TUYỂN CHỌN, NUÔI cấy CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG hợp ENDO β 1,4 GLUCANASE và xác ĐỊNH TÍNH CHẤT lý hóa của nó

ĐẠI HỌC THÁI
NGUY
Ê
N
TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
P
HẠM
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP
EN
DO-
β
-1,4-
G
LU
C
A
N
A
SE
VÀ XÁC
Đ
Ị
N
H
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA
N
Ó
L

UẬ
N
VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH
HỌ
C
HÀ NỘI
-2009
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
t

nu . e

du . v

n
ĐẠI HỌC THÁI
NGUY
Ê
N
TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
P
HẠM
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP
EN
D
O
-

β
-1,4-
G
LU
C
A
N
A
SE
VÀ XÁC
Đ
Ị
N
H
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA
N
Ó
Chuyên ngành:
Sinh
học thực nghiệ
m
L
UẬ
N
VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH
HỌ
C
Thực
hiện
tại: Viện

Công nghệ
Sinh
học
Viện Khoa
học
và
công nghệ
V
i
ệ
t
Nam
HÀ NỘI
-2009
MỤC
L
ỤC
MỞ ĐẦU
1
CHƢƠNG
I. TỔNG QUAN TÀI
L
I
Ệ
U


2
1.1. ĐỊNH NGHĨA
2

1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN
L
O
Ạ
I


2
1.2.1.
Nguồn
g
ốc

2
1.2.2. Phân
loại enzyme
3
1.3. CẤU
TRÚC 5
1.3.1.
Cấu trúc bậc
nhất
5
1.3.2.
Cấu trúc không gian
6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC
8
1.5. Khái
quát

về Aspergillus oryzae
10
1.6.
Ứng dụng
11
1.6.1.
Trong
công nghiệp sản xuất giấy
và
bột
giấy 11
1.6.2.
Trong
công nghiệp chế
b
i
ế
n

thực
phẩ
m

12
1.6.3.
Trong
công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nu
ô
i

13
1.6.4.
Trong
công nghiệp sản xuất dung
m
ô
i

hữu cơ

14
1.6.5.
Trong
công nghệ
sử lý
rác
t
h
ả
i
và
sản xuất phân bón
vi
sinh

14
1.7. ẢNH
HƢỞNG
CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ
N

Ă
NG
SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE
16
1.7.1.
Nguồn
c
a
r
bo
n

16
1.7.2.
Nguồn nitrogen
17
1.7.3.
Nh
i
ệ
t

độ
nu
ô
i

cấy
18
1.7.4. Ảnh

hƣởng của
pH
m
ô
i

t
r
ƣ
ờ
ng

18
1.8. TÍNH CHẤT
LÝ
HÓA CỦA
ENZYME
19
1.8.1. Ảnh
hƣởng của nhiệt độ
19
1.8.2. Ảnh
hƣởng của pH
20
1.8.3. Ảnh
hƣởng của các
i
o
n
kim

l
oạ
i


20
1.8.4. Ảnh
hƣởng của dung
m
ô
i

hữu
cơ và
các chất tẩy rửa
21
Chƣơng
2. NGUYÊN
LIỆU
VÀ
PHƢƠNG
PHÁP

22
2.1. NGUYÊN
LIỆU
VÀ HÓA CHẤT

22
2.1.1.

Chủng
gi
ố
ng


22
2.1.2.
Thiết
bị
22
2.1.3.
Hóa
c
h
ấ
t


22
2.1.4.
Dung
d
ị
c
h
và
đệm phá tế bào

23

2.1.5. Môi
tr
ƣ
ờ
ng


24
2.2.
PHƢƠNG
P
HÁ
P


25
2.2.1.
Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme

25
2.2.2.
Định tính
endo-β-1,4-glucanase
25
2.2.3. Xác
định hoạt tính
endo-β-1,4-glucanase
25
2.2.4.
Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố

m
ô
i

t
r
ƣ
ờ
ng

l
ê
n

khả năng
sinh
tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase

27
2.2.5.
Tinh sạch sơ
bộ
endo-β-1,4-glucanase

29
2.2.6.
Điện
di
S

D
S
-PAGE


30
2.2.7. Xác
định tính chất
lý
hóa của
e
n
do
-
β
-1,4-glucanase
30
2.2.8. Các
ph
ƣ
ơ
ng

pháp sinh học phân tử


32
Chƣơng
3:
KẾT QUẢ VÀ THẢO

LUẬN

36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh
tổng
hợp
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase cao

