Giáo trình CƠ SƠ VÀ PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ - Chương 9 ppsx

Chương 9
PHÂN LẬP GENE TÁCH DÒNG PHÂN TỬ
VÀ BIỂU HIỆN GENE

Tóm tắt: Công nghệ ADN tái tổ hợp bao gồm các kĩ thuật tách dòng gene và
biểu hiện gene. Bắt đầu từ sự phân lập gene và sau đó là tạo vector tái tổ hợp,
biến nạp vào tế bào chủ, tách dòng và xác định trình tự gene. Protein là sản
phẩm biểu hiện gene. Quá trình biểu hiện gene ngoại lai bắt đầu từ việc đưa
gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào chủ. Vector biểu hiện gene
được thiết kế bao gồm promotor mạnh và điều khiển được. E. coli là vi khuẩn
được sử dụng rộng rãi trong công nghệ ADN tái tổ hợp và sự biểu hiện gene
thành công nhất hiện nay vẫn là ở E. coli. Phân lập, tách dòng và biểu hiện
gene được minh hoạ bằng ví dụ về sự phân lập, xác định trình tự gene mã hoá
cho trichobakin-RIP và quá trình biểu hiện gene này.
Nội dung của chương gồm 3 vấn đề chính là: (1).Phân lập gene; (2). Tách
dòng gene; (3). Biểu hiện gene.


§1. PHÂN LẬP GENE
Phân lập gene hay phân lập đoạn ADN theo mục đích có thể được tiến
hành theo phương pháp sử dụng enzyme cắt hạn chế hoặc bằng phản ứng chuỗi
PCR. Phân lập gene mang ý nghĩa trong kĩ thuật giải trình tự ADN hay tạo dòng
ADN tái tổ hợp trong kĩ thuật chuyển gene.
1.1. Phân lập gene bằng kĩ thuật cắt hạn chế

Enzyme giới hạn (restrition enzyme) có khả năng cắt ADN ở những điểm
đặc hiệu. Với đặc tính đó người ta đã vận dụng để xác định những đoạn ADN
mã hoá cho các tính trạng của sinh vật và phân lập đoạn ADN đó. Kĩ thuật phân
lập gene nhờ enzyme giới hạn có thể gồm các bước sau:
(1). Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Cắt ADN bởi enzyme giới hạn.

(3). Điện di trên gel agarose.
(4). Dựa vào ADN marker xác định được đoạn ADN cần phân lập.
(5). Biến tính ADN thành 2 mạch đơn ngay trên gel, rồi chuyển lên màng

126
lai phân tử. Vị trí các đoạn ADN được giữ nguyên.
(6). ADN cố định trên màng được lai với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ
Rửa để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp.
(7). Dùng kĩ thuật phóng xạ tự ghi để định vị các phân tử lai ADN- mẫu
dò.
1.2. Phân lập gene bằng kĩ thuật PCR
Phản ứng chuỗi polimerase được tiến hành với các primers có trình tự biết
trước. Cặp primer gồm primer xuôi (sens primer) và ngược (antisens primer)
được thiết kế theo trình tự gene từ ngân hàng gene. Cặp mồi chuyên biệt này
được bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN. Sử dụng cặp mồi
chuyên biệt cùng với ADN mẫu, enzyme, dNTP, Mg
++
, bufpher trong thiết bị
nhân ADN (máy PCR) thì đoạn gene từ phân tử ADN mẫu sẽ được khuếch đại.
Phân lập gene bằng PCR có thể được tiến hành theo các bước sau:
(1) Tách chiết và tinh sạch ADN.
(2). Thiết kế primers.
(3). Chọn điều kiện phản ứng PCR.
(4). Nhân đoạn ADN trong máy PCR để phân lập đoạn gene theo mục
đích.


§2. TÁCH DÒNG GENE
2.1. Mục đích
- Tạo ra một lượng lớn bản sao một trình tự ADN xác định.

- Chọn lọc một thư viện gene.
2.2. Các bước của kĩ thuật tách dòng
- Chọn và xử lí vector.
- Xử lí ADN cần tạo dòng.
- Tạo vector tái tổ hợp.
- Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
- Phát hiện dòng cần tìm trong thư viện gene.

