LÊN MEN ETHANOL TRONG HỆ THỐNG IMMOBILIZED CELL REACTOR (ICR) BẰNG SACCHAROMYCES CEREVIASIAE

Chương 1:
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngày nay, với nhu cầu phát triển của xã hội ngày càng cao. Đòi hỏi sự đáp ứng vật
chất nhu cầu phải được đầy đủ… để có những đáp ứng vật chất này thì đòi hỏi cần có
nguồn năng lượng để sản xuất. Trong khi đó, nguồn nhiên liệu hóa thạch ngày càng cạn
kiệt không thể tái sinh… Do vậy, chúng ta phải tìm những nguồn năng lượng khác để
thay thế phục vụ cho sản xuất và nhu cầu đời sống của xã hội. Để giảm bớt nguồn nhiên
liệu từ hóa thạch, chúng ta phải sử dụng nguồn năng lượng khác có thể tái sinh, tiện lợi và
an toàn (Chum và Overend,2001).
Các nguồn năng lượng thì rất nhiều như năng lượng gió, năng lượng mặt trời, năng
lượng thủy điện….trong mỗi lĩnh vực thì có những nghiên cứu và thành công nhất định cơ
bản. Với yêu cầu trong môn học thì ta chú ý đến lĩnh vực tạo nguồn nhiên liệu để cung
cấp năng lượng bằng con đường sinh học. Mà trong đó vi sinh vật sản xuất ethanol được
chú ý và được xem như là nguồn nhiên liệu cho tương lai khi mà nguồn nhiên liệu hóa
thạch ngày càng cạn kiệt. Vài vi sinh vật Clostridium sp….mà sự hiểu biết tốt nhất là về
nấm men sản xuất ethanol. Saccharomyces cerevisiae và Zymomonas mobilis được chú ý
để cho sản xuất ethanol (Flickinger và drew, 1999: Gunasekaran và Raj, 2001).
Trong con đường tạo năng lượng bằng con đường sinh học chủ yếu là quá trình lên men,
lên men có thể liên tục, bán liên tục và theo mẻ. Hiện nay, ta chú ý nguồn năng lượng
ethanol là chủ yếu.
Quá trình lên men theo mẻ của S cerevisiae có những ảnh hưởng bởi những thông
số khác nhau về tỷ lệ sinh trưởng hay có sự ức chế của sản phẩm hoặc là ức chế của cơ
chất. Quá trình lên men của S. cerevisiae có những điều kiện tối ưu riêng.
Từ những yều cầu trên chúng ta cần có những đề tài về nghiên cứu sản xuất
ethanol sao cho có năng suất cao và hiệu quả nhất.
Chương 2:
1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Biofuel
Nhiên liệu sinh học (còn được gọi là nhiên liệu từ nông nghiệp – agrofuel) theo
định nghĩa rộng là những nhiên liệu rắn, lỏng hay khí được chuyển hóa từ sinh khối. Tuy

nhiên, phần này chỉ đề cầp chính đến nhiên liệu sinh học dạng lỏng được sản xuất từ sinh
khối.
Nói chung, nhiên liệu sinh học mang lại những lợi ích sau: Giảm khí thải nhà kính,
giảm gánh nặng lên nhiên liệu hóa thạch, tăng sự an toàn về năng lượng quốc gia, góp
phần phát triển nông thôn và là một nguồn năng lượng bền vững trong tương lai. Ngược
lại, nhiên liệu sinh học cũng có một số hạn chế: nguồn nguyên liệu phải được tái tạo
nhanh, công nghệ sản xuất phải được thiết kế và tiến hành sao cho cung cấp lượng nhiên
liệu lớn nhất với giá thấp nhất và mang lại lợi ích về môi trường nhất. Nhiên liệu sinh học
và những dạng nhiên liệu tái tạo khác nhắm đến tính chất trung tính về carbon. Điều này
có nghĩa là carbon được thải ra trong quá trình đốt cháy nhiên liệu để cung cấp năng
lượng vận chuyển hay sinh điện năng được tái hấp thụ và cân bằng với lượng carbon hấp
thụ bởi cây cối. Những cây này sau đó lại được thu hoạch để tiếp tục sản xuất nhiên liệu.
Những nhiên liệu trung tính về carbon không gây ra sự tăng carbon trong khí quyển, vì
thế không góp phần vào hiệu ứng trái đất nóng lên. Sau đây là một số các loại nhiên liệu
sinh học thế hệ đầu tiên theo phân loại của tự điển bách khoa toàn thư trực tuyến
Wikipedia.org:
 Dầu thực vật: Dầu thực vật có thể dùng để làm nhiên liệu sử dụng cho rất nhiều
những loại động cơ diesel đời cũ, và chỉ ở điều kiện khí hậu ấm áp. Trong đa số
trường hợp, dầu thực vật được sử dụng để sản xuất biodiesel.
 Biodiesel: Được sản xuất từ dầu hoặc chất béo qua quá trình tranesterification và là
một chất lỏng giống như diesel từ dầu mỏ.
 Bioalcohols: Là những rượu được sản xuất từ quá trình lên men sinh học.
 Bioalcohols phổ biến là ethanol, rồi đến propanol và butanol.
 Biogas: Biogas được sinh ra từ quá trình tiêu hủy kỵ khí các chất hữu cơ bởi các vi
sinh vật kỵ khí. Sản phẩm phụ dạng rắn từ quá trình này có thể được sử dụng làm
2
nhiên liệu hoặc phân bón. Biogas chứa chủ yếu là methane. Nhiên liệu sinh học
dạng rắn: Ví dụ như: gỗ, than hoặc phân khô.
Cũng theo tự điển Wikipedia.org, nhiên liệu sinh học thế hệ thứ 2 bao gồm:
 BioHydrogen: Là khí Hydro được sản xuất từ nguồn nguyên liệu sinh khối.

