Nguyên tắc cơ bản của PCR pps

Nguyên tắc cơ bản của PCR

+ Khái quát chung:
PCR là phương pháp dùng enzym khuyếch đại chọn lọc một đoạn ADN
theo luật số mũ. Phản ứng nhân gene được thực hiện với enzym ADN chịu nhiệt,
hai mồi tổng hợp và 4 loại deoxyribonucleic (dATP, dGTP, dCTP và dTTP). Mỗi
một chu kỳ phản ứng nhân gene gồm 3 bước (xem hình vẽ minh hoạ): Bước 1 là
biến tính ADN, có tác dụng tách hai sợi đơn từ sợi khuôn xoắn kép. Bước 2 là bắt
cặp hai mồi vào hai sợi đơn của khuôn. Bước 3 là kéo dài chuỗi theo mồi, chiều
5’-3’ với quá trình trùng hợp gắn các dNTP dọc theo sợi khuôn để tạo thành phiên
bản mới theo nguyên tắc bổ sung. Tính đặc hiệu của phản ứng được quy định bởi
mồi và sự sao chép trực tiếp theo trình tự sợi khuôn giữa hai mồi. Như vậy, kết
quả tạo ra hàng triệu phiên bản sợi khuôn trong vài giờ.
Mồi cho phản ứng là các đoạn ADN có kích thước 20-30 nucleotid được
thiết kế theo trình tự của đoạn gene cần khuyếch đại dựa theo dữ liệu có sẵn. Mỗi
cặp mồi phải hoàn thành chức năng của mình trong toàn bộ phản ứng, tức là chúng
phải bám đặc hiệu vào đúng vị trí riêng cho từng mồi. Sở dĩ như vậy là do nếu
chúng không bám vào vị trí đặc hiệu thì không thể khuyếch đại được đoạn gene
đích. Với các gene có độ bảo thủ cao như rADN thì khi cặp mồi được thiết kế thì
chúng có thể nhân được gene từ nhiều đối tượng. Ngược lại, trong nhiều trường
hợp dùng mồi không đặc hiệu thì có thể nhân được các sản phẩm PCR không đặc
hiệu. Tuy nhiên, cả hai kết quả trên đều được dùng cho định typ vi sinh vật.
Thí nghiệm phản ứng PCR lần đầu tiên dùng mảnh Klenow của enzym
ADN polymerase I từ E.coli. Tuy nhiên, enzym này bị biến tính tại 94
o
C và như
vậy cần phải bổ sung enzym mới sau mỗi chu kỳ phản ứng. Đến nay quá trình này
đã được cải thiện do dùng enzym Taq ADN polymerase (Taq = Thermus aquaticus
) chịu nhiệt. Enzym này được tách ra từ vi khuẩn sống ở suối nước nóng. Tốc độ
xúc tác cho phản ứng của enzym này rất nhanh, có thể đạt khoảng 8000 bp/phút tại
755

o
C. Hoạt tính enzym giảm một nửa khi xử lý tại 92.5
o
C trong 230 phút hoặc 40
phút tại 95
o
C. Như vậy khi dùng enzym này thì không cần bổ sung enzym mới sau
mỗi chu kỳ phản ứng.

+ Các thông số kỹ thuật:

Bất kỳ một phản ứng PCR nào cũng bắt đầu bằng việc tách ADN làm sợi
khuôn. Nói chung, theo lý thuyết chỉ cần một sợi khuôn cũng đủ cho phản ứng tạo
ra sản phẩm nhưng trong thực tế cần khoảng 10-100 ng/phản ứng. Đôi khi chuẩn
bị ADN theo phương pháp đơn giản không cần tinh sạch cũng phù hợp cho phản
ứng PCR. Tuy nhiên, điều quan trọng là tránh sự có mặt của EDTA (acide
éthylène-diamine-tétraacétique) hoặc đệm phosphat vì kết quả sẽ làm giảm Mg
++

(do EDTA hoặc tạo thành muối Mg
3
(PO4)
2
khi nhiệt độ cao). Phản ứng PCR có
thể nhân được đoạn gene dài 10 Kb nhưng trong thực tế thường dùng để nhân các
đoạn có kích thước ngắn hơn (<2 Kb). Có thể tham khảo các thông số thành phần
phản ứng PCR trong bảng dưới đây.

Bảng 1.8. Thành phần phản ứng PCR.