127


Hình 9.1. Quy trinh chung của kĩ thuật tách dòng gene
2.3. Thư viện bộ gene

Thư viện bộ gene là tập hợp tất cả các trình tự ADN cấu thành bộ gene đã
được gắn vào vector. Về nguyên tắc, thư viện bộ gene được thiết lập từ bất cứ tế
bào nào của sinh vật nghiên cứu.
Các bước thiết lập thư viện bộ gene:
(1) Tách chiết ADN.
(2). Cắt ADN thành những đoạn có kích thước xác định bằng RF.
(3). Gắn đoạn các ADN vào vector để tạo vector tái tổ hợp.
(4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào chủ.
(5). Tế bào chủ nuôi cấy trên môi trường đặc và hình thành nên các dòng.


128

Hình 9.2. Tách dòng ADN tái tổ hợp
Ứng dụng:
- Giải mã thông tin di truyền chứa trong bộ gene, đặc biệt cấu trúc itron,

exon của một gene xác định.
- Tạo dòng các trình tự không mã hoá nằm cạnh các gene và đóng vai trò
quyết định trong sự điều hoà biểu hiện gene.
2.4. Phân lập, tách dòng và xác định trình tự gene chaperonin ở đậu tương
Một ví dụ về xác định trình tự gene chaperonin liên quan đến tính chịu
nóng hạn ở cây đậu tương Glicine max (L.) Merrill trên thiết bị tự động theo

129
nguyên tắc của phương pháp Sanger. Glicine max (L.) Merrill là loại cây trồng
có vị trí quan trọng hàng đầu trong các loại cây họ đậu. Hạt đậu tương có hàm
lượng protein cao từ 28% - 45%, dễ tan và chứa hầu hết các loại axit amin, đặc
biệt là các loại axit amin không thay thế. Ngoài protein, hạt đậu tương còn có
lipit và nhiều chất hữu cơ khác. Rễ đậu tương có nốt sần chứa vi khuẩn cố định
đạm Rhizobium.
Các dòng đậu tương M48, M10 và M61 được tạo ra bằng phương pháp
đột biến thực nghiệm (Chu Hoàng Mậu, 2001) đã được đánh giá và chọn lọc qua
nhiều thế hệ. Ngoài các đặc điểm về năng suất và chất lượng, tác giả còn quan
tâm nghiên cứu mối liên quan giữa khả năng chịu hạn với đặc điểm hoá sinh và
sinh học phân tử của các dòng đậu tương đột biến này. Dòng đậu tương đột biến
chịu hạn ML61 có nguồn gốc từ giống đậu tương Lạng Sơn và được tạo ra bằng
đột biến thực nghiệm với công thức xử lí phối hợp (16 kr
γ
+ 0,01%EI). Trần
Thị Phương Liên (1999) đã nghiên cứu, phân lập và xác định trình tự gene
chaperonin từ giông đậu tương chịu nóng M103, genome của các dòng đậu
tương đột biến ML10, ML48 và ML61 có tồn tại gene chaperonin và cấu trúc
của nó có điểm gì khác với gene chaperonin đã được nghiên cứu. Kết quả nhân
và tách dòng gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến M48, M10 và
M61 và xác định trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương chịu hạn M61
được thực hiện nhằm mục đích trên. Phát hiện gene chaperonin theo phương

pháp của Kary Mullis và cộng sự (1985) với việc sử dụng cặp mồi
Chap_N/chap_C thiết kế dựa trên trình tự ADN bổ sung (cDNA) của giống đậu
tương Nhật Bản.
Chap_N:
5_GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C
Chap_C:
5_CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATA TCA TC
Chu trình nhiệt phản ứng: 95
0
C : 1 phút; 55
0
C : 1 phút; 72
0
C : 1 phút 20
giây: 32 chu kì; 72
0
C : 8 phút; Kết thúc ở 4
0
C.
Để tiến hành tách dòng gene chaperonin sản phẩm PCR được cắt thành
các đoạn nhỏ hơn bằng SacI. Sau đó đem sản phẩm cắt gắn vào vector
pBluescript KS (-) đã được mở vòng. ADN tái tổ hợp được biến nạp vào chủng
E. coIi-DH5
α
. Môi trường nuôi cấy, các phương pháp gắn, tạo tế bào khả biến,
biến nạp, tách ADN plasmid, kiểm tra đoạn gene bằng cách xử lí với enzyme
giới hạn dược tiến hành theo sách cẩm nang chọn dòng phân tử của Sambrook
và cộng sự 1989.

