CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ pot

CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC
PHÂN TỬ

KÝ SINH TRÙNG VÀ VẤN ĐỀ PHÂN LOẠI
Ký sinh trùng (KST) được coi là có vị trí quan trọng thứ hai sau vi sinh vật
trong mối quan hệ lây nhiễm và phát sinh bệnh tật giữa con người và động vật với
hệ sinh thái và môi trường. Hàng năm, tỷ lệ gây nhiễm, gây bệnh và gây chết của
bệnh do ký sinh trùng gây ra là rất cao buộc các nhà khoa học thực sự phải xem
xét lại và tìm phương pháp mới trong việc giám định, chẩn đoán nhằm tìm ra
phương pháp tối ưu trong việc nghiên cứu quy luật dịch tễ, điều trị và nguyên lý
lập phả hệ quần thể sinh học xác định nguồn gốc lây nhiễm của ký sinh trùng
(10)
.
Hiện nay, ký sinh trùng được coi là tập hợp đa dạng nhất, nên việc phân
loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt đối với
một số loài anh em (sibling species). Do vậy, nhiều khi hình thái học ký sinh trùng
dễ gây nên phức tạp dẫn đến nhầm lẫn trong công tác chẩn đoán, điều trị, cũng
như việc phân loại tiến hoá của loài và họ KST. Phân loại và giám định bằng các
phương pháp truyền thống như dựa vào hình thái học, vào sự phân bố địa lý hay
theo đặc tính dịch tễ học và vòng đời, nhiều khi đã gộp nhầm những cá thể hoặc
quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính di truyền học hoàn
toàn khác biệt nhau. Những thành quả gần đây trong nghiên cứu KST, nhờ sử
dụng các phương pháp nghiên cứu di truyền học hiện đại, nhờ sự tiến bộ của các
phương pháp kỹ thuật gen và công nghệ ADN đã cho phép và bắt buộc chúng ta
phải nhìn nhận lại mối quan hệ phân loại ký sinh trùng theo các phương pháp
truyền thống, trước hết là phương pháp hình thái học
(3,6,10)
.
Việt Nam là một nước nhiệt đới với mức sống và trình độ dân trí về vệ sinh
môi trường chưa cao, nên hàng năm bệnh do KST gây ra vẫn là một gánh nặng đối

với ngành y tế và thú y của nước ta. Nghiên cứu về ký sinh trùng học (kể cả nhân
y và thú y) ở nước ta đã góp phần không nhỏ vào thành quả chung của nhân loại.
Tuy vậy, trong điều kiện Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu ký sinh trùng hầu
hết là dựa vào các phương pháp truyền thống là chính mà chưa có điều kiện làm
quen và phát triển một số phương pháp hiện đại, trong đó có việc tìm hiểu và ứng
dụng các phương pháp sinh học phân tử.
NHỮNG ĐƠN VỊ PHÂN LOẠI CHÍNH VÀ PHỤ
Là đơn vị cơ bản được sử dụng trong phân loại, thể hiện các đặc tính sinh
học tự nhiên và sự tiến hoá của nhiều cá thể có quan hệ chung về mặt di truyền.
Loài là khái niệm chung thể hiện theo các tiêu chuẩn về quan hệ sinh học lây
nhiễm và sinh sản hữu tính. Những cá thể có phương pháp sinh sản vô tính hay tự
sản (ví dụ: vi sinh vật) không thể liệt kê theo cách phân loại loài như vậy. Từ đó
nảy sinh sự nhầm tưởng và cần có hai khái niệm về loài: loài sinh học và loài di
truyền học
(12),(15)
. Loài sinh học nhiều lúc không đại diện đầy đủ cho loài di truyền
học, loài di truyền học có thể coi là loài có quan hệ ruột thịt (sibling species) với
loài sinh học, mặc dù các cá thể trong loài như thế này có thể có một số đặc tính
thích ứng vật chủ và vòng đời có khác nhau.
Dưới loài (subspecies)
Là khái niệm cũng được sử dụng trong hệ thống phân loại sinh vật và ký
sinh trùng, mặc dù thực chất không có tiêu chuẩn thật rõ ràng để đánh giá, chủ yếu
là dựa vào đặc tính phân bố theo vùng địa lý của đối tượng, và mối cách biệt loài -
dưới loài nhiều khi còn mang tính qui ước. Do vậy, nhiều khi quan hệ di truyền
học trong các cá thể dưới loài rất khập khễnh và xa vời về quy luật tiến hóa. Tuy
nhiên, nếu xét về tiêu chuẩn sinh học phân tử, loài và dưới loài cũng có những
biểu hiện sai khác (divergence) khác nhau.
Chủng (strain)
Là đơn vị thấp nhất trong loài đại diện cho sự biến thái di truyền học
(genetic variation) và mang tính cấp bậc phân loại của chính loài đó. Tuy nhiên,