36
3.2.
Phân
loại
chủng nấm
sợi A. oryzae
VTCC-F-045
dựa vào đoạn gene
28S
rRNA
37
3.3. Tối
ƣu các
đ
i
ề

u

kiện sinh
tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase
39
3.3.1. Khả
năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo
t
h
ờ
i

gian
39
3.3.2. Ảnh
hƣởng của nồng độ
cơ
chất cảm
ứng
40
3.3.3. Ảnh
hƣởng của nguồn
carbon
41
3.3.4. Ảnh
hƣởng của nồng độ
c
a
r

bo
n


43
3.3.5. Ảnh
hƣởng của nguồn nitrogen

44
3.3.6. Ảnh
hƣởng của nồng độ nitrogen

45
3.3.7.
Nh
i
ệ
t

độ
nu
ô
i

cấy

46
3.3.8. Ảnh
hƣởng của
pH

nu
ô
i

c
ấ
y


47
3.4. Tinh
sạch sơ bộ
e
n
do
-
β
-1,4-glucanase


48
3.5. Tính
chất
lý
hóa của
e
n
do
-
β

-1,4-glucanase


50
3.5.1.
Nh
i
ệ
t

độ phản ứng
tố
i

ƣ
u


50
3.5.2.
pH phản ứng
t
ố
i

ƣ
u

51
3.5.3. Độ

bền nhiệt

52
3.5.4. Độ
bền
pH


54
3.5.5. Ảnh
hƣởng của dung
m
ô
i

hữu
cơ

55
3.5.6. Ảnh
hƣởng của một số chất tẩy rửa

56
3.5.7. Ảnh
hƣởng của
i
o
n
kim
loại

57
KẾT
LUẬN
VÀ KIẾN NGHỊ

59
KẾT
L
U
Ậ
N

59
KIẾN NGHỊ

59
TÀI
LIỆU
THAM KHẢO

61
TIẾNG
VIỆT

61
TIẾNG
A
N
H

64
PHỤ
LỤC

69
DANH MỤC CÁC
B
ẢN
G
Bảng 2.1. Thiết
bị
đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
22
Bảng 2.2.
Các
hóa chất đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
23
Bảng 2.3. Danh sách các dung
d
ị
c
h
và
đệm đƣợc sử dụng trong thí nghiệm
23
Bảng 3.1. Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của
35
chủng

A.
oryzae

37
Bảng 3.3.
Ảnh
hƣởng của nguồn carbon đến
khả
năng sinh tổng hợp
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 42
Bảng
3.2. Tóm
tắt
quá trình
tinh
sạch
endo-β-1,4-glucanase
từ
chủng A.
oryzae
VTCC-F-045 49
Bảng 3.4.

Ảnh
hƣởng
của ion kim loại lên
độ bền endo-β-1,4-glucanase
c
ủ
a
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045

57
Bảng
4.
1
.

Đƣờng chuẩn
glucose
69
Bảng 4.2.
Trình
tự nu
c
l
e
ot
i
de
của

đoạn gene
28S rRNA từ
chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045

69
Bảng 4.3.
Khả
năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo
t
h
ờ
i

gi
a
n

70
Bảng
4.4. Ảnh
hƣởng
của
nồng
độ CMC tới khả năng sinh
e
n
do

-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 70
Bảng
4.5. Ảnh
hƣởng
của
nguồn cacbon
tới khả năng sinh
endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 71
Bảng
4.6. Ảnh
hƣởng
của
nồng
độ
l
a
c
t
o
s
e
tới khả

năng
sinh
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 71
Bảng
4.7. Ảnh
hƣởng
của
nguồn nitrogen
tới khả năng sinh
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 72
Bảng 4.8.
Ảnh
hƣởng
của

nồng độ bột đậu tƣơng
tới khả
năng
sinh
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 72
Bảng
4.9. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ nuôi cấy tới khả
năng
sinh
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 72