130

2.4.1. Kết quả tách chiết và tinh sạch ADN tổng số
Mầm 2-3 ngày tuổi của các dòng dậu tương ML10, ML48 và ML61 được
chia nhỏ từ 0,5-1g và giữ ở -70
0
C. Khi tách chiết, mầm được nghiền trong nitơ
lỏng và ADN tổng số được chiết ra bằng dung dịch đệm có chứa 10 mM Tris-
HCl pH 8.0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl, SDS 2,1%. Sử dụng enzyme
proteinaza, hỗn hợp phenol : chlorofoc : isoamylalcohol (25 : 24 : 1) để loại
protein và các hợp chất không mong muốn, EDTA có tácdụng cố định các ion
Mg
++
- là yếu tố cần thiết cho sự hoạt động của các nucleaza, do đó ADN trong
dung dịch không bị phân giải bởi các enzyme này. Thực hiện quy trình tách
chiết ADN như đã mô tả [1], thu được dung dịch có chứa ADN. Dung dịch
ADN thu được vẫn tồn tại cả ARN, loại bỏ ARN bằng cách xử lí với ARNaza, ủ
ở 37
0
C trong 2-3 giờ.
Sau đó tiến hành kiểm tra sản phẩm bằng điện di trên gel agarose 0,8%.
Bản gel sau khi điện di được nhuộm bằng EtBr (ethidium bromide) trong 10-15
phút. Do cấu trúc của ADN có các liên kết hydro giữa hai mạch đơn nên khi
nhuộm, các phân tử EtBr sẽ bám vào các liên kết này. Phân tử EtBr có khả năng
phát quang dưới ánh sáng của tia tử ngoại (UV) nên có thể phát hiện băng vạch
khi chiếu bản gaeldưới đèn UV.

Hình 9.3. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agaroza 0,8%
2.4.2. Nhân gene chaperonin từ 3 dòng đậu tương bằng kĩ thuật PCR


Chaperonin tế bào chất là một dạng protein tồn tại trong tất cả các tế bào đóng

vai trò quan trọng trong việc tạo cấu trúc không gian đúng cho protein tạo khung
tế bào là actin và tubulin. Chúng cùng đồng thời thực hiện nhiều chức năng khác
như tham gia tái tạo cấu trúc không gian đúng cho protein bị biến tính khi gặp
điều kiện bất lợi. Các tác giả đã sử dụng đoạn mồi được tổng hợp dựa vào trình
tự cDNA của chaperonin tế bào chất giống đậu tương chịu lạnh Nhật Bản để tiến
hành nhân gene chaperonin của các dòng đậu tương đột biến ML10, ML48 và
ML61 bằngkĩ thuật pPC.


131

Hình 9.4. Điện di đồ sản phẩm PCR gene chaperonin của 3 dòng đậu tương
Sau 32 chu kì phản ứng, sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên
gel agarose 0,8% và kết quả cho thấy ở cả ba dòng đậu tương đều thu được sản
phẩm PCR đặc hiệu. Kích thước phân tử (KTPT) của sản phẩm PCR vào khoảng
1,6 kb. Đồng thời sản phẩm PCR nhận được có KTPT giống với đoạn tương ứng
ở đoạn cDNA của gene chaperonin trong giống đậu tương Nhật Bản. Điều đó
chứng tỏ rằng các dòng đậu tương nghiên cứu đều có gene chaperonin. Như vậy,
trong trình tự của nó chỉ có những vùng được dịch mã sang protein (exon), mà
không có những vùng không dịch mã (intron).
2.4.3. Phân tích gene chaperonin bằng enzim giới hạn
Theo các nghiên cứu đã công bố, trình tự gene chaperonin có điểm nhận
biết cho một số enzyme giới hạn như: SacI, AluI, SauI. Trong đó SacI cắt trình
tự cDNA thành 5 đoạn có kích thước phân tử tương ứng là 260, 189, 198, 630 và
325 bp. Như vậy, để so sánh gene chaperonin này với các trình tự công bố. Sản
phẩm cắt được điện di trên gel agaroza 1,2%.