BioHydrogen được dùng trong pin nhiên liệu (fuel cell).
 DMF: Được sản xuất DMF từ fructose và glucose sử dụng công nghệ sinh khối-
nhiên liệu lỏng có xúc tác.
 Bio-DME: Là DME được sản xuất từ biomethanol qua quá trình dehydration có
xúc tác, được sử dụng trong động cơ khí nén.
 Biomethanol: Methanol được sản xuất từ sinh khối, có thể được pha vào dầu đến
10-20% mà không làm thay đổi tính chất cơ bản của dầu.
Để đảm bảo an ninh năng lượng bảo vệ môi trường phát triển bền vững, nhiều
quốc gia và các tổ chức quốc tế trong vài thập kỉ qua đã tập trung nghiên cứu sử dụng
nhiên liệu sinh học thay thế một phần nhiên liệu hóa thạch, tiến tới xây dựng ngành
“nhiên liệu sạch” ở quốc gia mình. Các nước đã có thành công nghiên cứu và sử dụng
nhiên liệu sinh học là Brazil, Mỹ, Canada, Mexico, Châu Âu có Anh, Pháp, Đức, Tây Ban
Nha, Bỉ, Áo…Châu Á có Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Nhật. Sở dĩ nhiều nước đẩy
nhanh chương trình nghiên cứu và sử dụng nhiên liệu sinh học vì đã cam kết thực hiện
nghị định Kyoto về cắt giảm khí nhà kính và để đảm bảo an ninh năng lượng khi nguồn
dầu mỏ trở nên đắt đỏ và sẽ cạn dần cuối thế kỷ này.
2.2. Ethanol nhiên liệu
2.2.1. Lịch sử ethanol nhiên liệu
Nguyên mẫu đầu tiên của động cơ đốt trong được đưa ra bởi Samuel Morey. USA.
1826. Điều này được xem là sự bắt đầu của động cơ gasoline nhưng thực tế ông sử dụng
ethanol để cấp nguồn năng lượng cho động cơ. Năm 1908, Henry Ford xây dựng mô hình
nổi tiếng về xe ô tô chạy bằng ethanol. Cuối cùng, công nghiệp dầu mỏ “chiến thắng”
trong sự cạnh tranh với ethanol. Sự thúc đẩy “thương mại hóa” ethanol trong giao thông
vận tải phát triển trong suốt thập niên 1970. Cuộc khủng hoảng dầu mỏ vào năm 1973 và
cuộc cách mạng của người Iran vào năm 1978 làm cho giá của dầu gia tăng một cách
nhanh chóng, ảnh hưởng lớn đến vấn đề an ninh năng lượng quốc gia. Ethanol nhiên liệu
3
trở nên có giá trị. Tại thời điểm này, cơ quan bảo vệ môi trường (EPA) đã tìm kiếm một
chất thay thế cho chì trong gasoline để gia tăng chỉ số octane. Ethanol sớm thiết lập một
chỗ đứng vững mạnh trong việc gia tăng chỉ số octane. Một động cơ khác thúc đẩy công

nghệ sản xuất ethanol ở Mỹ trong suốt những năm 80, đó là khi giá bắp hạ thấp. Các nhà
lập pháp Mỹ xem ethanol từ bắp là một phương tiện để ổn định thu nhập của nông
nghiệp.
2.2.2. Ứng dụng của ethanol nhiên liệu
Gasohol còn gọi là xăng sinh học được chế tạo từ hỗn hợp ethanol khan 99,5% pha
xăng tỷ lệ 5, 10, 20 hoặc 40% ethanol khan, với hỗn hợp ethanol trong gasohol khoảng
10-20% thì không cần cải tạo động cơ. Khi xem xét ứng dụng hiện nay của bioethanol,
hiển nhiên cần bắt đầu từ Brazil. Brazil đã thành công trong việc sản xuất bioethanol theo
quy mô công nghiệp từ những năm 1970 khi nước này phụ thuộc nặng nề vào dầu nhập
khẩu. Lệnh cấm vận dầu mỏ của Trung Đông đã bắt buộc Brazil phải tìm kiếm những
những nguồn nhiên liệu vững bền hơn cho nhu cầu năng lượng của đất nước. Tuy rằng có
những vấn đề nảy sinh, nhưng chương trình này của Brazil được xem như một mô hình
thành công trong việc phát triển bền vững. Ngày nay, toàn bộ xe hơi ở Brazil sử dụng
xăng có pha ít nhất 25% ethanol, và 60% số xe có khả năng “linh động về nhiên liệu” (có
thể sử dụng 100% ethanol làm nhiên liệu).
Brazil sản xuất bioethanol hầu như chỉ từ cây mía. Trong mô hình này, mỗi tấn mía
cho năng suất 72 lít ethanol. Loại ethanol này có thể được tinh lọc thêm để pha vào xăng,
hoặc dùng làm ethanol nhiên liệu tinh. Rõ ràng con số này cho thấy có rất nhiều thành
phần không được sử dụng trong quá trình chuyển hóa biomass thành ethanol. Hầu hết
những thành phần này là hemicellulose và cellulose. Nước Mỹ đang bám theo Brazil và
đầu tư mạnh vào sản xuất nhiên liệu sinh học. Hiện tại Mỹ đang sử dụng toàn bộ xăng có
pha 10% ethanol, với những cải tiến nhằm tăng tỉ số này. Đa phần mọi phương tiện bán ở
Mỹ đều phải có động cơ linh hoạt về nhiên liệu. Liên minh Châu Âu cũng đã tiến đến việc
khuyến khích năng lượng tái sinh cho tương lai với những đạo luật về điều khoản sử dụng
phương tiện giao thông tối thiểu cho các nước thành viên. Trong tương lai, Colombia bắt
buộc những thành phố có dân số trên 500.000 dân phải bán xăng có pha 10% ethanol. Ở
Venezuela, công ty dầu quốc gia đang hỗ trợ dự án xây dựng 15 nhà máy chế cồn từ mía
4
trong 5 năm tới khi chính phủ sắp ban hành đạo luật bắt buộc sử dụng xăng E10 (pha 10%
ethanol). Chính phủ Canada nhắm đến việc 45% xăng trong cả nước có pha 10% ethanol

