NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM TỪ STREPTOMYCES 16.34 ppt

NGHIÊN CỨU SINH TỔNG HỢP KHÁNG SINH CHỐNG NẤM
TỪ STREPTOMYCES 16.34

TÓM TẮT
Mục tiêu: sàng lọc dạng chủng đầu dòng, cải thiện khả năng sinh tổng hợp
kháng sinh và khảo sát các thành phần kháng sinh của chủng Streptomyces 16.34
phân lập được từ cơ chất ở Việt Nam.
Phương pháp: sử dụng ISP (International Streptomyces Project) để phân
loại Streptomyces 16.34. Khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh của
Streptomyces 16.34 được khảo sát bằng phương pháp lên men chìm trên máy lắc
và phương pháp khuếch tán trên khối thạch, giếng thạch và khoanh giấy lọc.
Phương pháp chiết đơn với các dung môi thích hợp được dùng để chiết xuất kháng
sinh, sau đó dùng phương pháp sắc ký lớp mỏng để khảo sát thành phần kháng
sinh.
Kết quả: Sàng lọc ngẫu nhiên và sàng lọc sau đột biến cho biến chủng
kháng sinh tăng mạnh. Môi trường MT4 dịch thể rất hiệu quả trong kỹ thuật lên
men chìm. Kháng sinh từ xạ khuẩn Streptomyces 16.34 có ít nhất 3 thành phần
khác nhau, có thể được chiết xuất bằng butyl acetat hoặc n-butanol và diệt được
8/10 vi khuẩn cũng như 6/7 chủng vi nấm được thử.
Kết luận: chưa xác định chính xác tên khoa học của chủng Streptomyces
16.34, phân lập từ cơ chất Việt nam, dựa trên tiêu chuẩn phân loại ISP nhưng
kháng sinh chiết xuất từ xạ khuẩn đã thể hiện vai trò kháng khuẩn và kháng nấm
hiệu quả, điều này mang đến hy vọng có thể phát hiện một kháng sinh chống nấm
mạnh.
ABSTRACT
Objective: to select the isolates, to improve its ability of antibiotic
biosynthesis and to examine the components of antifungal products from
Streptomyces 16.34 which has been isolated from substrate in Viet Nam.
Methods: Streptomyces 16.34 was classified by using ISP (International
Streptomyces Project). The antibiotic biosynthesis ability of Streptomyces 16.34
was determined by the submerged fermentative method and the agar diffusion

method (an agar cut diffusion; well diffusion and disk diffusion). The antifungal
agent was extracted by appropriate sovents and then its components were
determined by thin layer chromatography.
Results: Random selection and selection after mutation product the
mutated isolates having powerfully better antibiotic activity. The MT4 broth was
very useful for the submerged culture fermentation. The antifungal agent,
including at least 3 components, could be extracted from Streptomyces 16.34 by
butyl acetate or n-butanol. The agent has the activity against 8/10 test bacteria and
against 6 over 7 tested fungi.
Conclusions: classification according to ISP have not yet determined the
scientific name of Streptomyces 16.34, which was isolated from substrate in Việt
Nam. However, the antibiotic extracted from Streptomyces 16.34 has shown
effectively the antibiotics ability and the antifungal ability. It is expected that a
strong antibiotic can be developed furthermore.
ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là một nước đang phát triển lại có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm, do
đó, bệnh nhiễm trùng luôn là mối đe dọa nguy hiểm đến sức khoẻ con người.
Nhưng chính điều kiện khí hậu đó đã tạo ra một quần thể vi sinh vật phong phú,
trong đó phải kể đến chi xạ khuẩn Streptomyces - thuộc lớp phụ (bộ)
Actynomycetales - có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh đa dạng có cấu trúc và
đặc điểm kháng sinh khác nhau, một số loài có khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
chống nấm
(1)
. Gần đây việc phân lập các chủng Streptomyces đã được tiến hành
trong một số Viện nghiên cứu và Trường Đại học ở nước ta. Bài báo này công bố
một số kết quả của đề tài “ Nghiên cứu sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm từ
Streptomyces 16.34” về các khía cạnh sau:
- Nghiên cứu sàng lọc dạng chủng đầu dòng và cải thiện khả năng sinh tổng
hợp kháng sinh của chủng Streptomyces 16.34 phân lập được từ cơ chất Việt Nam.
- Nghiên cứu lên men sinh tổng hợp kháng sinh: thành phần môi trường lên

men, các điều kiện ngoại cảnh, v.v để cải thiện khả năng sinh tổng hợp kháng
sinh của chủng.
- Nghiên cứu chiết xuất kháng sinh, cũng như nghiên cứu các thành phần
của kháng sinh.
PHƯƠNG PHÁP VÀ NGUYÊN LIỆU
Chủng xạ khuẩn
Chủng Streptomyces 16.34 do phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Bộ môn
Vi sinh và Sinh học, trường đại học Dược Hà Nội cung cấp.
Giống vi sinh vật kiểm định
Giống VSV kiểm định do bộ môn Vi sinh và Sinh học cung cấp, bao gồm 5
vi khuẩn Gr (+), 5 vi khuẩn Gr (–) và 7 chủng vi nấm kiểm định.
Các môi trường đã sử dụng
- Nuôi cấy xạ khuẩn đã sử dụng các môi trường MT1- MT7 và các biến thể
dịch thể (bỏ thạch) từ đấy để lên men sinh tổng hợp kháng sinh
(1)