Hình 9.5. Phổ điện di ADN plasmid
Kết quả trên diện di đồ cho thấy không có sự khác biệt về vị trí điểm cắt
SacI ở các dòng đậu tương đột biến so với các gene chaperonin đã được công bố

trước đây. Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR nhận được có thể chính là đoạn
gene chaperonin. Đây là một trong những bằng chứng khẳng định sản phẩm

132
PCR thu được chính là gene chaperonin đã được công bố. Tuy nhiên để có thể
khẳng định chắc chắn về gene này cần tiếp tục nghiên cứu tách dòng sản phẩm
PCR của một đại diện là dòng đột biến ML61 - dòng được đánh giá là có năng
suất cao, chín sớm và khả năng chống chịu hạn tốt để tiến hành đọc trình tự
ADN của đoạn gene này làm cơ sở cho việc so sánh với trình tự của gene
chaperonin đã được công bố trên ngân hàng gene thế giới.
2.4.4. Tách dòng một số đoạn ADN của gene chaperonin ở dòng ML61
Nhằm mục đích nghiên cứu đọc trình tự gene, cần phải gắn một số đoạn
ADN của gene chaperonin ở dòng ML61 đã được cắt bằng enzyme SacI vào
vector pBluescript KS (-). Dựa vào các đặc điểm của vector pBluescript KS (-)
có chứa gene lacZ và vị trí cắt của SacI Đồng thời trên gene chaperonin cũng
chứa vị trí các điểm cắt đặc hiệu của SacI. Vì vậy, sử dụng SacI để xử lí sản
phẩm PCR của dòng đậu tương ML61 và mở vòng vector pBluescirpt KS (-).
Phản ứng gắn của vector với các đoạn cắt của sản phẩm PCR được tiến hành ở
16
0
C trong vòng 24 giờ, sử dụng enzyme T
4
ligaza. Sau đó, dịch phản ứng được
biến nạp vào chủng E. coli - DH5
α
và cấy trải trên môi trường chọn lọc có
ampixillin, X-gal và IPTG. Kết quả đã nhận được một số khuẩn lạc trắng và
khuẩn lạc xanh trên môi trường chọn lọc. Những khuẩn lạc trắng có thể đã mang
đoạn ADN ngoại lai, còn khuẩn lạc xanh mang plasmid không chứa đoạn gắn
vào. Để kiểm tra kết quả của quá trình chọn dòng 9 khuẩn lạc màu trắng (kí hiệu

các khuẩn lạc từ 1 đến 9) và một khuẩn lạc màu xanh (làm đối chứng) được sử
dụng để tách chiết ADN plasmid. Sau khi tách chiết và làm sạch, sản phẩm
ADN plasmit được kiểm tra trên gel agaroza 0,8%. Trên ảnh điện di đồ cho thấy
cả 9 khuẩn lạc đều có ADN plasmid với độ di động điện di cao hơn đối chứng.
Để xác định được những khuẩn lạc cần tìm có gắn đoạn sản phẩm PCR cắt bằng
SacI, chọn ADN plasmid từ bơn khuẩn lạc 1, 4, 7 và 8 để tiến hành phản ứng cắt
kiểm tra bằng enzyme SacI. Sản phẩm sau khi cắt được kiểm tra bằng điện di
trên gel agaroza 0,8 %.
Kết quả trên ảnh điện di dòng số 8 đã gắn được một đoạn ADN khoảng
0,6 kb; dòng số 7 đã gắn được đoạn ADN khoảng 0,4 kb; dòng số 4 đã gắn dược
đoạn ADN khoảng 0,2 kb. Riêng sản phẩm cắt của dòng số 1 cho thấy có cả 2
đoạn ADN khoảng 0,6 kb và 0,2 kb được gắn vào vector. Trong quá trình tách
dòng, sử dụng enzyme SacI cắt gene chaperonin thành 5 đoạn. Vì SacI là
enzyme cắt tạo đầu dính nên sản phẩm cắt chỉ cho được 3 đoạn có đầu dính
tương ứng với kích thước là 189, 198 và 630 bp.
Như vậy, rõ ràng là dòng số 8 đã gắn được đoạn tương ứng có kích thước
là 630 bp. Dòng số 4 thì gắn dược hoặc là đoạn 189 bp hoặc 198 bp (vì hai đoạn