vào năm 2010. Ở Đông Nam Á, Thái Lan đã ban hành luật cho việc sử dụng xăng pha
10% ethanol bắt đầu từ 2007. Ở Ấn Độ, một chương trình bioethanol đã kêu gọi người
dân sử dụng xăng E5 trên cả nước, tiến tới việc sử dụng xăng E10 và E20.
2.3. Tình hình ethanol nhiên liệu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công nghiệp sản xuất ethanol đã được hình thành từ rất lâu. Phần
đông ethanol sản xuất từ rỉ đường mía, dùng làm ethanol cho thực phẩm và công nghiệp.
Tổng cộng năng suất là 25 triệu Lit/năm, trong đó có 3 nhà máy sản xuất 15000 – 30000
Lit/ngày là nhà máy đường Lam Sơn, nhà máy đường Hiệp Hoà và nhà máy rượu Bình
Tây và hàng trăm cơ sở sản xuất 3000 – 5000 Lit/ngày. Cho đến thời điểm này, ethanol
nhiên liệu vẫn chưa được tiêu thụ trên thị trường. Tuy nhiên, có rất nhiều nghiên cứu
được thực hiện trong lĩnh vực này. Điển hình là sự hợp tác giữa Công ty rượu Bình Tây,
Saigon Petro và Công ty Nguyễn Chí từ năm 2005. Các doanh nghiệp này đã triễn khai
5 đề tài: gasohol từ cồn công nghiệp (cồn 96%), gasohol từ cồn khan (cồn 99,5%), đầu tư
nhà máy sản xuất gasohol, đầu tư nhà máy sản xuất cồn công nghiệp, đầu tư nhà máy sản
xuất cồn khan. Tất cả nhằm mục đích đưa xăng sinh học với tỉ lệ 10-12% vào thị trường
năng lượng.
2.4. Triển vọng ethanol tương lai
Cần có những nghiên cứu để tăng hiệu quả của bioethanol cũng như của quá trình
chuyển hóa biomass thành nhiên liệu bền vững để thay thế xăng dầu. Điều này có lien
quan đến việc giảm chi phí chuyển hóa, tăng năng suất và tăng sự đa dạng của các nguồn
nguyên liệu có thể sử dụng. Hướng đi cho những nghiên cứu để phát triển và cải tiến
bioethanol là tìm những phương pháp chuyển hóa hemicellulose thành đường để lên men.
Một khía cạnh rất thú vị, và cũng được nghiên cứu trong đề tài này, là quá trình đường
hóa và lên men đồng thời (SSF). Những phương pháp hiện nay có thể đạt được hiệu suất
50 – 72% ethanol cho mỗi gam glucose, giới hạn bởi khả năng chịu ảnh hưởng của nấm
men đối với ethanol. Điều này dẫn đến hướng khả thi nghiên cứu những chủng nấm men
có khả năng chịu ức chế tốt hơn. Ở khía cạnh này, công nghệ sinh học và vi sinh sẽ đóng
vai trò rất quan trọng trong công nghệ gene, không chỉ ở việc phát triển nấm men, mà còn
5
ở việc phát triển những giống vi sinh vật khác có khả năng chuyển hóa cellulose và lignin

tạo thành đường và lên men ethanol.
2.5. Cố định tế bào
2.5.1. Các đặt tính của sự cố định
Sự cố định tế bào sinh vật được xác định như là quá trình gắn tế bào sinh vật vào
pha riêng biệt tách khỏi pha tự do của dung dịch nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với
các phân tử cơ chất có mặt trong pha tự do nói trên. Pha chứa tế bào thông thường không
tan trong nước và là polymer cao phân tử có tính ưa nước hoặc hệ thống của chúng.
Tế bào vi sinh vật cố định được sử dụng trong các phản ứng enzyme khác nhau,
chúng có thể thực hiện từng phản ứng xúc tác riêng biệt hoặc hệ thống các phản ứng
enzyme, bao gồm các phản ứng liên kết tương hỗ với nhau, trong đó một phản ứng này
đảm bảo cho diễn biến của phản ứng khác. Các tế bào sinh vật cố định có phổ hoạt động
rộng hơn và các quá trình do tế bào sinh vật cố định thực hiện thông thường rẻ hơn so với
quá trình tương ứng do enzyme cố định thực hiện.
Phương pháp cố định tế bào phải đơn giản, độ lặp lại lớn, không gây biến tính,
phải cho phép dễ dàng kiểm soát được số lượng tế bào cố định và các tế bào không bị rửa
trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng hoặc bảo quản.
Sự cố định tế bào, enzym hay chất xúc tác đã được nghiên cứu rộng trong suốt 20
năm qua do sự tiềm ẩn ngày càng tăng trong các lĩnh vực rộng lớn, bao gồm cả y học,
thực phẩm, nông hoá học, môi trường, lưu trữ tế bào, các xúc tác phản ứng hoá học. Sự
cần thiết là tìm một chất nền có khả năng chịu được áp lực cao, môi trường nuôi cấy hoặc
những ức chế môi trường khác thường không tương thích với khả năng của tế bào. Thí dụ,
hầu hết những phương pháp cố định tế bào dựa trên liên kết ngang các chất nền và do đó
liên quan đến các gốc hoặc các dung môi hữu cơ, là bất lợi cho các tế bào và do đó không
thích hợp cho các ứng dụng y học hoặc thực phẩm. Mặc khác, dù chất đa điện ly như gel
alginete Ca là không độc cho tế bào và do đó phù hợp cho việc cố định tế bào, chúng có
sẵn chất ổn định là hợp chất Ca
2+
hay các cation hoá trị 1 do đó làm cản trở trong việc ứng
dụng. Thêm vào đó, khi nuôi cấy vi khuẩn ở mật độ cao đòi hỏi các tế bào được cố định
trong các hạt với đường kính hạt nhỏ hơn 300µm để duy trì nồng độ oxy đi qua khối gel.

6
Công nghệ tế bào cố định đã được áp dụng rộng rãi trong một loạt các nghiên cứu
ứng dụng và công nghiệp. Dùng vi khuẩn acid lactic đã được cố định khi bắt đầu nuôi cấy
trong công nghiệp chăn nuôi bò sữa là một trong những ứng dụng tiềm năng. Nhiều kỹ
thuật cố định đã mô tả bẫy tế bào trong polymer tổng hợp và tự nhiên là một trong những
phương pháp là phổ biến nhất vì dễ dàng và đơn giản hơn, chi phí xây dựng thấp và các
điều kiện duy trì của tế bào mang tính khả thi cao… Một chất liệu tạo thành gel phổ biến
là alginate mà là một polysaccharide dị hình tuyến tính với lượng dư acid D-mannuronic
và L-guluronic. Na alginate ion hoá liên kết ngang với các cation đa hoá trị (tiêu biểu
Ca
2+
) để tạo ra gel.
Phương pháp phổ biến nhất cho việc cố định các tế bào toàn là bẫy gel, ví dụ:
Ca-alginate gel hoặc carrageenan.
Cố định toàn bộ các tế bào vi sinh vật đã được sử dụng rộng rãi để đạt sản lượng
axit lactic cao. Ca-alginate hay carrageenan là chất mang điển hình được dùng cho việc
bẫy các tế bào. Tuy nhiên, bẫy đơn giản có giới hạn liên quan đến quy trình phát triển các
tế bào và nơi mà nó ức chế sản phẩm. Vi sinh vật thay thế có thể phá vỡ chất mang gel và
hạn chế sự khuếch tán bên trong và bên ngoài lớp gel và gây ra sự tích luỹ sản phẩm tiếp
giáp với các tế bào. Sự bất lợi của việc hao hụt hay giảm nồng độ trong suốt quá trình lên
men lactic là do sự thay thế của ion Ca
2+
bằng ion lactate từ các hạt alginate.
Trong số những phương pháp cố định, bẫy tế bào trong polymer sinh học thường
dùng κ-carrageenan hay Ca-alginate như chất mang. Lợi thế chính của cố định gel là khả
năng tương thích; mặc dù đưa vào tỷ lệ lớn là khó khăn, các hạt thường thấm qua các tế
bào, những hạn chế khối lượng chuyển giao thường gặp phải và khối lượng chiếm đóng
của lò phản ứng hạt nói chung là đáng kể. Cuối cùng gel alginate chứa vi khuẩn acid
lactic có xu hướng bị hoá lỏng bởi acid lactic.
Có một số báo cáo về quá trình lên men axit lactic sử dụng vi khuẩn cố định.