- Phân loại Streptomyces: sử dụng các môi trường ISP1-ISP9
(4)
.
- Nuôi cấy vi nấm để thử nghiệm trên môi trường Sabouraud.
- Nuôi cấy vi khuẩn kiểm định trên môi trường canh thang và thạch thường.
Các phương pháp nghiên cứu
- Phương pháp nuôi cấy bề mặt trên thạch nghiêng và trong hộp Petri được
sử dụng để nuôi cấy xạ khuẩn, vi khuẩn và vi nấm.
- Phân loại Streptomyces 16.34 sử dụng phương pháp phân loại theo ISP
(International Streptomyces Project)
(4)
.
- Phương pháp lên men chìm trên máy lắc được sử dụng để nghiên cứu lên
men sinh tổng hợp kháng sinh.

- Xác định khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces áp dụng
phương pháp khuếch tán sử dụng khối thạch, giếng thạch, và khoanh giấy lọc
(1)
.
- -Chiết xuất kháng sinh sử dụng phương pháp chiết đơn bằng các dung môi
thích hợp.
- Nghiên cứu thành phần kháng sinh sử dụng phương pháp sắc ký lớp
mỏng.
KẾT QUẢ
Kết quả phân loại ISP theo khoá phân loại ISP
Đã xác định được các đặc trưng phân loại theo khoá phân loại ISP của
Streptomyces 16.34 với các đặc trưng phân loại như sau: Màu sắc của khuẩn ty khí
sinh: xám trắng (WGy), màu sắc của khuẩn ty cơ chất: có (1), sắc tố melanoit:
không có (0), hình dạng chuỗi bào tử: móc câu xoắn đơn (RA), bề mặt bào tử:
nhẵn (Sm), tiêu thụ D-glucoza: có (+), tiêu thụ inisitol: có (+), tiêu thụ D-xyloza:
có (+), tiêu thụ D-malnitol: có (+), tiêu thụ D-fructoza: có (+), tiêu thụ L-
arabinoza: không (-), tiêu thụ Rafinoza: có (+), tiêu thụ Rhamnoza: có (+), tiêu thụ
sacaroza: có (+). Viết ký hiệu tóm tắt như sau: WGy 0 1 RA Sm + + + + + - + + +.
Tuy nhiên so sánh với danh mục các chủng đã được công bố của ISP không có
công bố nào trùng với các kết quả của chúng tôi, do đó chưa xác định được tên
khoa học của Streptomyces 16.34 theo ISP.
Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34
mới phân lập được
Kết quả thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 trên
môi trường MT3 đã cho thấy Streptomyces 16.34 sinh tổng hợp kháng sinh chống
lại 8/10 chủng vi khuẩn đã được thử. Tiếp tục nuôi cấy Streptomyces 16.34 trên 7
môi trường MT1-MT7 và sau 6 ngày ủ thử khả năng sinh tổng hợp kháng sinh
được đánh giá đối với 10 vi khuẩn kiểm định bằng phương pháp khối thạch. Kết
quả được giới thiệu ở bảng 1.
Bảng 1. Khả năng sinh tổng hợp kháng sinh của Streptomyces 16.34 trên 7

môi trường khác nhau
Đường kính vòng vô khuẩn (mm), s
S
TT
V
i sinh
vật KĐ

M
T1
M
T2
M
T3
M
T4
M
T5
M
T6
M
T7
1

B
. cereus

1
7,62
1,

18
1
8,43
0,
43
1
6,04
1,
11
1
3,94
2,
27
1
2,61
2,
77
1
4,63
1,
86
1
0,21
1,
08
2

B
.
pumilus

1
9,73
0,
89
1
9,26
1,
07
1
4,41
1,
06
1
7,47
0,
92
1
1,72
1,
59
1
2,56
3,
29
8,
35
0,
42
3

B
.
1
7,15
1
6,17
1
4,35
1
5,93
1
2,53
1
3,69
9,
76
Đường kính vòng vô khuẩn (mm), s
S
TT
V
i sinh
vật KĐ