Thành phần Số lượng
ADN khuôn 10-100 ng
dNTP (mỗi loại) 200 mM
Mồi xuôi 0.1 – 1.0 mM
Mồi ngược 0.1 – 1.0 mM
Taq polymerase 1 U
KCL 50 mM
Tris HCL (pH 8.4) tại 25
o
C 10 mM
MgCl
2
2.85 mM
Gelatin 100 mg/l
Nonidet-40 0.05%

Số chu kỳ cho phản ứng tạo sản phẩm đặc hiệu từ 20-30 chu kỳ. Điều chú ý
là các mồi cho phản ứng phải có nhiệt độ bắt cặp với ADN đích gần nhau, có trình
tự không bổ sung nhau để tránh bắt cặp với nhau. Trình tự đầu 3’ của các mồi
cũng phải khác với trình tự vùng trung tâm của sản phẩm để tránh tạo thành hiện
tượng kẹp tóc. Nói chung, ngày nay người ta có thể tối ưu hoá việc chọn mồi nhờ
sự trợ giúp của các chương trình máy tính.
Đôi khi cũng xuất hiện hiện tượng nhân sản phẩm PCR không đặc hiệu,
điều này thường hay xuất hiện khi dùng các cặp mồi suy biến từ chuỗi acid amin.
Tuy nhiên trong hầu hết các trường hợp này thì việc thay đổi điều kiện phản ứng
có thể hạn chế được các sản phẩm không mong muốn. Các thành phần như nhiệt
độ, nồng độ Mg
++
và enzym có ảnh hưởng lớn đến tính đặc hiệu. Sự có mặt của
nonidet-40 có tác dụng tăng hiệu suất của phản ứng.

Việc ứng dụng kỹ thuật RFLP với sản phẩm PCR có thể là cách nhanh
chóng để tìm sự khác biệt đối với các gene khác nhau. Với cách này yêu cầu sản
phẩm PCR phải sạch và đồng nhất. Theo cách này trình tự có thể được thực hiện
như sau: Sau khi điện di kiểm tra độ sạch của sản phẩm PCR, tiến hành kết tủa với
ethanol. Kết tủa được hoà với đệm thích hợp và sau đó được xử lý với enzym cắt
hạn chế thích hợp. Kiểm tra kết quả thông thường trên gel agarose, trong một số
trường hợp có thể trên gel polyacylamid để thu được độ phân giải cao hơn. Chú ý
rằng thông thường hoạt tính enzym giảm 5% sau mỗi chu kỳ nhiệt. Như vậy có thể
ước lượng 50% hiệu quả khuyếch đại mất đi trong toàn bộ quá trình phản ứng.
+ Một số khó khăn với phản ứng PCR:

PCR là kỹ thuật có ý nghĩa lớn trong nghiên cứu sinh học phân tử nhưng
cũng nảy sinh một số vấn đề cần chú ý đặc biệt khi phát hiện một số bệnh virus
hay vi khuẩn. Vấn đề ở đây là acid nucleic của cả tế bào chết và tế bào sống đều
cho kết quả dương tính trong phản ứng PCR. Phản ứng nhạy nên mọi sự nhiễm
ADN đều có thể đưa đến sản phẩm dương tính giả trong kết quả. Để hạn chế thực
tế này cần tiến hành với các mẫu đối chứng cần thiết để biết được sự nhiễm tạp từ
các thành phần phản ứng hay từ dụng cụ thí nghiệm.

Một vấn đề nữa cũng cần đề cập là sai số trong phản ứng nhân gene với
enzym taq ADN polymerase. Sai sót thêm nucleotid xảy ra với mỗi một đơn vị sao
chép khoảng 9000 nucleotid và đột biến dịch khung xảy ra với số lượng tương ứng
khoảng 40 000 nucleotid.
+ Một số kỹ thuật PCR khác:
Một số kỹ thuật phát triển trên cơ sở của kỹ thuật PCR có ý nghĩa quan
trọng cho định danh và định typ vi sinh vật là nested PCR (PCR lồng), revert
transtriptase PCR (sao chép ngược) và asymmetric PCR (PCR một chiều). PCR
lồng là phản ứng PCR bao bồm hai phản ứng đồng thời, phản ứng đầu ở vòng
ngoài gene và sản phẩm của nó lại làm khuôn cho phản ứng sau cho đoạn nằm
trong gene. Như vậy phản ứng sau cần 1 hay 2 mồi để nhân phần gene nằm trong

