp thời thì sẽ không bao giờ chuyển sang viêm gan B mạn
tính và bệnh nhân sẽ được miễn dịch bảo vệ lâu dài [8], [14], [462].
+ Viêm gan cấp diễn tiến thuận lợi đến khỏi bệnh
Khi đáp ứng miễn dịch đủ mạnh và thích hợp đồng thời lượng HBV
trong cơ thể không nhiều quá thì HBV sẽ được loại trừ nhưng gan chỉ bị tổn
thương vừa phải và hồi phục dần sau đó. Bệnh nhân cũng thu được miễn dịch
bảo vệ lâu dài sau khi khỏi bệnh.
+ Viêm gan mạn tính
Xảy ra khi đáp ứng miễn dịch không đủ sức khống chế sự nhân lên của
HBV hoặc do HBV đã thích nghi nhờ vào hiện tượng đột biến để trốn tránh
được các phản ứng miễn dịch của cơ thể.
Viêm gan mạn tính hoạt động thường diễn tiến qua 3 giai đoạn kế tiếp
nhau và có thời gian thay đổi:
23
-

• Giai đoạn dung nạp miễn dịch (immuno - tolerance)
Tạo điều kiện cho HBV được nhân lên rất nhiều nhưng các tổn
thương tế bào gan lại rất ít. Trong giai đoạn này đáp ứng miễn dịch của
CTL (Cytotoxic T Lympho) bị suy giảm, có thể do giảm hoạt động của
lympho bào TCD4+, do giảm sự biểu thị kháng nguyên của

hòa hợp tổ
chức

MHC (Major Histocapatibility Complex) lớp I trên bề mặt tế bào
gan bị nhiễm, hoặc do giảm khả năng nhận diện kháng nguyên vì bị các
anti - HBc cản trở.
• Giai đoạn thanh thải miễn dịch (clearance)
Biểu hiện bằng những đợt bùng phát của viêm gan và xuất hiện các tổn
thương viêm gan mạn hoạt động do hoạt tính của CTL và lympho TCD4+
được khôi phục để ức chế sự nhân lên của HBV và làm xuất hiện sự chuyển
đảo huyết thanh từ anti - HBe (-) sang (+).
• Giai đoạn hòa nhập (intergration)
Khi HBV hòa nhập chất liệu di truyền vào DNA của tế bào gan, lúc đó
HBsAg vẫn được sản xuất mặc dù HBV không còn hoạt động nhân lên. Trong
giai đoạn này, tổn thương của viêm gan hoạt động rất hạn chế, enzyme ALT
và AST không tăng tuy nhiên trên mô học có thể đã xuất hiện xơ gan.
+ Người lành mang HBsAg không triệu chứng (healthy carriers)
Đây là một tình trạng khá đặc biệt, trong đó vật chủngười mang HBsAg
HBV mạn tính nhưng không có các biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng và
không có các tổn thương gan tiến triển, enzyme ALT và AST hoàn toàn bình
thường. Cơ chế của hiện tượng này hiện nay chưa thật rõ ràng. Tuy nhiên,
người ta thấy rằng Ssự nhân lên của virus thường rất thấp biểu hiện bằng nồng
độ HBV - DNA nhỏ hơn 2000 IU/ml, HBeAg (-), anti - HBe (+). Tình trạng
này có thể được giải thích là do có sự dung nạp tương đối về miễn dịch giữa

24
-
vật cơ thể vật chủ đối với HBV. Miễn dịch của vật chủ không đủ sức để loại
trừ HBV nhưng lại có khả năng ức chế sự nhân lên và sự biểu hiện gen của
HBV, cho nên các CTL và hệ thống miễn dịch của vật chủ không nhận diện
và không phá hủy các tế bào gan bị nhiễm. Hiện tượng dung nạp miễn dịch
này có thể bị phá vỡ khi vật chủ bị giảm sức đề kháng của cơ thể, bị đồng
nhiễm với các virus hướng gan khác, được sử dụng corticoide hoặc được điều
trị bằng interferon Một người mang HBV không triệu chứng có thể tiến
triển sang viêm gan mạn tính, xơ gan hoặc ung thư gan nguyên phát trong một
thời gian tiến triển nhất định nào đó [4], [23], [762].
1.2. Sự phân bố và ảnh hưởng của kiểu gen HBV
1.2.1. Kiểu gen của HBV
Từ năm 1988 Okamoto và CS khi phân tích 18 trình tự bộ gen của HBV
đã phát hiện ra các chủng HBV có bộ gen khác nhau trên các bệnh nhân
nghiên cứu chứ không phải như trước đây chúng ta vẫn nhận định [671]. Các
tác giả đã qui ước gọi kiểu gen A là kiểu gen cổ điển và các kiểu gen khác còn
lại có hơn 8% nucleotide (Nu.) khác so với kiểu gen A. Như vậy, kiểu gen B
sẽ có hơn 8% Nu. khác biệt so với kiểu gen A; kiểu gen C có hơn 8% Nu.
khác so với kiểu gen A và B và tương tự như vậy cho đến hiện nay người ta
đã phát hiện được 8 kiểu gen của HBV khác nhau và được ký hiệu từ A đến H
[22], [684], [7983]. Như vậy, khi các bệnh nhân được phát hiện có HBsAg (+)
có nghĩa là họ đều nhiễm cùng một kiểu gen HBV, hoặc có thể nhiễm nhiều
kiểu gen HBV khác nhau. Từ đó đã gợi mở cho những nhà nghiên cứu hướng
tới một trong những cách giải thích mới cho sự khác biệt về diễn biến lâm
sàng bệnh lý gan, hiệu quả điều trị và đáp ứng với thuốc kháng virus cũng
như hậu quả tác động mạn tính của chúng trên các bệnh nhân khác nhau.
25