133
này rất khó phân biệt trên diện di đồ). Còn dòng số 1 gắn được cả hai đoạn 630
bp và một trong hai đoạn ngắn nói trên. Đối với dòng số 7 đoạn gắn có kích
thước khoảng 400 bp có thể là tổng của hai đoạn ngắn 189 và 198 bp và cũng có
thể là đoạn lẫn tạp trong sản phẩm cắt ngẫu nhiên. Để có những kết luận chính
xác về các dòng thu được, cần tiến hành đọc trình tự ADN.
2.4.5. Xác định trình tự gene Chaperonin ở cây đậu tương
Vector tách dòng TA cloning và các hoá chất cần thiết của hãng
Invitrogen, vi khuẩn E. coli chủng DH5
α
. Tạo dòng phân tử được tiến hành
theo phương pháp của Sambrook và Russell. Xác định trình tự gene chaporonin

được thực hiện trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic
Analizer. Nhân đoạn gene chaperonin từ ADN tổng số, tiểu phần CTT
δ
của
dòng đậu tương đột biến ML61. Sau đó, sản phẩm PCR được đưa vào vector TA
cloning, được biến nạp vào vi khuẩn E. coli DH5
α
. Kiểm tra vector tái tổ hợp
bằng xử lí với enzyme EcoRI đã thu được dòng mang đoạn gene mong muốn để
tiến hành đọc trình tự. Để kiểm tra kết quả đọc trình tự gene chaperonin, sử dụng
phần mềm Sinh học Clustalx để so sánh trình tự gene này với các gene
chaperonin của giống Cúc Vàng (còn gọi là Cúc Lục Ngạn), một giống địa
phương có khả năng chịu hạn, giống M103 đột biến có khả năng chịu nóng và
giống đậu tương chịu rét Nhật Bản - Bonminori.


134


135

Trình tự gene chaperonin của dòng đậu tương đột biến ML61 có sự sai
khác 41 vị trí nucleotit so với giống M103, 57 vị trí nucleotit so với giống Cúc
Vàng và 25 nucleotit so với giống đậu tương Bonminori. Sự sai khác này tạo
nên sự thay đổi trình tự 9, 10 và 11 axit amin sai khác của ML61 tương ứng so
với Bominori, M103 và Cúc Vàng.
Bảng 9.1: Trình tự axit amin của gene chaperonin ML61 sai khác so với
Bonminori, Cúc Vàng và M103
STT Vị trí Bonminori Cúc Vàng M103 MI61
1 8 Gln (Q) Gln (Q) Gln (Q)

His (H)
2 24 Glu (E) Asp (D) Asp (D) Glu (E)
3 29 Gli
(
G
)
Ala
(
A
)
Ala
(
A
)
Ala
(
A
)

4 43 Thr
(
T
)
Thr
(
T
)
Thr
(
T

)

Ala
(
A
)

5 54 Ile
(
1
)
Thr
(
T
)
Thr
(
I
)
Ile
(
I
)

6 76 Val
(
V
)
Gli
(

G
)
Val
(
V
)
Val
(
V
)

7 99 Ser
(
S
)
Thr
(
T
)
Thr
(
T
)
Thr
(
T
)

8
110

His(H) Leu (L)
His(H)
Leu (L)
9
128
Glu Asp (D)
Asp
Asp
10 129 Pro
(
P
)
Ala
(
A
)
Pro
(
P
)
Ala
(
A
)

11 191 Pro
(
P
)
Pro

(
P
)
Pro
(
P
)

Ala
(
A
)

12 204 Val
(
V
)
Ile
(
I
)
Val
(
V
)
Val
(
V
)

13 220 Leu
(
L
)
Pro
(
P
)
Leu
(
L
)
Leu
(
L
)

14 280 Ser
(
S
)
Gli
(
G
)
Gli
(
G
)
Ser

(
S
)

15 308 Ser
(
S
)
Ser
(
S
)
Ala
(
A
)
Ser
(
S
)

16 360 Phe
(
F
)
Val
(
V Phe
(
F

)
Phe
(
F
)

17 447 As
p

(
D
)
Ala
(
A
)
Ala
(
A
)
Ala
(
A
)

18 506 Leu
(
L
)
Leu

(
L
)
Pro
(
P
)
Leu
(
L
)

19 514 Thr
(
T
)
Met
(
M
)
Thr
(
T
)
Thr
(
T
)