hiện nay khái niệm về chủng và sự sử dụng đơn vị “chủng” trong thực tế còn thiếu
chính xác, lạm dụng, nhiều khi chỉ thích hợp với tiêu chuẩn này mà không thích
hợp với điều kiện đánh giá khác. Thông thường, chủng là tập hợp của các cá thể
phát hiện trong một vùng địa lý, có chung đặc tính di truyền học và thích ứng vật
chủ như nhau đã được xác định. Thực chất, loài và chủng là những đơn vị phân
loại được sử dụng một cách phổ biến, còn khái niệm dưới loài có tính chất trung
gian và có giá trị ước định trong phân loại.
Mẫu (isolate)
Không phải là đơn vị phân loại sinh học hay di truyền học, không có cấp
bậc trong tiến hoá, đơn giản chỉ là một/nhiều cá thể sinh học có chung hình thái
học và bước đầu được xác định quan hệ giống nhau. Một khi, các đặc tính hình
thái học và gen học của chúng được xác định chính xác, thì lúc này mẫu (isolate)
mới được coi và trở thành chủng (strain) đại diện cho loài đang nghiên cứu.
Biến chủng (variants)
Quy luật sinh học chính là sự bảo tồn (conservation) và biến đổi (variation),
góp phần vào tiến hoá qua thời gian của sinh vật. Sự thay đổi đa dạng trong cùng
một loài, hay còn gọi là biến đổi sinh học (biological variation), tạo ra các biến
chủng, mà các biến chủng (variants) nhiều khi chưa hẳn đại diện cho sự biến đổi di
truyền học (genetic variation hay genetic polymorphism). Các biến chủng xuất
hiện nhất thời, tồn tại ngắn, do vậy không phù hợp với nguyên lý tiến hoá của loài,
thậm chí nhiều khi còn thiếu nhiều đặc tính sinh - di truyền học để có thể kết luận
chúng thuộc loài này hay loài khác.
Mối quan hệ chủng - loài
Loài, dưới loài và chủng, như đã nói, được coi là các khái niệm đại diện
cho quần thể, và là mốc đánh giá sự tiến hoá của quần thể. Do vậy các đơn vị phân
loại này có ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống phân loại quần thể sinh học
(population systematics) do tính phức tạp của biến động di truyền, do sự chưa
chuẩn xác của phân nhóm đơn vị phân loại và do tiến hoá của loài, dưới loài và
chủng luôn xảy ra, nên hiện nay đánh giá hệ thống phân loại quần thể sinh học và
lập phả hệ của loài gặp rất nhiều khó khăn. Cũng tương tự, sự phức tạp và thiếu