Bảng
4.10. Ảnh
hƣởng
của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
73
Bảng
4.11. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ phản ứng tới
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
73
Bảng 4.12.
Ảnh
hƣởng
của pH
phản ứng
tới
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng

A. oryzae VTCC-F-045

74
Bảng 4.13.
Độ
bền nhiệt của
endo-β-1,4-glucanase
75
Bảng 4.14.
Độ
bền pH của
endo-β-1,4-glucanase
76
Bảng 4.15.
Ảnh
hƣởng
của
chất
tẩy rửa
t
ớ
i

hoạt tính
endo-β-1,4-glucanase
của chủng
A. oryzae VTCC-F-045

77
Bảng

4.16. Ảnh
hƣởng
của dung môi hữu cơ tới
hoạt tính
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
77
Bảng 4.17.
Ảnh
hƣởng
của ion kim loại
t
ớ
i

hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng
A. oryzae VTCC-F-045

78
DANH MỤC CÁC

HÌ
NH
Hình 1.1. Cấu trúc
không
gian
từ
trên
xuống
(A) và từ
bên sang
(B)
của
Cel12A
từ
H. grisea

7
Hình 1.2.
Cấu trúc vùng liên kết enzyme
- cơ
chất của
Cel12A
từ
H.
grisea
8
Hình 1.3. Cơ chế
thủy
phân cellulose (A) và phức hệ cellulose (B)
của

cellulase

9
Hình 1.4. Sự
thủy phân của
3
loại enzyme
trong phức hệ
c
e
ll
ul
a
s
e


10
Hình 1.5.
Cấu trúc bộ gene của
A. oryzae

11
Hình 2.1.
Đƣờng chuẩn
glu
c
os
e

26
Hình 2.2. Quy
trình tinh
sạch
endo-β-1,4-glucanase
từ chủng A. oryzae
VTCC-F-045


29
Hình 3.1.
Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase của một số chủng
A.
oryzae
36
Hình 3.2.
Điện
di
đồ sản phẩm
PCR
từ khuôn
DNA
của chủng
A. oryzae (A);
Sản
phẩm Plasmid
(B) và Sản
phẩm cắt vector
tái

tổ hợp bằng
XhoI và
XbaI (C).

38
Hình 3.3. Cây
phân
loại
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
39
Hình 3.4. Khả
năng
sinh
endo-β-1,4-glucanase theo
t
h
ờ
i

gian
của
chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045
40
Hình 3.5. Ảnh
hƣởng của nồng độ

CMC
đến
khả
năng sinh tổng hợp
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
41
Hình 3.6. Ảnh
hƣởng của nồng độ
l
a
c
t
os
e

đến
khả
năng sinh tổng hợp
e
n
do
-

β-1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045


44
Hình 3.7. Ảnh
hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
45
Hình 3.8. Ảnh
hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến
khả
năng sinh tổng
hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045


46
Hình 3.9. Ảnh

hƣởng của nhiệt độ
tới khả
năng sinh tổng hợp enzyme
endo-
β-1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045


47
Hình 3.10. Ảnh
hƣởng của
pH
m
ô
i

t
r
ƣ
ờ
ng

tớ
i

khả năng sinh tổng hợp
endo-β-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae

VTCC-F-045
48
Hình 3.11. Sắc kí
đồ trên cột Sephadex
G100 (A)
Điện
di
đồ
SDS-PAGE
của
chủng
A. oryzae VTCC-F-045
(B)
49
Hình 3.12. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ phản ứng lên
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
51
Hình 3.13. Ảnh
hƣởng của
pH
phản ứng
l

ê
n

hoạt tính endo-β-1,4-glucanase
ở
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045


52
Bảng
3.14. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ lên độ bền
endo-β-1,4-glucanase
của
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045


53
Hình 3.15. Ảnh
hƣởng của
pH
l
ê

n

độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045
54
Hình 3.16. Ảnh
hƣởng của dung
m
ô
i

hữu
cơ
l
ê
n

độ bền
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng
A. oryzae VTCC-F-045

