Cơ chế phân tử của sao chép DNA pps

Cơ chế phân tử của sao
chép DNA

1. Nguyên tắc chung

- DNA sao chép theo khuôn.

Ưu điểm:
+ Với phân tử lớn như vậy thì việc tổng hợp
theo khuôn sẽ chính xác hơn
+ Tiết kiệm được ezyme

+ Đạt hiệu quả nhanh

- Sao chép theo nguyên tắc bán bảo tồn
(semi-conservative) phân tử DNA mới được
tổng hợp gồm một mạch cũ làm khuôn và một
mạch mới tổng hợp

- Quá trình tổng hợp DNA xảy ra đòi hỏi phải
có “ mỗi “ (primer)

- Quá trình tổng hợp xảy ra theo chiều 5' - 3'.



2. Thí nghiệm tổng hợp nhân tạo DNA

Kornberg (1956) thực hiện phản ứng tổng hợp
DNA in vitro. Trong quá trình tổng hợp ông sử
dụng DNA polymerase I, 4 loại

desoxynucleotid triphosphate (ATP, GTP,
CTP, TTP), Mg2+ làm xúc tác. Ngoài ra còn
có ít DNA làm khuôn mẫu.

3. Thí nghiệm chứng minh có sự tự nhân
đôi theo nguyên tắc bán bảo tồn

Meselson, Stahl (1958) đã chứng minh kiểu
sao chép bán bảo tồn. Nuôi E.coli nhiều thế hệ
trên môi trường có nguồn nitơ đồng vị nặng
N15. Như vậy tất cả DNA của vi khuẩn đều
mang đồng vị nặng N15 thay cho N14 bình
thường. Sau đó tế bào được chuyển sang môi
trường chỉ chứa N14 nhẹ, mẫu các tế bào
được lấy ra theo những khoảng thời gian đều
đặn và chiết tách DNA. Bằng phương pháp
ly tâm trên thang nồng độ CsCl, các loại
DNA nặng, nhẹ và lai được tách ra.


Kết quả cho thấy DNA nặng ban đầu (thế hệ
0) chứa N15, sau một lần phân chia cho thế
hệ I với DNA lai có tỷ trọng nằm giữa DNA
nặng N15

và DNA nhẹ N14. Nói cách khác sau một lần
sao chép phân tử DNA mới chứa một nữa
mang N15 và một nữa N14. Ở thế hệ II
một nữa số phân tử DNA là lai, nữa còn lại
là DNA nhẹ N14. Thí nghiệm này khẳng định

giả thuyết của Watson và Crick là đúng tức 2
mạch DNA mẹ tách ra, mỗi cái làm khuôn để
tổng hợp nên mạch mới bổ sung.

4. Diễn biến sao chép DNA ở nhiễm sắc thể
E.coli

Quá trình sao chép DNA ở E.Coli diễn ra qua
hai giai đoạn:

4.1. Giai đoạn khởi sự (initiation)

+ Mở xoắn:

Ở E.coliquá trình bắt đầu khi một protein B
đặc hiệu nhận biết điểm khởi sự sao chép
(replication orgine) ori và gắn vào trình tự
base đặc biệt đó. Tiếp theo enzyme gyrase
(một loại topoisomerase) cắt DNA làm tháo
xoắn ở 2 phía của protein B. Trong khi 2
phân tử enzyme gyrase chuyển động ngược
chiều nhau so với điểm ori thì 2 phân tử của
enzyme helicase tham gia tách mạch tạo chẻ
ba sao chép. Helicase sử dụng năng lượng
ATP làm đứt các liên kết hydro giữa 2 base
bắt cặp với nhau.

+ Các protein làm căng mạch SSB
(single-strand binding protein) gắn vào các
mạch đơn DNA làm chúng tách nhau, thẳng ra

và ngăn không cho chập lại hoặc xoắn để việc
sao chép được dễ dàng.

+ Tổng hợp mồi (primer) dặc trưng cho quá
trình kéo dài chuỗi là

DNA polymerase chỉ hoạt động khi đã có mồi,
nên trước khi tổng hợp chuỗi

thì phải có qua trình tổng hợp mồi. Mồi là một
đoạn khoảng 9 -10 nu, có thể là DNA hoặc
ARN.

4.2. Giai đoạn nối dài (elongation)

Do tính chất đối song song nên khi tách ra
thành 2 mạch đơn khuôn thì một mạch có đầu
3’, mạch kia có đầu 5’ nên để đảm bảo hướng
sao chép của DNA theo chiều 5’ -3’ thì sự
polymer hóa dựa vào 2 mạch khuôn DNA diễn
ra khác nhau.

Mạch khuôn có đầu 3’ được DNA polymerase
III gắn vào và tổng hợp ngay mạch bổ sung
5’-3’ hướng vào chẻ ba sao chép. Mạch
khuôn này được gọi là mạch khuôn trước, còn
mạch mới được tổng hợp gọi là mạch trước
(leading strand).

Ở mạch có đầu 5’ (mạch khuôn sau) việc tổng

hợp phức tạp hơn và thực hiện từ chẻ ba sao
chép hướng ra ngoài để đảm bảo đúng hướng
5’-3’. Khi mạch kép tách ra ở gần chẻ ba
sao chép , enzyme primase gắn mồi
(primer) ARN khoảng 10 nucleotid có trình
tự bổ sung với mạch khuôn. DNA-
polymerase III nối theo mồi ARN, theo hướng
ngược với chẻ ba sao chép, tổng hợp các
đoạn ngắn 1000-2000 nucleotid, gọi là các
đoạn Okazaki (người phát hiện là Reiji
Okazaki). DNA polymerase nối dài đoạn
Okazaki đến khi gặp ARN mồi phía trước thì
dừng lại, rồi lùi ra sau tiếp tục tổng hợp từ
ARN mồi mới được tạo nên gần chẻ ba
sao chép.
Tiếp theo DNA-polymerase I nhờ hoạt
tính exonuclease 5’-3’ cắt bỏ mồi ARN,
lắp các nucleotid của DNA vào chỗ trống
và thực hiện polymer hóa hướng 5’-3’.
Đoạn DNA ngắn 10 nucleotid này còn hở
2 đầu, chỗ hở được nối nhờ enzyme
ligase của DNA mạch được tổng hợp từ chẻ
ba sao chép hướng ra ngoài được tổng hợp
chậm hơn nên gọi là mạch sau (lagging
strand).

Quá trình sao chép DNA ở E.coli diễn ra với
tốc độ rất nhanh, có thể đạt đến 50.000
nucleotid/phút.