chính xác đó đã có ảnh hưởng không nhỏ đối với viêc chẩn đoán, điều trị lâm sàng
và chương trình phòng chống bệnh tật nói chung và KST nói riêng.
GIỚI THIỆU NHƯNG PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG TRONG
GIÁM ĐỊNH VÀ PHÂN LOẠI LOÀI
Phương pháp hình thái học
Hình thái học (morphology) vẫn là phương pháp được sử dụng rộng rãi và có tính
thực tế nhất trong giám định và phân loại ký sinh trùng. Hình thái bên ngoài của một ký
sinh trùng hay các dạng phát triển trung gian của chúng là sự nhận biết nhanh nhất, dễ
dàng nhất và thuận tiện nhất để có thể có kết luận sớm về loại ký sinh trùng cần được
chẩn đoán hay đang nghiên cứu. Tuy vậy bằng phương pháp hình thái học các cá thể có
quan hệ ruột thịt rất khó phát hiện, có thể chúng cùng một đặc tính di truyền nhưng có
phương thức hoạt động sinh học khác biệt. Nhiều khi việc phân loại theo hình thái học đó
đã không có ý nghĩa thực tiễn trong chẩn đoán và điều trị, cũng như tiến trình phân tích
dịch tễ học của ký sinh trùng gây bệnh, vì có nhiều cá thể giống về hình thái, nhưng biểu
hiện tính tiến triển bệnh, vòng đời, tính kháng thuốc, di truyền, sinh sản hoàn toàn khác
nhau.
Thực tế mà nói, hình thái học vẫn là phương pháp dễ làm, nhanh chóng và
trong thực tiễn được sự dụng đi trước một bước làm chìa khoá phân loại đối với
quần thể ký sinh trùng có tính chất đơn dạng sinh học. Đối với nhiều loài có nhiều
biến chủng và có tính đa dạng sinh học cao, phương pháp này chưa thể nhận hết
những thông số nghiên cứu cần thiết, do vậy không cho phép chúng ta đơn phương
sử dụng phương pháp hình thái học để giám định và phân loại, đặc biệt đối với
một số nhóm, loài ký sinh trùng có hệ số biến chủng cao. Trong những trường hợp
đó, cần áp dụng phương pháp sinh học phân tử để làm sáng tỏ và chuẩn xác hình
thái học
(1,10,13)
.
Các phương pháp dựa trên sản phẩm protein của ký sinh trùng
Có thể phân làm hai nhóm protein: protein cấu trúc và protein hoạt tính sinh
học. Mỗi một loại sinh vật đều có nhiều loại protein hoạt tính, trong đó có các sản

phẩm độc, các enzym phân giải và nhiều protein cấu trúc có tính đặc hiệu theo
từng cá thể riêng. Phương pháp sử dụng nhiều nhất vẫn là phương pháp điện di
protein (electrophoresis). Bất kỳ một protein nào cũng cho thông số điện di có tính
chất đặc trưng cho từng cá thể. Loại protein được sử dụng điện di thông thường là
các enzym có hoạt tính sinh học cao của ký sinh trùng.
Có hai phương pháp chính trong giám định và phân loại: điện di enzym
đồng phân (isoenzyme analysis) và điện di enzym dị phân (alloenzyme analysis).
Hai phương pháp cổ truyền này được ứng dụng thành công trong nghiên cứu ký
sinh trùng sốt rét (Plasmodium), tiên mao trùng (Trypanosoma) và nhiều loại sán
lá đường ruột
(3,10,11)
. Tuy cùng chung nguyên lý là phát hiện protein cùng chức
năng, nhưng kết quả phân tích điện di enzym đồng phân phát hiện protein cũ của
cá thể để củng cố tính đồng nhất có tính chất giám định. Còn phân tích điện di
enzym dị phân cho phép phát hiện protein mới cùng chức năng, từ đó tìm hiểu tính
khác biệt của cá thể có tính chất phân loại.
Phân tích trật tự amino acid của một sản phẩm protein của ký sinh trùng
cũng được sử dụng từ những năm 1980 để giám định và phân loại. Tuy nhiên
phương pháp này đòi hỏi protein tinh sạch, trang thiết bị đắt tiền rất tốn kém và
mất nhiều công sức. Hơn nữa, các phương pháp sinh học phân tử một khi xác lập
trật tự nucleotide của gen nghiên cứu thì rất dễ dàng cho biết cấu trúc amino acid
của gen tạo sản phẩm đó.
Các phương pháp truyền thống khác trong giám định và phân loại
Dựa vào đặc tính dịch tễ học và vòng đời
Đó là các đặc tính về sự khác biệt thích ứng vật chủ, tính hướng định cơ
quan, đặc tính phát triển vòng đời sinh học, quá trình và độ dài lây nhiễm, tiến
triển và tiên lượng bệnh, hầu hết các đặc tính này là sự thể hiện cơ bản của đặc
tính di truyền, tuy vậy, ít nhất chúng cũng tồn tại theo phương thức ký sinh riêng
của cá thể, mà chúng ta có thể, đối chiếu ghi nhận loại ký sinh trùng này đối với
các loại ký sinh trùng khác