55
Hình 3.17. Ảnh
hƣởng của chất
tẩy rửa lên
độ bền endo-β-1,4-glucanase

của
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045

56
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT
T
ẮT
µg
Microgram
µl
Microliter
APS Ammonium persulphate
Cel Cellulose
CMC Carboxyl methyl cellulase
cs
Cộng
sự
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
kb Kilobase
kDa Kilo Dalton
M Marker (thang protein chuẩn)
MTK
Môi
tr
ƣ
ờ
ng
khoáng

MW Molecular Weight
OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED N,
N’
,
N,
N
’
-
Tetramethyl ethylene diamine
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane
U Unit
v/v Volume/volume
w/v Weight/volume
MỞ
ĐẦU
Endo-β-1,4-glucanase là
một
trong ba
dạng
của cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên
kết
β-1,4-glucosidie
m
ột
cách
ngẫu

nhiên bên trong phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một
số chất
tƣơng
tự khác có cầu nối β-glucan. Endo-β-1,4-glucanase phân
giải
mạnh
mẽ cellulose vô
định
hình.
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc sinh tổng hợp
từ rất
nhiều nguồn
khác nhau
nh
ƣ

động vật (thuộc
các nhóm thân
mềm, lợn,
gà); thực
vật (mầm của
các
hạt
ngũ cốc nhƣ
đạ
i

mạch, yến mạch,

lúa mì,
mạch
đen) và vi sinh
vật.
Tuy
nhiên,
nguồn
thu enzyme chủ
yếu vẫn
từ vi sinh
vật.
Vi sinh
vật
sinh enzyme
hết
sức đa
dạng nhƣ nấm
sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus,
Trichoderma viride) và vi
khuẩn (thuộc họ
Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
ứng
dụng
rộng rãi vào nhiều
ngành
khác
nhau
nhƣ công nghiệp sản xuất

giấy và
bột
giấy;
công nghiệp
chế
biến
t
hự
c
phẩ
m
;

công nghiệp
sản
xuất thức
ăn
chăn
nuô
i
;

công nghiệp
chế
b
i
ế
n
dung
m

ô
i

hữu
c
ơ
;

hay công nghiệp
xử lý
rác
t
h
ả
i
và
sản xuất phân bón
vi
sinh.
Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh
vật tổng hợp enzyme rất đa
dạ
ng
,

đồng
thời
nhằm tận dụng
các phế phụ

phẩm
trong nông
nghiệp,
chúng tôi
đã chọn đề
tài:
Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase và xác định tính chất lý hóa của nó
Với
mục tiêu:
a)
Tuyển
chọn chủng nấm
A. oryzae sinh
tổng hợp
endo-β-
1,4-glucanase cao; b) Tối
ƣu điều
kiện sinh
tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase
ng
oạ
i

bào
từ
chủng
A. oryzae và xác
định tính chất

hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
t

nu . e

du . v

n
1
CHƢƠNG
I. TỔNG QUAN TÀI
L
I
Ệ
U
1.1. ĐỊNH
NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là
một
trong ba dạng cellulase.
Chúng
thuộc
nhóm enzyme thủy phân liên
kết
β-1,4-glucoside bên trong phân
tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một
số cơ

chất tƣơng
tự khác
để giải phóng ra cellulosedextrin, cellobiose và glucose. Enzyme này thể
hiện
hoạt
tính
mạnh
mẽ trên cellulose vô
định
hình.
1.2.
NGUỒN GỐC VÀ PHÂN
L
OẠI
1.2.1.
Nguồn
g
ố
c
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác nhau
nhƣ động
vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ
cốc nảy
mầm
là đại mạch, yến mạch, lúa mì,
mạch
đen) và vi sinh vật
(nấm

sợi, nấm men, xạ
khuẩn
và vi
khuẩn).
Tuy nhiên, vi sinh
vật
là
nguồn
thu enzyme chủ
yếu
vì thời gian
sống ngắn
nên thu
đ
ƣ
ợ
c

nhiều lần
trong năm
và chủ động sử
dụng
nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi
cũng
nh
ƣ
dễ dàng
điều
khiển có
định