Sự cố định làm vi khuẩn có thể duy trì các tế bào ở trạng thái ổn định và có sức sống và
cung ứng cho quá trình lên men liên tục. Trong tự nhiên các vi sinh vật đó ở trạng thái cố
định sẽ được thử pH khác nhau, nồng độ sản phẩm trong môi trường so sánh trực tiếp với
lượng dung dịch hoà tan điều này ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của vi khuẩn và do đó
7
ảnh hưởng toàn bộ quá trình xử lý. Vì vậy, thông tin về sinh lý của vi sinh vật trong việc
thay đổi môi trường là điều kiện tiên quyết cần thiết để vận hành quá trình lên men trong
điều kiện tối ưu.
Cố định thường được thực hiện bằng cách sử dụng một gel phân tử trùng hợp có
khả năng hút nước cao như alginate, agarose… Trong trường hợp đó, các tế bào được cố
định bẫy trong gel thích hợp qua một quá trình tạo giọt. So với lên men truyền thống thì
vi khuẩn biến đổi khi sử dụng sự cố định tế bào, năng suất thu được trong lần sau thì cao
hơn đáng kể, rõ ràng một phần do mật độ tế bào cao và các lỗ hổng cố định đem lại hay
có sự thay đổi di truyền. Tuy nhiên, một vài thông số quan trọng như chi phí của sự cố
định, các giới hạn chuyển đổi khối lượng, tính có thể ứng dụng được đến sản phẩm cuối
đặt trưng… được xem xét một cách cẩn thận trước khi chọn bất kỳ phương pháp cụ thể
nào.
Những hệ thống cố định yêu cầu sự lựa chọn một phương pháp cố định mà phương
pháp đó sẽ giới hạn lỗ hở tế bào. Trong số những phương pháp cố định khác, có sự hỗ trợ
chất rắn (polyarylamide, gốm, non-woven các sợi vải hay các hạt thuỷ tinh lỗ lớn) hay
bẫy gel (trong alginate hoặc carrageenan) đã được dùng. Mặt hạn chế chính của sự cố
định gel là độ bền cơ học của các hạt thấp, điều đó giới hạn thời gian làm việc. Các ion
hoá trị 3 đã được đưa vào và được dùng như các tác nhân gắn kết với mục đích cải tiến độ
bền cơ học của các hạt. Mặt khác, nồng độ gel cao cũng cải thiện được sự ổn định hạt
ngay cả khi xuất hiện những hạn chế về khuếch tán.
Việc dùng phương pháp cố định toàn bộ các tế bào vi khuẩn hoặc loại bỏ các bào
quan thường tẻ nhạt, tốn thời gian và đắt tiền cho các bước bao gồm sự phân lập và tinh
sạch của các enzym nội bào. Nó cũng có xu hướng tăng cường sự ổn định của các enzym
bằng cách giữ lại xung quanh nó xúc tác tự nhiên trong suốt quá trình cố định và vận hành
liên tục. Dễ dàng chuyển quá trình xử lý từng đợt thành kiểu liên tục và duy trì mật độ tế

bào cao mà không dùng các điều kiện wash-out ngay cả khi ở tỉ lệ pha loãng rất cao, là
một vài trong nhiều lợi thế của các hệ thống tế bào được cố định. Metabolically tích cực
cố định tế bào là ưu tiên đặc biệt, nơi mà các co-factor cần thiết cho các phản ứng xúc tác.
Khi cơ cấu co-factor phục hồi thì chức năng của tế bào đầy đủ, nguồn cung cấp từ bên
ngoài không có hiệu quả.
8
Sử dụng kỹ thuật cố định tế bào để cải tiến quá trình lên men acid lacic đã được
thử qua vài nghiên cứu. Lactobacillus helveticus, Streptococcus salivarius, L.
delbrueckii subsp. Bulgaricus, L. casei, Rhizopus oryzae, và Pedioccus halophilus là
những vi sinh vật quan trọng được dùng cho việc sản sinh ra acid lactic bằng cách cố định
tế bào. Giống như vi khuẩn lên men khác, bẫy trong Ca-alginate hay κ-carrageenan là
phương pháp cố định được cho phép rộng rãi. Khi nhiều nhà nghiên cứu báo cáo sự hao
hụt và giảm cường độ cơ học của các hạt alginate trong suốt quá trình lên men acid lactic.
Một vài nghiên cứu đã thực hiện việc sử dụng hỗn hợp gel trên cho các vi sinh vật sản
sinh acid lactic khác nhau. Khuôn hỗn hợp gel κ-carrageenan locust bean gum- cho thấy
sự ổn định đáng kể trong 3 tháng trong bồn phản ứng dạng khuyấy lên men liên tục.
Trong một nghiên cứu khác đã so sánh thực hiện cố định tế bào L.casei bằng alginate
trong bồn phản ứng dạng khuấy và bồn phản ứng packed-bed. Sử dụng glucose năng suất
đạt 1.6g/l/h trong bồn phản ứng dạng khuấy. Một phương pháp khác chiết acid lactic lên
men cố định tế bào đã được đưa ra, vì sản phẩm cố định có thể loại trừ bằng cách dùng
nhựa hấp phụ acid lactic, phương pháp này tạo năng suất cao hơn khi lên men liên tục
sinh học phân tử.
2.5.2. Ích lợi của sự cố định
Quá trình cố định dường như chủ yếu ích lợi về mặt kinh tế như:
 Các quá trình liên tục và dễ kiểm soát
 Các sản phẩm được tách ra một cách dễ dàng
 Vấn đề thải và xử lý vật liệu được giảm thiểu
 Cung cấp sản phẩm tinh khiết hơn, ít sản phẩm ức chế
 Sự ổn định pH và nhiệt tốt hơn
 Vận hành liên tục