M
T1
M
T2
M
T3

M
T4
M
T5
M
T6
M
T7
subtilis

0,
26
0,
96
0,
43
0,
55
1,
79
0,
59
0,
96
4

S
. lutea
2
1,67

0,
62
2
0,63
0,
21
1
9,05
4,
80
1
9,48
0,
75
1
3,82
0,
87
1
8,17
1,
12
1
2,67
0,
55
5

S
ta.

aureus
1
3,18
1,
09
1
3,65
0,
68
1
5,13
1,
06
1
6,05
1,
78
1
2,73
1,
43
1
5,78
0,
60
1
1,97
0,
58
6

E
. coli
8,
76
0

9,
42
1
2,73
9,
17
9,
98
1
0,16
Đường kính vòng vô khuẩn (mm), s
S
TT
V
i sinh
vật KĐ

M
T1
M
T2
M
T3

M
T4
M
T5
M
T6
M
T7
1,
07
0

0,
98
1,
95
1,
35
0,
89
1,
17
7

P
ro.
mirabili
s
1
5,30

1,
20
1
5,26
1,
02
1
4,93
0,
46
1
5,05
2,
25
1
2,29
2,
35
1
5,50
0,
68
9,
39
0,
18
8

P
s.

aerugin
osa
0

0

0

0

0

0

7,
92
0,
55
0

0

7,
78
0,
31
0

0

9

S
al.
0

0

0

1
3,32
8,
46
7,
75
9,
50
Đường kính vòng vô khuẩn (mm), s
S
TT
V
i sinh
vật KĐ

M
T1
M
T2
M

T3
M
T4
M
T5
M
T6
M
T7
typhi 0

0

0

1,
87
0,
23
0,
78
0,
71
1
0
S
hi.
flexneri

0

0

0

0

0

0

9,
51
0,
57
0

0

7,
52
0,
10
0

0

Môi trường MT4 cho kết quả tốt nhất, còn môi trường phân lập MT3 chỉ
cho kết quả thứ 5. Hai vi khuẩn kiểm định có độ nhạy tốt đối với kháng sinh là
Bacillus pumilus ATCC 10241 và Proteus mirabilis BV 108 được sử dụng làm vi

khuẩn kiểm định cho các nghiên cứu về sau.
Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên Streptomyces 16.34 được trình bày ở bảng 2.
Bảng 2. Kết quả sàng lọc ngẫu nhiên
B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng
chủng
D(mm)

s D(mm)

s
1 16.34-
1
21,59 0,66

19,01 1,11

2 16.34-
2
19,36 0,37

17,67 1,17

3 16.34-
3
20,43 0,88

17,93 1,08

4 16.34-
4
21,83 0,44

18,67 0,74

5 16.34-
5
18,13 0,47

14,97 0,34

6 16.34- 21,49 0,92

18,60 1,22

B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng
chủng
D(mm)

s D(mm)

s
6
7 16.34-
7
20,02 0,39

18,87 0,28

8 16.34-
8
20,59 0,13

18,00 0,55

9 16.34-
9
20,48 0,30

17,85 0,95

10 16.34-
10
19,56 1,36

17,31 1,00

11 16.34-
11
20,70 0,57

17,84 0,41

B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng

chủng
D(mm)

s D(mm)

s
12 16.34-
12
20,96 0,73

17,89 0,06

13 16.34-
13
18,88 0,79

17,17 0,50

14 16.34-
14
15,14 0,90

14,37 0,39

15 16.34-
15
20,35 0,91

18,20 0,09

16 16.34-
16
12,86 1,11

13,80 0,99

17 16.34- 20,35 0,41

17,38 0,23

B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng
chủng
D(mm)

s D(mm)

s
17
18 16.34-
18
19,09 1,42

18,05 0,71

19 16.34-
19
18,80 0,82

16,67 0,58

20 16.34-
20
16,15 0,63

14,19 1,03

21 16.34-
21
16,74 1,02

14,91 0,79

22 16.34-
22
17,03 0,16

13,43 0,10

B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng
chủng
D(mm)

s D(mm)

s
23 16.34-

23
18,15 0,42

17,59 0,96

24 16.34-
24
18,65 0,42

17,07 0,36

25 16.34-
25
23,31 1,08

19,50 1,53

25 16.34-
26
14,95 0,67

15,65 1,07

26 16.34-
27
17,55 1,04

16,88 1,84

27 16.34- 15,43 1,50

15,42 1,46

B. pumilus Pro. mirabilis STT

Dạng
chủng
D(mm)

s D(mm)

s
28
Các dạng chủng tốt nhất lần lượt là: 16.34-25, 16.34-1, 16.34-4, 16.34-6, và
16.34-8. Đây là các dạng chủng chính được nghiên cứu tiếp.
Kết quả đột biến
Tiến hành đột biến các bào tử của dạng chủng 16.34-25 bằng ánh sáng tử
ngoại với các tham số: Bước sóng 254 nm, khoảng cách 60 cm, thời gian 5 phút.
Kết quả sàng lọc sau đột biến được giới thiệu ở bảng 3.
Bảng 3. Kết ả sàng lọc sau đột biến
B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