(7),(14)
. Các đặc tính dịch tễ học và vòng đời ký sinh này
còn được sử dụng nhằm phân biệt hai loại ký sinh trùng có quan hệ ruột thịt (ví dụ:
giun đũa ký sinh ở lợn Ascaris suum và giun đũa ký sinh ở người Ascaris
lumbricoides), mà dựa vào đặc tính hình thái đã không phân biệt được
(3)
.
Dựa vào đặc tính phân bố theo vùng, địa lý và phân bố vật chủ
Mặc dù không phải thiết yếu, nhưng sự tương đồng và khác biệt về điều
kiện địa lý và vật chủ cũng góp phần chính xác hóa các loài và chủng có quan hệ
gần nhau. Giun đũa người (Ascaris lumbricoides) và lợn (A. suum) đã được phân
biệt thông qua phương pháp phân bố vật chủ, và chứng tỏ chúng có quan hệ họ
hàng ruột thịt. Sán dây ký sinh trên người trước đây được cho là một dưới loài của
sán dây bò (Taenia saginata) với tên gọi kép T. saginata asiatica, nhưng hiện nay,
dựa vào tính ký sinh vật chủ và đặc biệt dựa vào phân tích sinh học phân tử, sán
dây người đã được chính thức công nhận là một loài riêng biệt có tên gọi Taenia
asiatica
(12)
.
Dựa vào đặc tính lai chéo và sinh lý, sinh hoá
Lai chéo (cross-breeding) ở các cá thể nhiều khi, cho những kết luận giá trị
về giám định và phân loại. Đối với ký sinh trùng, do tính phức tạp của vòng đời và
vật chủ trung gian, thực nghiệm lai chéo nhiều khi khó có thể thực hiện. Tuy vậy
một số loại ký sinh trùng đường máu (Schistosoma spp), tiêm mao trùng
(Trypanosoma spp), ký sinh trùng sốt rét (Plasmodium spp), được phân loại qua
một số thực nghiệm lai chéo. Các đặc tính lý hoá của ký sinh trùng biểu hiện trong
các điều kiện nuôi, sự thích ứng môi trường và vật chủ, trao đổi chất, hoạt động
của enzym trong quá trình sinh trưởng và phát triển, tính kháng và nhạy cảm thuốc
và hoá chất, hoá dược cũng được khảo sát và đánh giá phân biệt nhiều loại ký
sinh trùng trong chẩn đoán, điều trị. Các đặc tính này không được xem xét để đánh

giá tiến hoá và phân loại
(2)
.
Dựa vào các phương pháp huyết thanh học
Sự phát triển vượt bậc của khoa học về miễn dịch học, cho phép chúng ta
ứng dụng những phương pháp cực nhạy và chính xác trong chẩn đoán và giám
định. Sử dụng kháng nguyên sơ chế và tinh chế, cũng như các loại kháng thể đa và
đơn dòng của ký sinh trùng, chúng ta có được các phương pháp tin cậy và nhanh
trong việc giám định chủng và loài, ví dụ các phương pháp hấp phụ đánh dấu
enzym (ELISA), phương pháp miễn dịch học phóng xạ (RIA), phương pháp miễn
dịch huỳnh quang (IF). Điều đáng chú ý là phương pháp huyết thanh học ký sinh
trùng dễ cho kết quả chéo (cross-reaction), hơn nữa, cá thể có thể bị đa nhiễm
KST, nên nhiều khi khó chẩn đoán chính xác vật chủ đang mang loại KST nào.
Đối với nghiên cứu tiến hoá và lập phả hệ của loài, phương pháp huyết thanh học
không được coi là có ý nghĩa thực tiễn, ngược lại, phương pháp này cùng với
phương pháp hình thái học là các phương pháp rất có giá trị trong chẩn đoán và
điều trị.
Dựa vào đặc tính nhuộm màu cá thể và tế bào
Khi ép nhuộm bằng các loại thuốc nhuộm có thể phân biệt dễ dàng hình
dạng KST, thậm chí còn quan sát được sắp xếp và cấu trúc các cơ quan bên trong,
đặc biệt quan sát được sự phân thuỳ và hệ sinh sản của KST tạo cơ sở chẩn đoán
phân loại. Phương pháp nhuộm tế bào trước hết là sự phân lập và so sánh nhiễm
sắc thể (NST) của tế bào, rồi từ đó tìm kiếm các phân đoạn ADN (các locus) trong
NST chứa các gen hay các đoạn ADN có giá trị trong giám định và phân loại. Số
lượng cặp, hình thái, tính bắt màu đặc trưng của NST thông thường cho giá trị
tổng quát để bước đầu định hướng giám định và phân loại các cá thể trong và
ngoài loài
(13)
. Phương pháp nhuộm tế bào mang tính trung gian giữa phương pháp
truyền thống và sinh học tế bào tìm cấu trúc phân tử.