 Tính linh hoạt cao hơn trong thiết kế bồn phản ứng
Bên cạnh những lợi ích trên trong công nghiệp sản xuất còn có những hạn chế sau:
 Còn mang dáng dấp của truyền thống
 Cần đầu tư vào thiết bị mới phục vụ cho việc nuôi cấy
9
 Tính chất, chi phí hỗ trợ cố định và quá trình cố định. (bao gồm cả thiệt hại của
hoạt động.)
Hiệu suất của hệ thống
2.5.3. Các loại chất mang dùng cố định vi sinh vật
Chất mang dùng cố định tế bào chia làm hai loại: chất mang hữu cơ và chất mang
vô cơ.
2.5.3.1. Phân loại chất mang
Chất mang hữu cơ: gồm chất mang hữu cơ tự nhiên và tổng hợp
Chất mang hữu cơ tự nhiên
Chất mang là polysaccharide: là nhóm chất mang đang được sử dụng rộng rãi
hiện nay, bao gồm cellulose, agarose, alginate, carrageenan, chitin, chitosan và các dẫn
xuất của chúng.
Cellulose
Cellulose là thành phần cấu tạo chủ yếu của các vật liệu như rơm, bã mía, dăm
bào, trấu, mạt cưa. Đây là nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm.
Cellulose là một trong các hợp chất tự nhiên khá bền vững, không tan trong nước
nhưng lại có cấu trúc không đồng nhất, thường được sử dụng dưới dạng sợi hay vi hạt.
Ngoài ra người ta còn dùng các dẫn xuất của cellulose như CM- cellulose, DEAE-
cellulose.
Carrageenan
Được lấy từ tảo biển đỏ. Nó sẽ bị chảy ra khi đốt nóng và đông lại khi làm lạnh.
Vật liệu này tạo gel trong dung dịch CaCl
2
để nhốt tế bào. Tuy nhiên vật liệu này
có nhược điểm là gel không ổn định trong môi trường có phosphate

Chitin và dẫn xuất của chitin (chitosan)
Chitin là polymer rất phổ biến trong tự nhiên, có cấu tạo tương tự cellulose. Chitin
và chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo mạng, tạo hạt, có khả năng hấp phụ tốt, tính chất cơ
10
lý bền vững, dùng để nhốt tế bào trong khuôn gel khi xử lý với glutaraldehyde hay
sodiumtripolyphosphate… Tuy nhiên chúng có nhược điểm là độ trương kém, diện tích
bề mặt tiếp xúc nhỏ. Để khăc phục nhược điểm này, người ta ghép các copolymer với các
monomer ưa nước như acrylamide, acrylic acid, hydroxyethylacrylate nhằm cải thiện
những nhược điểm trên.
Chất mang là protein: các chất thường dùng là collagen, gelatin, keratin… Vật
liệu này sử dụng tạo khuôn gel nhốt tế bào với tác nhân đóng mạch là glutaraldehyde.
Nhưng nhóm chất mang này thường kém bền, dễ nhiễm khuẩn.
Chất mang hữu cơ tổng hợp
Có các loại polymer tổng hợp được sử dụng như polyacrylamide, polyester,
polyvinylacetate, polyacrylic… Ưu điểm của loại này là bền, tính chất cơ lý tốt, hoàn toàn
trơ với sự tấn công của vi sinh vật, độ trương tốt và đặc biệt có thể điều chỉnh được kích
thước chất mang để nâng cao hiệu quả quá trình cố định. Bên cạnh đó, còn có những
nhược điểm như giá thành vật liệu cao, sự tương hợp sinh học kém, và vì là tổng hợp hữu
cơ nên khó phân hủy trong tự nhiên gây ô nhiễm môi trường, nhất là trong công nghệ sản
xuất polymer.
Chất mang vô cơ
Chất mang vô cơ tự nhiên: than hoạt tính, cát, zeolit, silicat.
Chất mang vô cơ tổng hợp: silicat, silicagel, Al
2
O
3
, TiO
2
, ceramic, sợi bông thủy
tinh.

Các loại chất mang này có cấu trúc lỗ xốp và có thể điều chỉnh đuợc, khả năng hấp
phụ tốt. Nhưng một số chất mang vô cơ như thủy tinh xốp, silicagel, silochrom đều phải
trải qua giai đoạn xử lý bề mặt trước khi đưa vào cố định tế bào để đảm bảo độ bền, độ
chọn lọc và độ hấp thu tốt.
Mỗi loại chất mang đều có ưu nhược điểm nhất định. Vì vậy, tùy thuộc vào
phương pháp cố định mà ta sẽ chọn loại chất mang phù hợp để cho hiệu quả tốt nhất.
11
Khoa học kỹ thuật ngày càng phát triển tạo ra nhiều loại vật liệu mới làm chất mang thích
hợp trong việc cố định tế bào vi sinh vật cũng như chất xúc tác sinh học khác.
2.5.3.2. Bacteria cellulose
a. Cấu trúc
Cellulose là polymer sinh học dồi dào nhất trên trái đất, là thành phần chính của
sinh khối thực vật cũng như đại diện cho các polymer ngoại bào vi sinh vật.
Cellulose vi khuẩn (BC) là sản phẩm của trao đổi chất sơ cấp và chủ yếu tạo màng
bảo vệ, trong khi cellulose thực vật (PC) đóng vai trò cấu trúc.
Cellulose thu được từ vi khuẩn có cấu tạo hóa học giống với cellulose thực vật,
nhưng khác cấu trúc đa phân tử dẫn đến sự khác nhau về thuộc tính và tính chất hóa lý.
Cấu trúc của BC
BC là một chuỗi polymer do các glucopyranose nối với nhau bằng liên kết 1, 4-
glucan
Các nghiên cứu cho thấy BC có cấu trúc hóa học y hệt PC. Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và
thuộc tính của chúng thì khác nhau. Các sợi mới sinh ra của BC kết lại với nhau thành các
sợi sơ cấp, có chiều rộng khoảng 1.5 nm, là những sợi mảnh nhất có nguồn gốc tự nhiên.
Các sợi sơ cấp này kết hợp thành các vi sợi. Các vi sợi nằm trong các bó, cuối cùng các
bó liên kết lại thành các dải. Các dải có chiều dày 3-4 nm, chiều rộng 70-80 nm.
Trong khi kích thước của cellulose vi khuẩn nhỏ rất nhiều so với cellulose thực vật
(khoảng 1/100 lần). Ngoài ra BC còn khác PC về chỉ số kết chặt, mức độ polymer hóa
(thường BC có mức độ polymer hóa từ 2000-6000); có vài trường hợp đạt tới 16000-
20000, trong khi PC là 13000-14000.
Cấu trúc cellulose vi khuẩn thay đổi tùy theo điều kiện nuôi cấy: nuôi cấy tĩnh hay

