Tiểu luận kỹ THUẬT điện DI TRÊN GEL AGAROSE

1
Trường: ĐH Nông Lâm Huế
Khoa : Cơ Khí – Công Nghệ
GVHD : Nguyễn Thị Vân Anh
Lớp : BQ 41
Nhóm : 3
2
Thành viên thực hiện:
1. Nguyễn Ngọc Phải
2. Võ Thị Bích Chi
3. Trần Thị Hiền
4. Trần Thị Liên
5. Chế Thị Nga
3
1. Điện di là gì?
Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các
vật thể mang điện tích dưới tác động của điện
trường. Sự dịch chuyển này do thành phần lực
điện trong lực Lorentz.
Điện di hay điện di trên gel (electrophoresis hay
gel electrophoresis) áp dụng trong sinh học phân
tử là một kĩ thuật để phân tích các phân tử DNA,
RNA hay protein dựa trên các đặc điểm vật lý của
chúng như kích thước, hình dạng hay điểm đẳng
điện tích (isoelectric point).
4
2.Cách tiến hành điện di trên gel-agarose:
a. Chuẩn bị dung dịch đệm và bản gel:

Dung dịch đệm thường sử dụng trong điện di
agarose và polyacrymid là TBE(Tris-Boric acid-

EDTA) và TAE(Tris-Acetic acid-EDTA)

Bản gel được chuẩn bị bằng dung dịch đệm 1x
TBE hòa tan với hàm lượng agarose cần thiết đặt
trong lò vi sóng hoặc đun nóng đến khi tan hoàn
toàn,đổ vào khuôn có các lượt cài sẵn để tạo bản
gel với số giếng nạp mẫu cần thiết.

Khi bản gel đã đông cứng,đặt bản gel vào
buồng điện di,đổ dung dịch đệm ngập bản gel
khoảng 1-2mm
5
b. Nạp mẫu:
Mẫu ADN được tách chiết enzym giới hạn cắt
thành các đoạn có kích thước nhỏ, được trộn đều
vào đệm nạp mẫu có thêm chất màu tạo thành
hỗn hợp có màu xanh để kiểm tra kích thước các
đoạn AND thường chạy đồng thời cùng với mẫu
AND chuẩn.
c. Chạy điện li:
Trong điện li thường sử dụng nguồn điện thế
100V, cường độ 100mmA, thời gian chạy điện ly
trong khoảng 40 phút đến 1-2 giờ.Tùy theo chiều
dài bản gel và mật độ yêu cầu tachf các phân
tử(có thể dựa vào vị trí các vạch màu, khi các
vạch màu chạy được khoảng ¾ chiều dài bản gen
có thể kết thúc điện di).
6
d. Nhuộm bản gen và soi gen:


Kết thúc điện di, bản gen được lấy ra nhuộm
Ethyldium-bromid hoặc các phương pháp
nhuộm khác.

Bản gen sau khi nhuộm ETBR được đặt vào
máy có tia soi UV, để quan sát kết quả điện di, vị
trí các đoạn điện di theo kích thước khác nhau,
quan sát được những vệt sáng màu đỏ cam trên
bản gel hoặc đặt bản gel vào các thiết bị chụp
ảnh chuyên dùng để chụp ảnh.Trường hợp
nhuộm bạc hoặc nhuộm SYBR-GREEN có thể
xác định kết quả bằng mắt thường
7
3. Cách đổ gel-agarose
3.1. Chế tác gel agarose:
3.1. Chế tác gel agarose:

Dưới đây là phương pháp chế gel agarose điện di DNA:
3.1.1 Cho đủ lượng agarose (Seakem Agarose, Nusieve Agarose )
cần pha vào dung dịch TAE 1× trong một bình tam giác theo bảng
dưới đây để có độ phân li nucleic acid thích hợp. Để có dung dịch
TAE 1× cần cho thêm 19 lần nước khử ion vào dung dịch gốc
TAE 20×.
Nồng độ agarose (%) Độ lớn DNA phân li (kb)
0,3 60 - 5
0,6 20 - 1
0,7 10 - 0,8
0,9 7 - 0,5
1,2 6 - 0,4
1,5 4 - 0,2