Hiện nay ở Việt nam nghiên cứu giám định và phân loại KST vẫn dựa vào
phương pháp hình thái học là chính mà chưa có điều kiện ứng dụng rộng rãi các
phương pháp SHPT. Tuy nhiên, do yêu cầu nghiên cứu, ngành sinh học Việt nam
nói chung và KST học nói riêng cũng cần nhanh chóng tìm hiểu và áp dụng các
loại phương pháp mới để có những kết quả nghiên cứu hoàn thiện hơn.
NHỮNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ DỰA TRÊN CẤU
TRÚC ADN CỦA HỆ GEN
Phương pháp di truyền học tế bào
Các phân đoạn ADN trong mỗi một nhánh nhiễm sắc thể (NST) có trong hệ
gen được chọn nghiên cứu thông thường là những vùng chứa các gen đặc hiệu,
hay những vùng có cấu trúc đặc biệt, hoặc là các vùng bất ổn định có nhiều chuỗi
ADN lặp ngắn (micro and minisatellite) hoặc lặp dài (macro-satellite). Các chuỗi
lặp (gọi là các satellite) là điểm yếu của hệ gen, mang dấu hiệu di truyền đặc trưng
(specific genetic markers) cho từng cá thể, rất có giá trị trong nghiên cứu tiến hoá
và phân loại.
Đối với KST, nghiên cứu các cấu trúc lặp và những vùng gen đặc hiệu thông
thường có giá trị hơn sử dụng hình thái và đặc tính NST, vì ở KST, NST của hệ gen bất
ổn định qua các giai đoạn sinh trưởng, phát triển, và vòng đời qua vật chủ trung gian.
Như vậy, phương pháp di truyền học tế bào trước hết là sự phân lập và so
sánh NST của tế bào, rồi từ đó tìm kiếm các phân đoạn ADN (các locus) trong
NST chứa các gen hay các đoạn ADN có giá trị trong giám định và phân loại. Số
lượng cặp, hình thái, tính bắt màu đặc trưng của NST thông thường cho giá trị
tổng quát để bước đầu định hướng giám định và phân loại các cá thể trong và
ngoài loài
(2,4,5)
.
Phương pháp hợp lai ADN -ADN
Phương pháp hợp lai ADN -ADN (DNA-DNA hybridization) là kỹ thuật hợp
nhất một đoạn dài ngắn khác nhau, thậm chí cả một vùng ADN có đồng nhất về cấu
trúc của hai cá thể khác nhau. ADN sử dụng phải là 1 sợi (sợi âm hoặc sợi dương) có