Các trình tự nucleotit sai khác còn lại đều do sự dột biến điểm có tính chất
đồng chuyển (hoán vị của các nucleotit trong nhóm với nhau) mà không làm
thay đổi trình tự axit amin. Mặt khác ở dòng đậu tương MI61 còn có sự sai khác
ở 3 vị trí axit amin 8Gln-His, 29Thr-Ala và 191Pro-Ala so với cả 3 giống so
sánh trên. ML61 là một dòng đậu tương đã được xử lí đột biến phối hợp với 16
kr
γ
+ 0,01%EI, có thể chính việc xử lí phối hợp tia
γ
và EI đã gây nên sự đột
biến trình tự nucleotit của dòng đậu tương này.

136
Xem xét đến 3 vùng chức năng quan trọng của chaperonin để nghiên cứu
đánh giá trình tự nucleotit của dòng ML61 đến việc tạo cấu trúc không gian của
chaperonin. Vùng hoạt tính ATPaza và vùng gắn với ATP, đây là hai vùng bảo
thủ của gene. Vùng hoạt tính ATPaza vẫn giữ dược tính bảo thủ, còn vùng gắn
với ATP ở ML61 sai khác với Bominori ở vị trí 99Thr-Ser và M103 99Thr - Ile.
Cúc Vàng có trình tự vùng này giống ML61. Một vùng thứ 3 được kiểm tra là
vùng gắn cơ chất với phức CCT, đây là vùng đa hình nhất so với các vùng chức
năng khác của chaperonin tiểu phần CCT
δ
. Trong vùng này ML61 sai khác với
M103 ở vị trí axit amin 280Gli-Ser, Cúc Vàng ở hai vị trí 220Pro-Leu và
280Gli-Ser. Không có sự thay đổi của vùng này so với Bominori. Ngoài ra để
đánh giá khả năng chịu hạn của ML61, trình tự gene chaperonin này được xem
xét theo quy luật biến đổi các axit amin trong các enzim về khả năng chịu lạnh
sang nóng. Dựa trên trình tự axit amin, dòng ML61 cũng có sự biến đổi tương tự
ở vị trí axit amin 29 Gli-Ala, 99Ser-Thr (Bominori) giống như Cúc Vàng và
M103. Hai giống đậu tương đã được đánh giá là có khả năng chịu hạn.

2.5. Thư viện cADN
Thư viện ADN là tập hợp các bản sao cADN từ tất cả các mARN của tế
bào. Khác với thư viện bộ gene, thư viện cADN được thiết lập từ một tế bào xác
định trong đó gene nghiên cứu biểu hiện thành mARN.
Mục đích của thư viện cADN là nghiên cứu biểu hiện một gene xác định
cùng với những vấn đề liên quan như biểu hiện gene, mối tương tác giữa các
gene trong quá trình sống.
Các bước thiết lập thư viện cADN:
(1) Chọn vector.
(2). Tách chiết mARN.
(3). Tổng hợp cADN nhờ enzyme sao mã ngược.
(4) Tạo vector tái tổ hợp gồm plasmid và cADN.
(5) Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn.
(6) Nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng, sau chuyển sang đặc. Các
dòng vi khuẩn sẽ hình thành các khuẩn lạc.
(7). Phát hiện dòng cần tìm.

137

Hình 9.6. Tạo vector cADN tái tổ hợp (theo Nông Văn Hải, 2002)
2.6. Phát hiện dòng tế bào chủ chứa vector tái tổ hợp
Vector và đoạn ADN ngoại lai được trộn lẫn với nhau dưới tác dụng của
enzyme nối ADN-ligase. Sau đó hỗn hợp vector và đoạn ADN ngoại lai được
trộn lẫn với tế bào chủ để thực hiện biến nạp và có 3 khả năng có thể xảy ra: (1)
Tế bào chủ không có plasmid. (2) Tế bào chủ nhận được plasmid không có gene
ngoại lai xen vào; (3) Tế bào chủ nhận dược vector tái tổ hợp. Chính vì vậy
trong kĩ thuật tách dòng cần phải xác định dược đúng dòng tế bào chủ chứa
vector tái tổ hợp. Có thể sử dụng 3 phương pháp cơ bản sau: lai axit nucleic, dựa
vào sự biểu hiện kiểu hình, hiện tượng mất hoạt tính do xen đoạn.
(a) Sử dụng phương pháp lai axit nucleic có hiệu quả trong việc tách dòng