h
ƣ
ớ
ng

nguồn
enzyme hoặc gia tăng
l
ƣ
ợ
ng
enzyme. Ngày
nay, cùng với sự phát
triển mạnh
mẽ
của
khoa
học
kỹ
thuật
nên dễ dàng áp
dụng
các
ph
ƣơ
ng
pháp sinh học phân tử
để tạo
ra
những chủng

mới mang
những đặc điểm
nổi
bật
mà các
đối
t
ƣ
ợ
ng

động vật,
thực
vật
ít áp
dụng
nh
ƣ
gây
đột biến
nhân tạo.
Trong vi sinh vật, rất
nhiều chủng
vi khuẩn, xạ khuẩn,
nấm
mốc và
m
ột
số
loài

nấm
men có khả năng sinh
tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase.
Các loài vi
khuẩn
cả
hiếu
khí
lẫn
kị khí
đều
có khả năng sinh endo-β-
1,4- glucanase
nh
ƣ
Bacillus subtilis, B. licheniformis, B. pumilis (Gordon et
al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999,
Nguyễn
L
a
n
Hƣơng and Hoàng
Đình Hòa, 2003). Ngoài ra còn có các loài
ƣa
kiềm
nh
ƣ
Cephalosporium sp. RYM-202 (Kang and Rhee, 1995).
Các nhóm xạ

khuẩn
thuộc chi Actinomyces griseus
(Nguyễn
Đức
L
ƣ
ợ
ng
and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999,
L
ê
Thị Thanh Xuân et al., 2005) và
Streptomyces reticuli
cũng
có khả năng
tổng hợp mạnh
enzyme.
Các loại
nấm mốc thuộc
chi Aspergillus
nhƣ
A.niger (Coral et al., 2002,
Hoàng
Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus
(Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003),
A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng
Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al.,
1992, Cao
C
ƣ

ờ
ng
and
Nguyễn
Đức
L
ƣ
ợ
ng
,
2003)
đều
có khả
năng
sinh
e
n
z
y
m
e
.
Các
nhóm
t
huộc
chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá
,
2006, Chinedu et al., 2008)
cũng có khả năng tổng hợp enzyme

cao.
1.2.2.
Phân loại
e
n
z
ym
e
1.2.2.1.
Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc
t
ế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là
một trong
ba
dạng enzyme
của hệ cellulase,
thuộc nhóm
enzyme
thủy phân
liên
kết
β-1,4-
glucoside bên trong phân
tử cellulose,
o
li
go
s
a

cc
h
a
r
i
de
,

d
i
s
a
cc
h
a
r
i
de
và
một số
cơ chất
t
ƣ
ơ
n
g
tự khác để
giải
phóng
ra

cellulosedextrin,
c
e
ll
o
bi
o
s
e
và
g
l
u
c
o
s
e
(Chellapandi et al., 2008).
Dựa trên đặc
tính
cấu
trúc,
endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
gọi là
endoglucanase
hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC
3.2.1.4).
Endo-β-1,4-glucanase thuộc
vào

dạng
1
của phức
hệ
celulase.
Dạng
2 là exoglucanase,
gồm
1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase
(giống
nhƣ
cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobio
hydrolase) (EC 3.2.1.91). Dạng 3 là β-glucosidase hoặc β-glucoside
glucohydrolase (EC 3.2.1.21). Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên
trong phân tử cellulose tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác
nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở
đầu
khử và
đầu
không khử của
chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc
cellobiose (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002).
1.2.2.2. Phân loại
theo đặc điểm
phân
tử
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
phân chia dựa vào đặc điểm phân tử

nhƣ
khối
lƣợng phân
tử, điểm
đẳng
đ
i
ệ
n
và
cấu trúc tinh
t
h
ể
.
Dựa
theo
đặc
tính
và
trình tự amino
acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm
enzyme thủy phân cellulose
đƣợc
chia làm 3
nhóm
là Cel-1, Cel-2 và Cel-3.
Trong đó
Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối
lƣ