cấu trúc đã biết, để dò tìm ADN mới bằng cách hợp nhất theo cơ chế bổ sung với sợi
tương ứng trong hệ gen của cá thể làm đối tượng đang nghiên cứu.
Như vậy, bất kể vùng nào trong hệ gen của các cá thể, các cấu trúc tương
ứng đều có khả năng kết hợp với nhau. Sự kết hợp ADN này không hoàn toàn
tuyệt đối, cho nên phương pháp hợp lai ADN - ADN chỉ có thể sử dụng để biết
tổng thể trong sơ bộ giám định mà không có giá trị thật sự trong khảo sát các đặc
tính cá thể để phân loại. Do vậy, phương pháp này ít được coi là có hiệu quả trong
nghiên cứu về phả hệ. Hơn nữa, đây là phương pháp đắt tiền, khó thực hiện trong
điều kiện phòng thí nghiệm còn thiếu thốn, và lượng ADN nghiên cứu đòi hỏi rất
lớn (tới hàng miligam).
Phương pháp lai ADN phóng xạ
Đó là việc sử dụng một phân đoạn ADN đã biết, được đánh dấu bằng đồng
vị phóng xạ, rồi hợp lai với ADN của hệ gen các cá thể cần nghiên cứu. Nếu có sự
tương ứng đồng nhất về cấu trúc, đoạn ADN gắn đồng vị phóng xạ sẽ kết hợp với
ADN hệ gen và vùng đó sẽ được phát hiện bằng các kỹ thuật tiếp theo của phương
pháp này. Nhiều loại KST được giám định bằng phương pháp này, trong đó có:
Leishmania, Trypanosoma, Schistosoma, Fasciola
(8,10)
, đặc biệt là KST sốt rét,
Plasmodium falciparum. Đối với KST sốt rét, nhiều phương pháp chẩn đoán kể cả
huyết thanh học bằng kháng thể đơn dòng đều rất khó phân biệt các chủng của
chúng, nhưng phương pháp ADN phóng xạ đã cho kết quả chính xác.
Ngày nay, phương pháp này được kết hợp với kỹ thuật PCR (xem phần sau)
và chỉ thị hệ gen nhân, đã cho những kết quả mà các phương pháp khác không thể
đạt được.
Phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN bằng kỹ thuật
enzym giới hạn (phương pháp RFLP)
Đây là một phương pháp mới, sử dụng enzym giới hạn (restriction
enzyme), cắt rời ADN hệ gen thành nhiều đoạn dài ngắn khác nhau. Khi kiểm tra
trên thạch agarose chúng ta thu nhận được các đoạn (băng) ADN khác nhau, từ đo

lập nên bản đồ hệ gen, gọi là bản đồ enzym giới hạn của mỗi một cá thể. Phương
pháp này có tên gọi là RFLP (restriction fragment length polymorphism).
Enzym giới hạn là sản phẩm protein của vi khuẩn, có khả năng nhận biết
một chuỗi nucleotide ngắn (4-8 nucleotide) và cắt rời ADN ở vị trí này. Khi sử
dụng 1 hay nhiều enzym giới hạn, chúng sẽ tìm đúng vị trí đặc hiệu để cắt và cho
những đoạn ADN dài ngắn khác nhau. Bất kỳ có sự biến đổi nào trong hệ gen (sự
đảo gen, thêm bớt ADN, đột biến điểm, tăng giảm các cấu trúc lặp ), đều dẫn đến
sự thay đổi các điểm cắt, và do vậy, khi dùng phương pháp RFLP sẽ cho bản đồ
enzym hạn chế khác biệt. Cá thể đó đã có sự biến đổi di truyền nhất định, hay nói
cách khác đã có thể thuộc biến chủng khác.
Phương pháp RFLP dễ làm, cho độ chính xác cao và có thể thực hiện trên
ADN của nhiều cá thể trong thời gian ngắn. Một điều cần chú ý là đôi khi ngẫu
nhiên có 2 hay nhiều đoạn ADN bằng nhau, rất khó phát hiện độ dài trên thạch
agarose.
Sau khi xử lý kết quả nhiều lần bằng phương pháp RFLP, mỗi một hệ gen
của mỗi một cá thể thuần chủng sẽ cho một bản đồ gen xác định và giống nhau.
Ngược lại, khi bị biến đổi, các cá thể biến chủng sẽ cho bản đồ RFLP khác nhau.
Độ sai khác càng xa thì sự biến chủng càng lớn. Khi độ sai khác cao hơn mức xác
định, các cá thể này đã có thể thuộc về chủng khác khi xem xét phân loại.
Phương pháp phân tích trực tiếp ARN
Nhiều nghiên cứu đã sử dụng axit ribonucleic (ARN) ribôxôm của hệ gen
làm đối tượng phân tích để giám định và phân loại sinh vật. ARN ribôxôm sao
chép dưới dạng sợi đơn, nên cần phải chuyển đổi trở thành ADN bằng enzym sao
chép ngược (reverse transcriptase) và sử dụng các primer thông thường để phân
tích trật tự nucleotide. Tuy được sử dụng khá phổ biến, nhưng do tính phức tạp, và
gần đây do kỹ thuật phân tích ADN trực tiếp được sử dụng thông dụng hơn,
phương pháp này đã không còn chiếm vị trí quan trọng nữa. Hơn nữa, ARN
nghiên cứu đòi hỏi phải tinh kiết, phải tách chiết trực tiếp từ tế bào sống, rất khó
thu nhận với số lượng lớn.
NHỮNG PHƯƠNG PHÁP DỰA TRÊN KỸ THUẬT PCR