1 24,78 0,3
2
10
4
21,36 1,3
6
10
6
2 26,82 0,1
2
11
3
24,84 0,2
3
12
2
3 25,00 0,4
5
10
5

23,34 1,3
6
11
5
4 23,26 0,6
1
98

20,56 0,3
1
10
1
5 25,46 1,3
2
10
7
23,38 0,4
6
11
4
B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

6 25,63 0,5
6
10
8
21,63 0,2
1
10
6
7 24,52 1,2
5
10
3
20,46 0,5
6
10
0
8 25,80 0,2
3
10
9
22,36 1,5
3
10
9
9 26,48 0,4
6
11
1
23,42 0,2
6

11
5
10 26,46 0,8
6
11
1
25,12 0,5
4
12
3
B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

11 22,34 1,2
4
94

19,86 1,2
5
97

12 23,64 0,4
5

99

21,53 0,6
4
10
6
13 26,62 1,3
6
11
2
23,42 2,1
0
11
5
14 25,30 0,2
3
10
6
21,65 1,4
6
10
6
15 26,48 1,4
5
11
1
23,16 0,5
7
11
4

B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

16 25,16 1,3
6
10
5
23,37 0,5
6
11
5
17 26,68 0,2
5
11
2
22,86 0,6
2
11
2
18 26,60 0,6
4
11
2

20,42 1,1
3
10
0
19 25,70 0,3
2
10
8
21,37 0,2
5
10
5
20 22,60 0,1
6
95

19,76 0,1
3
97

B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

21 19,74 0,3
6
83

17,34 0,4
3
85

22 27,44 0,2
3
11
5
25,45 0,6
5
12
4
23 25,50 1,3
6
10
7
22,52 0,4
6
11
0
24 25,78 0,1
5
10
8
23,46 0,4
3

11
5
25 23,52 0,6
2
99

21,82 1,2
5
10
7
B. pumilus Pro. mirabilis Biế
n chủng
D(m
m)
s %

D(m
m)
s %

MC

23,78 0,4
2
10
0
20,38 0,4
0
10
0

Các biến chủng tốt nhất lần lượt là 22, 10, và 2 được giữ lại để nghiên cứu
tiếp.
Kết quả lên men chìm
Đã tiến hành lên men chìm trong các môi trương dịch thể MT1, MT3 và
MT4. Kết quả được giới thiệu ở bảng 4.
Bảng 4. Kết quả lên men chìm
Đường kính vòng vô khuẩn (mm) ST
T
Môi
trường
B. pumillus Pr. mirabilis
Gh
i chú
D s D s
1 MT
1 dd
16,3
8
0,2
3
14,3
4
0,1
8

2 MT
3 dd
20,3
6
0,5

1
16,7
1
0,5
3

3 MT
4 dd
22,4
7
0,7
2
19,1
4
1,1
2

Môi trường MT4 dịch thể cho kết quả tốt nhất.
Khảo sát tác dụng của pH lên độ bền của kháng sinh, kết quả (kết quả không
được giới thiệu) cho thấy ở pH trung tính kháng sinh là bền nhất.
Kết quả chiết xuất kháng sinh
Dịch lọc dịch lên men được chiết bằng các dung môi khác nhau trên các pH
khác nhau để chọn dung môi tốt nhất. Kết quả được giới thiệu trong bảng 5.
Bảng 5. Kết quả chiết xuất kháng sinh bằng dung môi hữu cơ
Kết quả (D - đường kính v
òng vô
khuẩn, s)
Dung
môi
p

H
Pha
dịch chiết
Proteus
mirabilis
Bacillus
pumillus

Hữu
cơ
18,3
4
0,9
6
23,8
6
2,3
6
3
Nướ
c
0 0 0 0
Hữu
cơ
17,3
1
2,2
0
25,6
7

1,6
7
7
Nướ
c
0 0 0 0
Butyl
acetat
10

Hữu
cơ
14,2
5
1,9
4
25,1
3
2,5
5
Kết quả (D - đường kính v
òng vô
khuẩn, s)
Dung
môi
p
H
Pha
dịch chiết
Proteus

mirabilis
Bacillus
pumillus

Nướ
c
0 0 0 0
Hữu
cơ
13,9
1
0,3
4
15,1
4
1,0
8
3
Nướ
c
18,1
7
0,5
3
19,6
8
1,2
1
Hữu
cơ

17,4
9
2,0
3
18,3
1
1,7
1
Cloro
-form
7
Nướ
c
20,4
6
1,2
3
21,2
9
2,3
0