Tiểu luận enzyme giới hạn (2)

Bài tiểu luận:enzym giới hạn
Giảng viên:Nguyễn Thị Vân Anh
Sinh viên: Trần Thị Nhàn
Trần Thị Mỹ Nhung

Giới thiệu

Khái niệm

Hiện tượng giới hạn

Phân loại

Vị trí điểm cắt

ứng dụng

1.Khái niệm:

Enzyme giới hạn (restriction enzyme,RE) là một
enzyme endonụleae có vị trí nhan biết điểm cắt DNA
đặc hiệu.

Những enzyme này phân huỷ lien kết phosphodieste
của bộ khung DNA mạch đôi mà không gây tổn hại
đến bases.

Hiện tượng giới hạn

Thuật ngữ giới hạn xuất phát từ việc các enzyme này

được khám phá từ các chủng E. coli mà đang hạn chế
sự phát triển của các thực khuẩn thể“

Vì thế enzyme giới hạn được cho là cơ chế của vi
khuẩn nhằm ngăn chặn sự tấn công của virus và giúp
loại bỏ các trình tự của virus.


Nguyên nhân của hạn chế là enzyme do vi khuẩn sản
sinh ra ,phân giải DNA của phage trước khi chúng tự tái
sinh và tống hợp nên hạt phage mới

DNA của vi khuẩn không bị phân giải vì các base
nitrogene ở trình tự nhận biết đã bị methyl hoá nên
enzyme không còn nhận ra được vị trí cắt.Những
enzyme phân giải này được gọi là enzyme hạn chế.

Enzym giới hạn được gọi tên dựa vào vi khuẩn mà
chúng được phân lập


Thí dụ minh hoạ

Enzyme Source Recognition Sequence Cut

EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 5' G AATTC
3'

3'CTTAAG 3' CTTAA G 5'


BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 5' G GATCC
3'

3'CCTAGG 3' CCTAG G 5'

HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 5' A AGCTT 3'

3'TTCGAA 3' TTCGA A 5'

MstII Microcoleus species 5'CCTNAGG

3'GGANTCC

TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 5' T CGA 3'

3'AGCT 3' AGC T 5'

NotI Nocardia otitidis 5'GCGGCCGC

3'CGCCGGCG

HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTC

3'CTNAG

Phân loại

Đã có hơn 1200 enzim hạn chế khác nhau

Các nhà sinh hóa chia enzyme cắt giới hạn nói chung

thành 3 loại : Loại I, Loại II và Loại III

Loại I và loại III có ý nghĩa rất giới hạn đối với công nghệ
sinh học.Ngược lại loại II là những enzyme cắt rất quan
trọng đối với tạo dòng DNA.

Loại I và III, cả hoạt tính phân giải acid nucleic hay phân
giải nhóm methyl đều thực hiện chung bởi một phức hợp
enzyme lớn.Chúng cũng cần ATP để hoạt động.


Enzyme giới hạn loại II, chức năng phân giải của nó
không liên qua đến chức năng methyl hóa hay phân giải
nhóm methyl

Ngày nay người ta biết rất nhiều enzyme khác nhau loại
này và chúng là một trong những công cụ sinh học phân
tử thiết yếu, đặc biệt thường gặp trong các ứng dụng
dòng hóa gene hay phân tích DNA

Vị trí điểm cắt

Enzyme giới hạn chỉ cắt các trình tự lặp đối xứng khi đọc
theo chiều 5´-3´ trên mạch DNA (palindrome) gọi là trình
tự nhận biết. Vị trí điểm cắt của enzyme giới hạn có thể
nằm trong hoặc ngoài trình tự nhận biết này
M Hình 1: Trình tự vùng cắt gắn đa vị
của vectơ pMAL-c2

Đối với tạo dòng điều quan trọng là đoạn cắt được

tạo ra từ enzyme hạn chế như thế nào

Một số enzyme tạo ra các vết cắt trên mạch đối diện tức
thời, tạo ra các đoạn DNA "đầu bằng (blunt)".
Alul

-N-N-A-G-T-N-N = -N-N-A-G C-T-N-N
-N-N-T-C-G-A-N -N-N-T-C G-A-N-N

Hầu hết các enzym đều tạo ra các vết cắt hơi chéo nhau
(hình chữ chi), tạo ra các "đầu dính"(đầu lệch).

-N-N-G-A-A-T-T-C-N-N -N-N-G A-A-T-T-C-N-N

-N-N-C-T-T-A-A-G-N-N -N-N-C-T-T-A-A G-N-N


Số vị trí nhận biết của enzyme hạn chế
trong phân tử DNA

Chúng ta có thể ước lượng được tần suất cắt DNA
khi biết được kích thước của vị trí cắt. Có 4 loại
nucleotit cấu tạo nên DNA nên khẳ năng căt xảy ra ở
bất kì 1 loại nucleotit nào là 1/4.Trong trường hợp
kích thước của vị trí cắt có 4 nucleotit thì xác suất
cắt xảy ra ở bất kì vị trí nào đó là 1/4*1/4 *1/4*1/4
=1/256 ,có nghĩa là cứ trung bình 256bp có một lần
cắt



* Đoạn bổ sung và đoạn nối
Vì các enzyme giới hạn khác nhau ở các
trình tự nhận biết và điểm cắt, nên chiều
dài và trình tự chính xác của đầu dính
"nhô ra", cũng như không biết nó có phải
là mạch đầu 5' hay đầu 3' mà những phần
nhô ra phụ thuộc vào enzyme tạo ra sản
xuất ra nó.

Kết quả điện di ADN plasmid sau khi cắt bằng các enzyme EcoR I và Hind
III

IV.ứng dụng

Việc xác định chính xác từng loài vi khuẩn
khác nhau được thực hiện nhờ enzym giới
hạn. Enzym giới hạn là một loại protein có
khả năng nhận ra và cắt phân tử ADN ở
những vị trí đặc hiệu.

Với từng loài vi khuẩn do sự khác nhau ở
những vị trí nucleotid nhất định là vị trí nhận
biết và cắt của enzym giới hạn sẽ tạo nên sự
khác nhau về độ dài và kích thước của các
đoạn ADN do enzym giới hạn để lại.


Một enzym giới hạn là Hae III nhận ra trình tự nucleotid
là GGCC đã được sử dụng để phân tích sự đa hình độ
dài đoạn cắt giới hạn trên đoạn ADN là sản phẩm PCR


Việc phát hiện ra enzyme gioi hạn của vi khuẩn cắt
AND ở những trình tự đặc trưng , đã giúp cho việc thao
tác gen dễ dàng hơn ,vì nó có thể giảm chiều dài của
các phân tử AND thành một tập hợp bao gồm các đoạn
ngắn hơn .

Các enzyme hạn chế hiện diện trong hầu hết các tế
bào vi khuẩn để ngăn cản AND ngoại lai tiếp quản bộ
máy tổng hợp protein của tế bào

.


XIN CẢM ƠN CÔ VÀ CÁC BẠN ĐÃ
CHÚ Ý LẮNG NGHE