Phản ứng PCR
Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng rộng rãi từ những
năm đầu 1990, và thực sự là phương tiện có hiệu quả trong nghiên cứu di truyền
phân tử của các loài. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN làm khuôn (tinh khiết hoặc hỗn
hợp), PCR có thể nhân lên hàng triệu bản sao ADN vùng cần nghiên cứu. Thông
thường, nếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn giản, đoạn ADN thu nhận được có độ dài
cao nhất đến 2.000-3.000 nucleotide. Nếu áp dụng kỹ thuật PCR hiện đại, với
enzym chịu nhiệt cao và bền, có thể thu nhận ADN có độ dài đến trên 10.000,
thậm chí đến 20.000 nucleotide.
PCR là phản ứng enzym xúc tác của enzym ADN polymeraza chịu nhiệt, sử
dụng nhiều nhất là Taq polymearase (phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus), trong môi trường có nồng độ ion Magiê (Mg
++
) thích hợp, với các
thành phần dẫn chất nucleotide đầy đủ làm nguyên liệu, có hai đoạn ngắn
nucleotide làm mồi (gọi là oligo hay primer). Phản ứng sẽ tiến hành tổng hợp các
đoạn ADN tương ứng trên khuôn ADN, trong giới hạn giữa các primer. Sự tổng
hợp ADN tăng theo cấp số 2
n
, sau 25-40 chu kì, sẽ cho số lượng ADN là hàng
triệu bản sao. Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hoá,
nên không tốn công sức. Hiện nay, đã có máy phân tích trật tự nucleotide tự động
(automated sequencer), nên sản phẩm PCR sau khi được làm sạch, sẽ được phân
tích ngay rất thuận lợi cho nghiên cứu.
Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với lượng lớn, nên có thể sử dụng trực
tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn, mà không cần phải nuôi cấy (đối với KST chẳng
hạn), do vậy loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường đối với đối tượng nghiên
cứu. Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phân tử phải được chú ý, tránh lẫn tạp
nhiều loại ADN khác nhau
(9)

.
Có nhiều loại PCR, trong đó có PCR thông thường và PCR đặc biệt. PCR thông
thường (conventional PCR) là sử dụng 1 cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR thu được có
độ dài vài trăm đến vài nghìn nucleotide. PCR đặc biệt trước hết phải kể đến:
i) PCR dài (long PCR): cho sản phẩm vài chục nghìn nucleotide, thành
phần tham gia đòi hỏi tinh khiết, chọn lọc, có tính năng cao, thường được sử dụng
trong nghiên cứu giải mã hệ gen.
ii) PCR lồng (nested PCR): Có PCR lồng đơn (sử dụng 1 cặp mồi); bán lồng
(semi-nested PCR) sử dụng 3 mồi; và lồng hoàn toàn (fully nested PCR) sử dụng 2
hay nhiều cặp mồi. PCR lồng đảm bảo cho sản phẩm tin tưởng và ADN sinh ra ở chu
kỳ trước là nguồn khuôn tiếp cho các chu kỳ sau của PCR.
iii) PCR đơn, kép và đa năng: PCR đơn (uniplex-PCR) sử dụng 1 cặp mồi,
tìm kiếm sản phẩm trên 1 nguồn khuôn từ 1 loại (vi) sinh vật; PCR kép (duoplex-
PCR) sử dụng 2 cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm trên 2 nguồn khuôn từ 2 loại (vi) sinh
vật; PCR đa năng (multiplex-PCR) sử dụng nhiều cặp mồi, tìm kiếm sản phẩm
trên nhiều nguồn khuôn khác nhau, do đó cùng lúc chẩn đoán, phát hiện nhiều loại
(vi) sinh vật khác nhau.
iv) PCR khác: Ngoài ra còn nhiều loại PCR sử dụng mồi không đặc hiệu,
hoặc PCR cực đại (mega PCR), PCR tăng /giảm, PCR định lượng (Real-time
PCR), PCR xác suất
Phương pháp RFLP -PCR
Như trên đã trình bày, RFLP là phương pháp dùng enzym giới hạn cắt ADN hệ
gen của cá thể, lập bản đồ gen để nghiên cứu. RFLP -PCR cũng là phương pháp dùng
enzym giới hạn, nhưng chỉ để cắt một phần hệ gen, là đoạn ADN thu nhận được qua
phản ứng PCR. Như vậy, các phân đoạn ADN được cắt ngắn hơn, chính xác hơn, bản
đồ gen chi tiết hơn, nên những thay đổi nhỏ ảnh hưởng đến phân đoạn ADN của hệ gen
cũng được phát hiện dễ dàng hơn. Đây là phương pháp dễ làm, đơn giản, các đoạn
ADN sau khi cắt được nhuộm bằng Ethidium Bromide, một loại hoá chất phát hiện
ADN khi xem dưới tia cực tím, sau khi chạy điện di trên thạch agarose. Đối với phương
pháp RFLP, lượng ADN nghiên cứu cần rất nhiều, nhưng với phương pháp RFLP-