ợ
ng
là 62 kDa và 34 kDa. Cel-1 và Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc
nitơ
t
ự
do là QQVGTTADAH và QELAQYDSAS. Trình tự amino acid của Cel-1
giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, là enzyme thuộc họ 7 cellulase và có
độ tƣơng đồng
72% với cellobiohydrolase I và exo-cellobiohydrolase I. Trình
tự amino acid của Cel-3 có độ
tƣơng
đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase
CelA, là enzyme thuộc họ 12 cellulase. Khối
lƣợng
phân tử của Cel-1 và
Cel-3 giống với CelB và CelA. Cel-2 là
β-glucosidase
(EC 3.2.1.21) có khối
lƣợng phân tử
là 120 kDa và trình
tự amino
acid chứa gốc nitơ tự do
của Cel-2
chƣa đƣợc
xác
định
(Yamane et al., 2002).
Khi
nghiên

cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase
(CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho
thấy,
cả hai
enzyme
này
đều
thuộc nhóm
7 của glycosyl
hy
dr
o
l
a
s
e

(GH7);
trong
đó CbhB
bao gồm
cấu trúc
cellulose-bindingomin
(CBD) với sự xúc tác riêng bởi các
amino
acid
giàu
liên
kết peptide;
còn CbhA chỉ

gồm
sự xúc tác,
thiếu
CBD và
liên
kế
t
peptide. Sự
phiên mã của gene
CbhA và CbhB
đƣợc cảm ứng
bở
i
D-xylose. Ở
chủng A. kawachi, (Hara et al., 2003) đã
phát
hiện ba gene mã hóa
endoglucanase là cel5A, cel5B và cel61A.
Trong đó,
cel5A và cel61A có
liên
kết
CBD1;
còn cel5A và cel5B
thuộc
glycosyl
hydr
o
l
a

s
e

nhóm
5
(
G
H
5)
,
cel5B có
cấu trúc rất giống
cel5A,
nhƣng thiếu
CBD1 và sự liên
kết.
C
e
l
5
A
gồm
4
đoạn
int
r
o
n
,
cel5B

gồm
5
đoạn
int
r
on
,

còn
cel61A
thuộc
nhóm
GH61 không có intron.
Dựa
vào cấu trúc bậc một
cơ
bả
n
,

phức cellulase
đƣợc chia
l
à
m
6
họ
là
A, B, C, D, E và F (Henrissat et al., 1989). Dựa vào
trung tâm

xúc tác
phức
cellulase
đƣợc
chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes
et al.,
1991). Hiện nay,
cellulase
đƣợc
xếp
thành
12 họ khác
nhau
là 5, 6, 7, 8, 9,
(10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74.
Trong
đó, họ 9
chứa cellulases
của vi
khuẩn
(hiếu
khí và kỵ khí),
n
ấ
m
,

thực vật
và
động vật (protozoa

và mối); họ
7 gồm
hy
d
r
o
l
a
s
e

nấm
và
họ
8
gồm
hy
d
r
o
l
a
s
e
vi
khuẩn
(Lee et al., 2002).
1.3.
CẤU
T

RÚ
C
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc tạo
ra
từ
các loài khác
nhau
có
thành
phần cấu tạo và cấu
trúc
khác
nh
a
u
.

E
ndo
-
β
-1,4-
glu
c
a
n
a
s
e

từ
nấm A.
oryzae có khối
lƣợng phân
tử
khoảng
34 kDa và 62 kDa (Yamane et al.,
2002), chủng A. oryzae KBN616 là 31 kDa và 53 kDa (Kitamoto et al.,
1996),
c
hủn
g
Trametes hirsuta
khoảng
40,6 kDa (Nozaki et al., 2007),
chủng
A. terreus M11
khoảng
25 kDa (Gao et al., 2008).
1.3.1.
Cấu
trúc bậc nh
ấ
t
Nghiên
cứu của Nozaki và cs (2007) cho
thấy,
endo-β-1,4-glucanase
thuộc

họ 5 (GH 5) chứa CBM ở
đầu
nitơ, có
trọng lƣợng phân
tử
khoảng
44 kDa và
đƣợc
gọ
i
là ThEG. ThEG
từ chủng
Trametes hirsuta là
một
chuỗi
polypeptide có chứa 384
amino
acid và có độ
tƣơng đồng
cao với En-1
từ
chủng
Irpex lacteus
(
73
%
)
;
EG từ
chủng

Humicola grisea (46%) và EglB từ
chủng
A. niger (49%).
Ở
chủng
A. oryzae KBN616, Kitamoto và cs
(1996) đã nhân dòng
phân tử,
tinh sạch
và mô tả
đặc
đ
i
ể
m
của 2
gene
mã
hóa endo-β-1,4-
glucanase
là CelA và CelB.
Gene
CelA
gồm 877 pb
với 2
đoạn
int
r
o
n

.