lắc. Khi nuôi cấy tĩnh, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng màng keo có độ kết lớp chặt
chẽ. Khi nuôi cấy lắc, cellulose vi khuẩn thu được ở dạng huyền phù phân tán tạo thành
dạng hạt nhỏ, hình sao, sợi dài. Bên cạnh điều kiện nuôi cấy thì cấu trúc BC còn phụ
thuộc vào từng dòng vi khuẩn.
12
Hình: so sánh đường kính sợi cellulose vi khuẩn với các sợi tự nhiên và nhân tạo
b. Tính chất
 BC là dạng polymer có độ tinh sạch cao so với các dạng cellulose khác, không
chứa lignin và hemicellulose. BC có thể bị phân hủy hoàn toàn.
 Trọng lượng nhẹ, kích thước ổn định, sức căng và độ bền sinh học cao.
 Khả năng nổi bật của cellulose vi khuẩn là giữ nước tốt: trong điều kiện ngập
nước, nước có thể vận chuyển vào các sợi cellulose.
 Khả năng kết sợi, tạo tinh thể tốt.
 Tính bền cơ tốt, khả năng chịu nhiệt tốt.
 Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tiếp, vì vậy việc sản xuất các sản phẩm
mong muốn không cần qua bước trung gian. Chẳng hạn như sản xuất giấy không
cần qua bước phân hủy, còn vải thì không cần bước se chỉ. Đặc biệt là vi khuẩn có
thể tổng hợp được các loại màng mỏng và sợi cực nhỏ. Trong cấu trúc BC thu
được trong điều kiện nuôi cấy tĩnh có các trục đơn giúp cho cấu trúc lớp màng tạo
nên chặt chẽ hơn.
2.5.4. Các phương pháp cố định vi sinh vật
2.5.4.1. Khái niệm
13
Cố định tế bào có nghĩa là các tế bào về mặt vật lý được giữ lại hay định vị lại
trong một khu vực không gian nhất định sao cho các tế bào đó giữ được tính chất xúc tác
sinh học của chúng và có thể sử dụng lại nhiều lần.
Ngoài ra, cố định tế bào còn được định nghĩa đơn giản hơn, đó là việc gắn tế bào
vào chất mang không hòa tan trong nước. Tế bào sau khi được cố định có thể sử dụng
được nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và ta có thể chủ động ngừng phản ứng theo ý
muốn.

Người ta phân biệt các phương pháp cố định tế bào cơ thể vi sinh vật theo 3 dạng:
hoá học, vật lý và cơ học. Phương pháp hoá học dựa trên sự tạo thành các liên kết hoá trị
giữa các chất mang được hoạt hoá thông qua các nhóm hoạt động của amino acid và các
chất khác có mặt trong vách tế bào với các chất hai chức năng như glutaradehyde. Phương
pháp vật ký bao gồm các quá trình sắp xếp phân đoạn hay hấp thụ. Còn quá trình gắn tế
bào vào các gel, màng sợi… thì được coi là phương pháp cơ học, mặc dầu bản chất của
nó cũng chính là tương tác vật lý và hoá học
2.5.4.2. Phân loại các phương pháp
Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật đóng vai trò rất quan trọng trong nhiều ngành
như các ngành công nghiệp thực phẩm, y học, nông nghiệp, xử lý môi trường… Vì vậy có
rất nhiều phương pháp khác nhau và vật mang khác nhau được sử dụng để cố định tế bào.
Phân loại các phương pháp cố định tế bào dựa trên sơ đồ sau:
14
Tất cả các phương pháp trên đều có cùng mục đích: giữ được mật độ tế bào cao
trong vùng không gian nhất định cũng như trong bình phản ứng sinh học để làm gia tăng
khối lượng sản phẩm.
2.5.4.3. Chuyển hóa vật chất của tế bào cố định
Chất mang có gắn tế bào vi sinh vật được đưa vào bình phản ứng sinh học. Cơ chất
được đưa vào từ đỉnh bình phản ứng, trong bình phản ứng sinh học xảy ra quá trình trao
đổi chất của vi sinh vật và cơ chất tạo sản phẩm. Sản phẩm được lấy ra ở đáy bình là sản
phẩm sạch. Quá trình này được thực hiện liên tục.
So với tế bào tự do, tế bào cố định có những thuận lợi như: mật độ tế bào cao, khối
lượng sản phẩm tăng, rút ngắn thời gian phản ứng, kích thước thiết bị nhỏ gọn, khả năng
tái sử dụng nhiều lần.
Ngoài ra, trong quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi. Ta
có thể sử dụng được nhiều loại cơ chất, quy trình thiết kế đơn giản hơn, chất lượng sản
phẩm đồng đều. Hơn nữa, tế bào cố định được bảo vệ không bị ức chế bởi cơ chất và sản
phẩm cuối.
Với những thuận lợi trên, ta thấy quá trình lên men sử dụng tế bào cố định xảy ra
nhanh hơn so với lên men sử dụng tế bào tự do.

2.5.4.4. Yêu cầu đối với tế bào vi sinh vật cố định
Tế bào vi sinh vật cố định giống như một tác nhân xúc tác bao gồm: sự mất hoạt
tính enzyme trong quá trình cố định tế bào phải ở mức độ thấp nhất, tế bào vi sinh vật cố
định phải có khả năng chiếm thể tích riêng của reactor nhiều nhất nhằm làm tăng năng
suất thể tích.
Ngoài ra, cơ chất và sản phẩm tạo trong quá trình trao đổi chất của tế bào phải có
khả năng khắc phục được hàng rào cản khuếch tán, đó là chất mang và thành tế bào. Tế
bào cố định phải bền về mặt cơ học để có thể dễ dàng khuấy trộn trong bình phản ứng.
Chất xúc tác (tế bào cố định) phải ổn định trong khoảng nhiệt độ hoạt động của
quy trình công nghệ cũng như phải bền đối với hóa chất và pH sử dụng trong quy trình
15
công nghệ. Phải thực hiện được việc tái sinh chất xúc tác dựa vào quá trình trao đổi chất
đặc thù đối với từng cơ thể vi sinh vật
2.5.4.5. Các phương pháp cố định
a. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật lên bề mặt chất mang
Hình: Tế bào vi sinh vật cố định trên bề mặt chất mang.
Phương pháp này dựa trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và chất mang
không tan trong nước thông qua các liên kết như liên kết cộng hóa trị, liên kết ion, hấp
phụ vật lý. Vật liệu làm bằng chất mang có chức năng phù hợp để liên kết được với tế bào
vi sinh vật, có độ bền cơ học tốt, ổn định trạng thái lý hóa tốt, không tạo độc tố, ngoài ra
còn dễ dàng tạo hình dạng phù hợp với loại thiết bị phản ứng.
Sau đây là một vài phương pháp hay được dùng nhiều trong thực tế
Phương pháp liên kết cộng hóa trị
Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên kết cộng
hóa trị giữa bề mặt chất mang đã được hoạt hóa và tế bào vi sinh vật.
Lúc này trên bề mặt tế bào tồn tại một số nhóm chức hoạt động như amino,
cacboxyl, thiol, hydroxyl, unidazole, phenol của protein đều có khả năng tham gia tạo
phản ứng liên kết với chất mang.
Phương pháp hấp phụ
Đây là phương pháp tiêu biểu đầu tiên về sự cố định tế bào. Hai nhà khoa học