sản phẩm PCR từ hai mồi phía ngoài tạo ra. Vai trò kỹ thuật này làm tăng độ nhạy
và đặc hiệu của phản ứng PCR.
Phản ứng PCR phiên mã ngược được dùng để nhân ADN từ ARN của
virus. Việc kết hợp phản ứng này với PCR lồng có tác dụng phát hiện ARN tại
thời điểm nhất định của mẫu.
Kỹ thuật PCR một chiều được ứng dụng trong phương pháp giải trình tự
ADN trực tiếp từ sản phẩm PCR.phẩm PCR.
+ Sử dụng kỹ thuật PCR cho xác định typ vi sinh vật:
Như đã trình bày ở trên, dùng cặp mồi đặc hiệu có thể xác định được gene
đặc trưng cho loài hay thậm chí một chủng vi sinh vật nào đó. Các chiến lược ứng
dụng lợi thế của kỹ thuật PCR dùng trong xác định typ vi sinh vật trong nghiên
cứu dịch tễ học được chia làm 4 nhóm sau:
- Phân tích RFLPs với sản phẩm PCR khi dùng cặp mồi đặc hiệu.
Trong trường hợp này dùng kết hợp kỹ thuật PCR và xử lý sản phẩm PCR
với enzym cắt hạn chế và quan sát kết quả sau khi điện di sản phẩm trên gel
agarose hoặc polyacrylamid Một dẫn chứng cho kỹ thuật này là kết quả nhân gene
synthase citrat trong Ricketsiae sau đó sản phẩm PCR được xử lý với enzym cắt
hạn chế để phân biệt giữa các chủng với nhau (Regnery và Ctv, 1991). Các ví dụ
sau (bảng 1.8) đã cho thấy hiệu quả của phương pháp này.
Bảng 1.9. Một số ví dụ cho kỹ thuật RFLPs (Restriction Fragment Length
Polymorphism) phân tích các gene đặc hiệu được nhân lên bằng kỹ thuật PCR.
Chủng vi sinh vật nghiên cứu Tác giả nghiên cứu và tài liệu dẫn
Chlamydia spp. Kaltenboek et al (1992)
Clostridium spp. Gurtler et al. (1991)
Helicobacter pylori Foxall et al. (1992)
Hepatilis C virus Okamoto et al.(1992)
Mycobacterium tuberculosis Ross &Dwyer(1993)
Nitrobacter spp. Navarro et al.(1992)
Rickettsia spp. Regnery et al. (1991)
Streptococcus spp. McClellADN et al. (1992)

+ Dùng kỹ thuật PCR cho ribotyping:
Kỹ thuật PCR ribotyping là ứng dụng các cặp mồi đặc hiệu để nhân các
vùng gene của ARN (thuộc ribosom hay ARN vận chuyển). Tuy nhiên, trong thực
tế kỹ thuật này yêu cầu kinh nghiệm, kỹ thuật và tốn thời gian để thực hiện phép
lai. Để khắc phục hạn chế này một cách tiếp cận được trình bày ở đây là phân tích
đa hình (dấu vân tay) của vùng gene này hay vùng gene xen kẽ của rARN hoặc
tARN.
Hầu hết các chủng vi khuẩn đều chứa 2-22 phiên bản rARN trong mỗi tế
bào (Gottlie và Rundner, 1985) trong khi đó vùng xen kẽ giữa 16S và 23S chứa
một số các đoạn ADN lặp lại (Bacot và Reeves, 1991). Trong khi đoạn gene mã
hoá cho tARN khá bảo thủ thì vùng xen kẽ của tARN lại thay đổi từ 2-35bp đối
với Bacillus subtilis (Vod, 1985) và từ 2-208bp trên đối tượng E.coli (Jinks-
Roberson và Nomura, 1987). Như vậy khi sử dụng cặp mồi nhân toàn bộ vùng
gene tARN có thể tạo ra được sự khác biệt giữa các chủng vi sinh vật. Kết quả ứng
dụng kỹ thuật này trên một số đối tượng được trình bày trong bảng 1.9.

Bảng 1.10 Một số ví dụ sử dụng kỹ thuật PCR cho ribotyping.
Vi sinh vật Tác giả và tài liệu dẫn
Vi khuẩn lactic Klijin etal.(1991)
Listeria Czajka et al.(1993)
Mycoplasma Van Kuppeveld et al.(1992)
Pseudomonas cepacia Kostman et al.(1992)
Pseudomonas solanacearum Seal et al.(1992b)
Staphylococcus spp. Welsh &McClellADN(1992)
Streptococcus spp. McClellADN(1992)