Protein
do
CelA mã
hóa gồm
239
amino
acid và
đƣợc
xếp vào họ
cellulase
H.
Gene
CelB chứa
1248 bp
không chứa đoạn
in
t
r
o
n
.

Protein
do CelB mã hóa
gồm
416
amino
acid và

đƣợc
xếp vào
họ cellulase
C. Sau khi
tinh sạch, protein của
CelA
và
CelB có
khối
l
ƣ
ợ
ng

phân tử khoảng
31 kDa và 53
kDa.
Ở
chủng nấm chịu nhiệt
Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003)
đã
có
những nghiên
cứu chi
t
i
ế
t
về cấu trúc Cel12A,
enzyme

này
thuộc
họ 12
(GH 12)
endoglucanase
là
một
c
huỗ
i

polypeptide gồm 224 amino
a
c
i
d

cấu
tạo
nên các
c
hu
ỗ
i
α, β và
các vùng
nối.
1.3.2.
Cấu
trúc không

gia
n
Phân tử
Cel12A
đƣợc cấu tạo
bở
i
15
c
hu
ỗ
i
β
tạo thành
2
phiến gấp nếp
β
là A và B. Phiến A
gồm
6 chuỗi β (A1-A6) và phiến B
gồm
9 chuỗi β
(B1-B9). Hai
phiến này xếp chồng
l
ê
n

nhau thành hình bánh
kẹp. Bề

mặt
lõm
của phiến
B
tạo nên khe
dà
i
35 Å
để
liên
kết
với cơ
c
h
ấ
t
,

khe này chạy
dọc
bề
mặt của
enzyme.
Trung
tâm hoạt động của enzyme
là
h
a
i

gốc glutamyl
120
và
205 ở
chủng
H. grisea. Sáu
gốc
phía
ngoà
i

phân bố phía trên phân tử
giống
nhƣ
g
à
i

các
amino
acid tự do.
Hai
trong số các gốc đó nằm
ở
đầu
nitơ.
Các dải xoắn β
đƣợc
nối với
nhau

bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với
các gốc
t
ừ
29-32, 40-47, 92-96 và
165-
169
;

các vùng này
n
ố
i

t
i
ếp

tƣơng ứng
với
c
hu
ỗ
i
β:
B2
đến
A2, A2
đến
A3, A5

đến
B5 và A6
đến
B7. Ba
gốc cysteine
là C175,
C206 và C216
đƣợc định
vị
trên
c
hu
ỗ
i
β là A6, B4 và A4. Các
c
huỗ
i

bên
tập
trung trong lõi giữa hai phiến β, nơi mà bề
mặt
xúc tác
đƣợc
tăng
l
ê
n
(Hình 1.1).

Gốc
cysteine 175 nằm
ở
c
hu
ỗ
i
β A6
trên phiến nhỏ
A và
tạo
ra
mấu
lồi
ở
bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn
α.
Chuỗi
bên
ở
trong
lõi
giữa
h
a
i
phiến β, liên
kết
với 6
amino

acid T85, T123, A144, F175, I177 và F180
bằng
lực vanderval.
L
i
ê
n

kết
giữa các amino acid có kích
thƣớc
từ 3,5
đến 4,1 Å (Hình 1.2A). Gốc
cysteine 206 nằm gần trung tâm
xúc
tác
Glu
205 trên
chuỗi B4.
Đầu của
c
hu
ỗ
i

bên
ở lõi
phiến
β, nơi có
hệ thống tƣơng

tác chặt chẽ
với
các
c
hu
ỗ
i

bên của
8
gốc
Q34, W52, W54, S63, P65, Y91,
A98 và
T
204
;
cùng với
sự tách
rời
giữa các nguyên tử trong chiều
dà
i