Hattori và Furusaka đã báo cáo về việc gắn những tế bào Escherichia coli lên một cột
16
nhựa trao đổi ion. Tiếp sau đó, nhiều loại tế bào vi sinh vật khác đã được cố định bằng
phương pháp hấp phụ trên những giá thể khác như gỗ, đất sét, thủy tinh, chất dẻo…
Phương pháp này tạo nên dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề
mặt chất mang. So với phương pháp liên kết cộng hóa trị, ở phương pháp hấp phụ, tế bào
và chất mang ngoài liên kết cộng hóa trị ra, chúng còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết
khác.
b. Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel
Hình: Tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel
Các loại gel cơ bản
Có nhiều loại cấu trúc gel cơ bản
Ion gel: khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang đa diện tích
và dung dịch đa diện tích trái dấu. Hay nói cách khác ion gel là một loại gel có cấu trúc
mạng lưới được hình thành từ những liên kết ion có khả năng phân hủy sinh học, dễ tìm
nhưng độ bền cơ học và hóa học kém. Loại vật liệu này đòi hỏi phải là chất đa diện tích
như chitosan, alginate.
Covalent gel: là một loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình thành từ
những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng các liên kết cộng hóa trị. Một số chất tạo
covalent gel là polyacrylamide (polymer tổng hợp được hình thành từ monomer
acrylamide) và một số chất vô cơ (gel vô cơ hình thành từ một số oxide như (SiO
2
)
x
,
(TiO
2
)
x
.)

Non-covalent gel: là loại gel mà mạng lưới trong cấu trúc gel cố định tế bào vi
sinh vật được hình thành bằng những liên kết khác không phải là liên kết cộng hóa trị
17
giữa các phân tử polymer, thường là liên kết hydro. Các loại chất mang như agar-agar,
agarose, carrageenan.
Cryogel: là cấu trúc polymer mới, được tạo nên bằng phương pháp lạnh đông các
tiền polymer có phân tử lượng thấp hoặc cao. Dưới điều kiện nhiệt độ thấp, mẫu nguyên
liệu sẽ biến đổi và hình thành cấu trúc mới. Loại chất mang này khắc phục được tính chất
kém bền nhiệt và không bền trong dung dịch nước so với các loại chất mang khác. Việc
cố định tế bào trong cryogel là phương pháp mới nên vật liệu sử dụng chưa nhiều, điển
hình là polyvilyl alcohol.
Tóm lại, các chất dùng tạo gel đòi hỏi phải có khả năng tạo gel tốt, đa dạng phù
hợp với kỹ thuật cố định tế bào.
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc ion-gel
Phương pháp này được sử dụng rộng rãi nhất. Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh
vật và chất mang đa diện tích được nhỏ vào dung dịch đa diện tích trái dấu để thực hiện
phản ứng tạo mạng lưới gel. Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống
mạng lưới vừa được hình thành. Phương pháp này có ưu điểm là lượng tế bào cố định lớn,
khả năng sống của tế bào được duy trì, đặc biệt phương pháp này tiến hành trong điều
kiện phản ứng ôn hòa, đơn giản, rẻ tiền. Tuy nhiên nhược điểm của nó là độ bền hóa học,
cơ học chất mang không cao.
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel
Có 2 cách
- Cách 1
Monomer + tế bào vi sinh vật gel polymer chứa tế bào vi sinh vật
- Cách 2
Polymer + tế bào vi sinh vật gel polymer chứa tế bào vi sinh vật
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel
18
Polymer hóa

Tạo liên kết giữa
các sợi polymer
Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc
covalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ những liên kết
khác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết hydro.
Trong phương pháp này chất mang carrageenan là chất mang hay được sử dụng
nhất, đó là một loại polysaccharide thu từ tảo đỏ, có thể hình thành nhiều loại gel khác
nhau ở nhiệt độ thường.
Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc cryogel
Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông. Ở điều kiện
nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành cấu trúc mới.
Polyvinyl alcohol là loại polymer được sử dụng trong việc tạo gel cryogel có khả
năng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc, lượng tế bào bị rửa trôi
không nhiều sau chu kì lên men và đặc biệt giữ được hoạt tính trong thời gian dài vì
không tiếp xúc với dung môi hữu cơ. Tuy nhiên có hạn chế là các hạt cryogel sau khi đã
cố định tế bào vi sinh vật chỉ thích hợp đưa vào sản xuất liên tục trong điều kiện nhiệt độ
thấp.
c. Cố định tế bào vi sinh vật không mang chất mang
Ở các phương pháp cố định trên, tế bào vi sinh vật được gắn trên bề mặt chất mang
hay nhốt trong lòng chất mang. Ở một số phương pháp khác, tế bào vi sinh vật không có
sự liên kết với chất mang nhưng ta vẫn gọi là tế bào cố định mà ta sẽ tìm hiểu sau này.
Phương pháp liên kết chéo
Là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành một khối tế bào cố
định nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng chất mang.
19
Hình: Tế bào vi sinh vật cố định bằng cách liên kết với nhau.
Phương pháp sử dụng màng chắn membrane
Hình: Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane
Ở dạng membrane, tế bào được cố định thông qua quá trình siêu lọc và vi lọc bằng
màng membrane. Màng membrane được tạo ra là polimer có tính bán thấm với những