2,0 3 - 0,1
8
3.1.2 Gia nhiệt bằng cách hấp 5 phút
trong nồi hấp cao áp ở 115 °C hoặc bằng
vi sóng.
 Chú ý khi dùng lò vi sóng cần quan
sát để tránh trào gel ra ngoài, nên chờ
đến khi gel sôi thì cắt điện, lấy ra (coi
chừng bỏng) lắc đều rồi cho vào làm sôi
lần nữa. Lặp lại ba lần cho agarose tan
hoàn toàn.
9
3.1.3 Cho vào chậu bảo ôn ~50 °C cho đến khi
dịch gel đạt đến khoảng 50 -60 °C (tay chạm
vào được) thì cho vào gel một lượng dung dịch
ethidium bromide để có hàm lượng cuối cùng
của chất màu này là 50 μg/ml. (Nếu không cho
ethidium bromide vào gel lỏng trước khi rót gel
vào khuôn thì ngâm bản gel vào dung dịch này
sau khi đã điện di).
10
3.1.4 Rót gel vào khuôn đã được chắn
hai đầu bằng băng dán hoặc bằng kẹp, đã
cài sẵn lược (comb) và đặt trên mặt phẳng
(xác định bằng thủy bình kế,tức ligô).
3.1.5 Chờ cho đến khi gel rắn hoàn toàn
thì cẩn thận tháo lược ra khỏi gel.
11
12
3.2. Điện di agarose

3.2.1 Tháo bản gel ra khỏi kẹp hoặc băng chắn, đặt
khuôn gel trong chậu điện di ngang, rót dung dịch đệm
vào cho ngập gel.
 chú ý đầu có lỗ lược nằm ở phía cathode.
3.2.2 Pha nucleic acid cần điện di với dung dịch màu tải
mẫu (điện di) 6× hoặc bằng hợp chất màu tương tự.

Dịch màu có tỷ trọng cao này giúp nucleic acid không
bị xáo động bởi dòng đối lưu của dung dịch nên khi tải
vào lỗ răng lược thì nằm gọn trong đó và có màu rõ
ràng.

Dung dịch màu tải mẫu 6× (dịch nạp mẫu) chứa 30%
glycerol, 0,25% bromophenol blue (BPB) và 0,25%
xylencyanol (XC).
13
3.2.3 Bằng micropipet hút mẫu DNA nhỏ vào lỗ răng
lược.
3.2.4 Bật điện một chiều để thực hiện điện di. Cường độ
dòng điện khoảng 50-150 V tùy loại thiết bị điện di.Thời
gian điện di thay đổi phụ thuộc vào độ lớn của DNA,
nồng độ agarose của gel và cường độ dòng điện.



Chú ý:
Chú ý: lượng DNA có thể điện di trong mỗi lỗ răng lược
nhiều ít tùy kích thước răng lược, nếu quá nhiều sẽ xuất
hiện hiện tượng "tailing" (kéo đuôi) khó phân li.
14

3.3 Kiểm tra băng DNA:
3.3.1 Nếu điện di DNA trong gel có pha sẵn
ethidium bromide thì chiếu tia tử ngoại.
3.3.2 Nếu không cho trước ethidium bromide
thì sau khi điện di cần ngâm gel 30 - 60 phút
trong dung dịch thuốc nhuộm này ở nồng độ
0,5 μg/ml.
15
3.3.3 Nếu cần chụp ảnh lưu tư liệu thì có thể dùng
máy ảnh pollaroid với ống kính có phin lọc ánh
sáng thích hợp với film pollaroid 667, hoặc dùng
thiết bị phân tích gel số hóa (gel documentation
system).
Chú ý: Đèn tử ngoại (UV) có hai loại bức xạ với
bước sóng 254 nm (UV sóng ngắn) và 366 nm
(UV sóng dài). UV sóng ngắn giúp quan sát rõ
DNA nhưng làm tổn hại cấu trúc chất này, cho
nên nếu cần thu hồi DNA từ gel thì không nên áp
dụng.
16
17
4.Ứng dụng:
Phát hiện các ADN trên gel.
Để phát hiện và xác định ADN trong tế bào VSV,
TV-ĐV.
Điện li thuốc trị liệu: là phương pháp dùng dòng
điện một chiều để di chuyển một số ion thuốc có
tác dụng chữa bệnh cho cơ thể.
Ngoài ra còn được dùng trong việc nghiên cứu
để phát hiện ra một số loại virut gây bệnh: VR

viên gan B, VK lao, phát hiện ra Samolnela trong
sản phẩm thủy sản…
18
CÁM ƠN CÁC BẠN
ĐÃ LẮNG NGHE!!!