PCR, chỉ cần một lượng nhỏ (nanogam) cũng đủ, vì ADN của vùng cần nghiên cứu có
thể thu được một lượng lớn qua phản ứng PCR.
Bằng phương pháp này, nhiều nhóm KST đơn bào (Protozoa) và một số sán
lá đã được nghiên cứu và cho bản đồ gen từng vùng của hệ gen.
Phương pháp RAPD phân tích biến thái ADN bằng phản ứng PCR xác
suất
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), thực chất là
phản ứng PCR nhân các vùng ADN bằng các primer không hoàn toàn đặc hiệu.
Cùng lúc, các cặp primer đó, sẽ cho các đoạn ADN khác nhau, được nhân lên có
tính chất xác suất (không hoàn toàn được xác định trước). Mặc dù vậy, hai cá thể
có tương đồng về di truyền và thuần chủng, sẽ cho số lượng, độ dài các đoạn ADN
tương đương, khi sử dụng các cặp primer như nhau và phản ứng PCR thực hiện
trong điều kiện như nhau. Nếu có sự sai khác (số lượng và độ dài) của sản phẩm
PCR, chắc chắn giữa các cá thể đó đã có sự biến đổi nhất định trong hê gen của
chúng. Tương tự, những cá thể lai thuần sẽ cho bản đồ sản phẩm PCR giống nhau,
lai tạp sẽ cho bản đồ PCR khác nhau.
Khác với PCR đặc hiệu, PCR xác suất (RAPD) sử dụng các cặp primer
không hoặc kém đặc hiệu và ngắn (thông thường 10-12 nucleotide). Các primer
này được tổng hợp dựa trên chuỗi nucleotide bảo tồn trong loài, do vậy, phương
pháp RAPD được sử dụng nghiên cứu cho nhiều chủng trong loài, có tính chất đa
dụng hơn các phản ứng PCR đặc hiệu khác.
Cũng do tính kém đặc hiệu của primer, nên phương pháp RAPD có yếu thế
là nếu sử dụng ADN có lẫn tạp sẽ cho sản phẩm PCR lẫn tạp rất phức tạp khi đánh
giá kết quả. Do vậy, phương pháp RAPD phải được sử dụng một cách thận trọng
trong nghiên cứu sinh học phân tử KST, vì KST là thực thể dễ lẫn tạp với nhiều
loại sinh vật khác, dễ lẫn tạp với vật chủ và môi trường.
Tuy vậy, các phương pháp RFLP, RFLP-PCR và RAPD là những phương
pháp ưu việt trong nghiên cứu giám định, phân loại sinh vật nói chung và KST nói
riêng. Các phương pháp này còn được coi là phương pháp tìm dấu di truyền học
phân tử của loài (DNA finger-printing), kể cả xét nghiệm hình sự ở người và phân

loại nhân chủng học.
Trong nghiên cứu KST, bằng các phương pháp này, đã có một số kết quả
về tính đa dạng sinh học của một số loài cơ bản như: Schistosoma,
Cryptosporodium, Plasmodium