kích thước lỗ đủ nhỏ chỉ cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra mà tế bào vẫn bị nhốt trong
đó. Trước khi tạo màng bao tế bào lại, cần phải biết trọng lượng phân tử của tế bào để
quyết định cách tạo lỗ phù hợp trên màng.
2.5.5. Phương pháp cố định Acetobacter aceti lên BC
2.5.5.1. Đặc điểm chung của phương pháp hấp phụ
Phương pháp này tạo nên dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề
mặt chất mang. So với phương pháp liên kết cộng hóa trị, ở phương pháp hấp phụ, tế bào
và chất mang ngoài liên kết cộng hóa trị ra, chúng còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết
khác.
Các liên kết chủ yếu được hình thành trong phương pháp hấp phụ thể hiện các cơ
chế sau:
20
Tạo liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt chất mang: trên bề mặt chất mang
và màng tế bào vi sinh vật hình thành các liên kết hóa học, nhờ các liên kết này mà tế bào
vi sinh vật được gắn vào chất mang.
Sự tương tác ion, bề mặt chất mang và vi sinh vật có mang các ion trái dấu nhau,
nhờ vậy mà tế bào vi sinh vật liên kết với chất mang.
Quá trình thực hiện hấp phụ đơn giản: chất hấp phụ và tế bào vi sinh vật được trộn
lẫn với nhau trong khoảng thời gian cho phép sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác các liên
kết ion, hydrogen và lực Vander Walls.
2.5.5.2. Phương pháp tiến hành
Phương pháp hấp phụ có thể thực hiện theo 3 cách
Phương pháp cổ điển: ngâm chất mang vào dung dịch huyền phù vi sinh vật, vi
sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang
đó.
Phương pháp cổ điển có cải tiến: sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân
bố đều tế bào vi sinh vật và chất mang trong dung dịch để tăng diện tích tiếp xúc giữa
chất mang và vi sinh vật, vì vậy hiệu suất gắn được cải thiện đáng kể.
Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang: phương
pháp này cần có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vi sinh vật

vào chất mang.
2.5.5.3. Ưu nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: Quá trình thực hiện đơn giản, dễ thực hiện, không đòi hỏi phải hoạt hóa
chất mang và các tác nhân phản ứng. Phương pháp này thực hiện được trong điều kiện
bình thường, tế bào vi sinh vật vẫn duy trì được khả năng sống và phát triển của nó. Chi
phí thực hiện thấp và ít gây ảnh hưởng đến hoạt tính tế bào sau khi cố định.
Nhược điểm: Tế bào vi sinh vật dễ bị tách khỏi chất mang khi có tác động cơ học
(cánh khuấy) hay điều kiện môi trường thay đổi (pH, nhiệt độ), vì liên kết giữa tế bào vi
sinh vật và chất mang trong phương pháp hấp phụ thường là những liên kết yếu hay kém
21
bền. Để khắc phục vấn đề này bằng cách cho thêm vào dung dịch tế bào vi sinh vật một
số các chất liên kết như glutaraldehyde làm cầu nối gắn tế bào với chất mang. Ngoài ra,
lượng vi sinh vật cố định lên bề mặt chất mang không cao. Quá trình cố định theo phương
pháp này thực hiện một cách thụ động và khó điều khiển. Vì vậy hiệu suất cố định thường
không cao. Hơn nữa, một số chất mang do mang điện tích nên ảnh hưởng đến việc cố
định tế bào, vì vậy trong giới hạn lựa chọn chất mang, phải lựa chọn chất mang thích hợp
với tế bào cố định mà không gây ảnh hưởng. Vật mang sử dụng trong phương pháp hấp
phụ có thể xảy ra hấp phụ không đặc hiệu một số protein khác hay chất phi protein.
2.5.5.4. Cố định vi khuẩn Acetic bằng BC
Với những tính chất và cấu tạo của BC, ta thấy BC là chất mang thích hợp để cố
định vi khuẩn bằng phương pháp hấp phụ, kích cỡ của sợi cellulose phù hợp với việc cố
định tế bào vi khuẩn Acetobacter aceti lên BC.
Acetobacter là một trong những vi khuẩn sản xuất ra cellulose. Vi khuẩn này được
bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật
luôn ở bề mặt tiếp giáp giữa môi trường lỏng với không khí. Hệ thống polymer làm cho
các tế bào có thể bám chặt trên bề mặt môi trường và giúp tế bào thâu nhận chất dinh
dưỡng dễ dàng hơn so với khi tế bào ở trong moi trường lỏng không có mạng lưới
cellulose.
Ngoài ra, nhờ tính dẻo dai và tính hút nước, các lớp cellulose giúp các tế bào vi
khuẩn kháng lại được những thay đổi không thuận lợi trong môi trường sống như giảm

lượng nước, thay đổi pH, sự xuất hiện các chất độc và các vi sinh vật cạnh tranh.
Sau khi được vắt kiệt nước, BC có khả năng hấp phụ và trương nở tốt khi đưa dịch
giống vào. Mặt khác, với phương pháp hấp phụ này ta không cần sử dụng thêm những
hóa chất dặc biệt, do đó ít gây ảnh hưởng hoạt tính của vi sinh vật, không gây ô nhiễm
môi trường và rẻ tiền.
Từ những nguyên nhân trên, ta thấy cellulose là một loại giá thể phù hợp để cố
định vi sinh vật.
22
Chương 3:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. Vật liệu
23
Hệ thống immobilized cell reactor (ICR) đường kính thực 5 cm, chiều cao cột 85
cm. Cột được chế tạo bằng thủy tinh dày 3 mm. Theo mô hình:
Bình chứa môi trường khoảng 20 lít, và hệ thống bơm môi trường cho ICR.
Hệ thống cố định tế bào alginate. Theo mô hình:
24
Môi trường nhân giống
Thành phần g/l
Glucose 5
Dịch nấm 0.5
KH
2
PO
4
1.5
Na
2
PO
4

2.25
Thêm nước cho đủ 500ml và tiệt trùng 121
0
C trong 15 phút
Giống vi sinh vật Saccharomyces cerevisiae ATCC 24860 (Amercan Type Culture
Collection, Manassas, VA, USA).
Và các dụng cụ phòng thí nghiệm trong lên men.
3.2. Phương pháp
3.2.1. Thành phần alginate trong hệ thống reactor
Phần % Alginate
1.5% 2% 3% 6%
Sau 16 h lên men và lấy hạt cố định phân tích trên kính hiển vi điện tử với độ
phóng đại 300 lần và 2000 lần.
3.2.2. Xác định nồng độ glucose
Việc xác định nồng độ glucose đầu vào và ra theo chất chỉ thị hóa học 3,5 –
dinitrosaliucylic acid 98%.
3.2.3. Xác định ethanol.
Sản phẩm ethanol trong quá trình lên men xác định sắc kí khí, HP 5890 series II,
(Hewlett – Packard, Avondale, PA, USA)
3.2.4. Xác định trọng lượng tế bào
Theo mật độ quang đo tại bước sóng 620 nm Cecil 1000 series (Cecil Instruments,
Cambridge, England)
3.2.5. Phân tích thống kê
Mẫu thí nghiệm được tiến hành lập lại theo nhiều lần và được phân tích theo phần mềm
thống kê
25