Khi số phiên bản rARN tăng có nghĩa là làm tăng độ nhạy của phương pháp
ứng dụng. Engstrand và cộng tác viên (1920) đã công bố có thể sử dụng mẫu dò là
đoạn nucleotid bổ sung với đoạn 16S của rARN như là một trong số mồi cho phép

nhân phiên mã ngược ARN và phép phân tích được thực hiện nhờ kỹ thuật PCR
nhân sản phẩm cDNA được dùng cho phát hiện Helicobacter spp. Độ nhạy của
phương pháp phát hiện này tăng 50 lần so với phương pháp truyền thống.
+ Kỹ thuật rep-PCR:
Một phương pháp trực tiếp cho kết quả finger printing không cần sử dụng
enzym cắt hạn chế là rep-PCR dựa trên nguyên tắc nhân các đoạn gene lặp lại.
Thuật ngữ rep-PCR là chỉ phương pháp chung sử dụng cặp mồi đặc hiệu để nhân
các chuỗi lặp lại phổ biến trong các vi sinh vật thuộc cơ thể nhân sơ. Các chuỗi lặp
lại có độ bảo thủ cao trong các đối tượng thuộc Enterobacteriaceae và một số đối
tượng khác (Versalovic và Lupsky, 1991). Dùng các đoạn mẫu dò bảo thủ có thể
lai với cả hai đoạn ADN lặp lại: đoạn có kích thước 126bp (Enterobacterial
repetitive intergeneic concensus-ERIC) và đoạn 38bp (repetitive extrageneic
palindromic-REP) từ bộ gene của Enterobacteriaceae vi khuẩn gram âm và một số
chủng có quan hệ xa khác. Có thể trực tiếp thiết kế cặp mồi cho các đoạn gene bảo
thủ để thu được kết quả finger printing sau khi nhân gene dùng bộ gene của các vi
sinh vật có mang các đoạn gene bảo thủ này. Sau khi điện di có thể phát hiện được
trên agarose các đoạn gene có kích thước khác nhau từ các nguồn vi sinh vật khác
nhau. Kỹ thuật này được ứng dụng đã đem lại kết quả tốt khi nghiên cứu mối quan
hệ trên các đối tượng Bacillus subtilis (Versalovic và cộng sự, 1992), Citrobacter
diversus (Woods và cộng sự, 1991), Rhizobium meliloti (Brujin, 1992). Thực tế
phương pháp tạo ra kết quả finger printing đa dạng từ hầu hết các đại diện của
Enterobacteriaceae (Versalovic và cộng sự, 1991) và được ứng dụng trên tất các
vi khuẩn có mang các đoạn gene bảo thủ lặp lại trên.
Phương pháp tương tự cũng cho phép phát hiện sự khác nhau từ các nguồn
ADN trên các đối tượng nhân thực thuộc chi Naegleria như mô tả của Belkim và
Quint (1992). Phương pháp này dùng cho phát hiện đa hình các đoạn gene chung
cho cả vi sinh vật nhân sơ và nhân chuẩn.
+ Kỹ thuật RAPD (Random amplified of polymorphic DNA):
Hạn chế của các phương pháp nghiên cứu trước đây là phải dùng cặp mồi
đặc hiệu. Theo cách này phải có các thông tin liên quan đến đoạn gene nhất định

và đối tượng nghiên cứu. Khó khăn này được loại bỏ trong trường hợp dùng các
mồi ngẫu nhiên hay tuỳ tiện, như vậy phương pháp phân tích không cần đến thông
tin về geneome của đối tượng nghiên cứu…Cơ sở của phương pháp này đã được
Welsh và McClell ADN (1990) mô tả khi dùng mồi ngẫu nhiên nhân gene và tạo
ra phổ finger printing đặc trưng cho từng hệ gene (geneome). Mồi ngẫu nhiên có
thể chỉ gồm 5 bp để nhân gene có thể tạo ra kết quả finger printing khá đa dạng.
Có thể xem kết quả minh hoạ trong bảng và hình sau.
Bảng 1.11. Ví dụ minh hoạ cho kỹ thuật RAPD.

Đối tượng Tác giả và tài liệu dẫn
Agaricus bisporus Khush&ctv(1992)
Aspergillus fumigatus Aufauvre-Brown (1992)
Bacillus thuringiensis Brousseau&ctv (1993)
Brucella spp. Fekete&ctv(1992)
Campylobacter spp. Mazurier&ctv(1992)
CADNida spp. Lehmann 7 ctv (1992)
Casuarina spp. Sellstedt& ctv(1992)
Clostridium difficile McMillan& Muldrow(1992)
Frankia spp Sellstedt& ctv(1992)
Fusarium solani Crowhurst & ctv(1991)
Helicobacter pylori Akopyanz & ctv(1992)
Histoplasma capsulatum Woods& ctv (1993)
Lactococcus lactic Cancilla & ctv (1992)
Leptosphaeria maculans Goodwin&Annis(1991)
Listeria monocytogenees Czajka & ctv (1993)
Porphyromonas gingivalis Menard &ctv (1992)
Rhizobium spp. Harrison &ctv (1992)
Staphylococcos spp. Weish &McClellADN (1990)
Streptococcus spp. Weish &McClellADN (1990)
Streptococcus uberis Jayarao &ctv (1992)

Hình 1.9. Minh hoạ kết quả phân tích sử dụng kỹ thuật RADP.