từ
3,3-
4,9 Å (Hình 1.2B).
Gốc
cysteine
216
nằm trên

c
hu
ỗ
i
A4 ở
phiến
A,
phiến
này làm
tăng
bề
mặt
xúc tác của
e
n
z
ym
e
.
Gốc
cysteine
này có
c
huỗ
i

bên trong vùng
lõi
bên
dƣ

ớ
i

đ
i
ể
m

hoạt
độ
ng
,

nơi
tƣơng tác
với
c
hu
ỗ
i

bên của
5
gốc
W48, V87,
W89, F214 và F219 có kích
t
h
ƣ
ớ

c

từ
3,3
đến
4,8 Å (Hình 1.2C).
Hình
1.1.
Cấu trúc không
g
i
a
n

từ trên xuống
(
A
)
và
từ bên sang
(B)
của
Cel12A
từ
H. Grisea (Sang et al., 2003)
Hình
1.2.
Cấu trúc vùng liên kết enzyme
-
cơ chất của

Cel12A
từ
H. Grisea
1.4.
CƠ CHẾ XÚC
T
ÁC
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose
tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác
nh
a
u
.
Tuy nhiên, để
thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng
enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase
sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau.
Ban
đ
ầ
u
,

endo-β-1,4-glucanase thủy phân
sơ
bộ
các liên
kết
1,4-β-
glucan

của sợi cellulose
để tạo nên các phần tử nhỏ hơn
(sợi
cellobiose). Sau
đó các
sợi
này sẽ chịu
tác động
của exoglucanase ở
đầu
khử và
đầu không
khử để
giải
phóng ra glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3).
Hình
1.3. Cơ
chế thủy
phân cellulose (A)
và
phức hệ cellulose
(B)
của cellulase
(Lee et al., 2002)
Ngoài ra,
endo-β-1,4-glucanase cùng
các
enzyme
khác
nhƣ

exo-β-1,4-
glu
c
oz
i
da
s
e

(cellobiase)
sẽ
tham
gia
thủy phân
cellulose
theo
cơ
chế ban
đầu
endo-β-1,4-glucanase
tác
động
vào
vùng
vô
định hình trên phân tử
cellulose và
tạo
ra các
đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase

sẽ
cắt
từng
đoạn
c
e
ll
ob
i
os
e
.

K
ế
t

quả tạo
ra các cello
o
li
gosa
c
h
a
r
ide

mạch
ngắ

n
,
c
e
ll
ob
i
os
e
và glucose. Các cellobiase
sẽ thủy phân
t
i
ếp

tạo thành glucose
(Hình 1.4).
Hình 1.4. Sự
thủy phân của
3
loại enzyme
trong phức hệ
cellulase
1.5. Khái
quát về
Aspergillus oryzae
A. oryzae
thuộc
chi Aspergillus, họ Trichocomaceae,
bộ

Eurotiales, lớp
Eurotiomycetes, ngành Ascomycota và
thuộc
giới
nấm
(Kitamoto, 2002).
Bào
tử của
A. oryzae có
màu vàng hoa
cau,
không chứa độc tố a
f
l
a
to
xin
.
A. oryzae
tiết
ra môi
t
r
ƣ
ờ
ng
các
enzyme thủy phân nhƣ
cellulase,
pe

cti
na
s
e
,
xylanase
và
h
e
m
ice
ll
ulas
e
khi
sống trên
môi
t
r
ƣ
ờ
ng
có
nguồn
cơ
chất
t
ƣ
ơ
ng

ứng cellulose, pectin, xylan và hemicellulose. Nên A. oryzae đã
đƣợc
ứng
dụng rất
rộng rãi
trong
quá
trình
sản
xuất,
chế biến đồ ăn và trong
công
nghiệp sản xuất
các enzyme. Ở
Nhật
Bản A. oryzae
đƣợc
sử
dụng
trong quá
trình
sản
xuất thức
ăn
nhƣ
xì
dầ
u
,

r
ƣ
ợ
u
sakê và
trong công
nghiệp
sản xuất enzyme
nhƣ
amylase, protease, hemicellulose, cellulase,
oxidoreductase,