gene mong muốn từ thư viện ADN bằng việc sử dụng mẫu dò được đánh dấu
phóng xạ. Có thể thực hiện theo các bước: làm tan các khuẩn lạc trên giấy
nitrocellulo giải phóng ADN, lai mẫu dò lai với ADN trên màng lai. Việc phát
hiện các phân tử lai thông qua phóng xạ tự ghi.
(b) Phát hiện khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp thông qua biểu hiện kiểu
hình. Các vector được thiết kế mang trình tự điều hoà của gene lacZ, khi biến
nạp vào tế bào chủ, làm biến đổi tế bào chủ có kiểu hình Lac
-
thành Lac
+
. Các vi
khuẩn có kiểu hình Lac
+
được nhận biết nhờ sự chuyển hoá cơ chất X-gal làm
khuẩn lạc có màu xanh. Nếu đoạn ADN ngoại lai được gắn xen vào trình tự điều
hoà của lacZ, làm gene không hoạt động, do vậy không thực hiện được phản ứng
biến đổi X-gal thành màu xanh, vì vậy khuẩn lạc có màu trắng. Nhờ vậy người
ta có thể nhận biết nhanh chóng bằng mắt thường các khuẩn lạc chứa vector tái
tổ hợp.

138
(c) Hiện tượng làm mất hoạt tính do xen đoạn được sử dụng đối với các
vector mang gene kháng thuốc ampiciline (hoặc tetracycline), chứa các điểm
nhận biết của các enzyme cắt hạn chế. Plasmid được mở vòng dưới tác dụng của
một RE mà điểm cắt của nó nằm trên một gene kháng thuốc nào đó và đoạn
ADN ngoại lai được xen vào vị trí mở vòng trên plasmid, làm cho gene kháng
thuốc trên mất hoạt tính. Hỗn hợp trên được biến nạp vào tế bào chủ E. coli, tế
bào chủ có thể có 3 loại kiểu gene và kiểu hình: (1) Tế bào chủ không nhận được
vector sẽ không mọc được trên môi trường có tetracyline (hoặc ampiciline); (2)
Tế bào chủ nhận được vector nhưng gene ngoại lai không gắn được vào vector,

nó sẽ mọc được trên môi trường có ampiciline, tetracycline; (3) Tế bào E. coli
nhận được vector tái tổ hợp, gene amp bị mất hoạt tính do gene lạ xen vào, gene
kháng tetracyline vẫn hoạt động bình thường. Do vậy các tế bào chủ mang
vector tái tổ hợp không mọc được trên môi trường chứa ampiciline, nhưng vẫn
mọc được trên môi trường chứa tetracycline.


§3. BIỂU HIỆN GENE
3.1. Khái niệm
3.1.1. Các hệ biểu hiện gene
Trong tế bào sống, biểu hiện gene được hiểu là quá trình sinh tổng hợp
protein trong mối liên hệ: ADN → ARN → Protein và protein là sản phẩm biểu
hiện gene. Trong kĩ thuật di truyền, biểu hiện gene là hiện tượng protein của
gene ngoại lai được tổng hợp trong tế bào chủ.
Hiện nay có 4 hệ sau hay sử dụng biểu hiện gene như Escherichia coli,
Bacillus subtilis, nấm men (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris) và tế
bào động vật. Tuy nhiên E. coli và nấm men là hai hệ biểu hiện chính hiện đang
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng.
Cho đến nay có thể nói rằng vấn đề biểu hiện gene ngoại lai vẫn còn mang
tính thực nghiệm đối với từng gene, chưa có một mô hình chung cho phép biểu
hiện tối ưu đối với các loại protein khác nhau trong một biểu hiện. Vì vậy, để đạt
được mức độ biểu hiện cao đối với một gene ngoại lai. trong nhiều trường hợp
phải nghiên cứu thăm dò với các yếu tố khác nhau để tìm ra diều kiện tối ưu.
Các protein biểu hiện trong các tế bào khác nguồn gốc có thể được chia
thành 4 nhóm chính:
Nhóm thứ nhất bao gồm các peptit nhỏ có độ dài dưới 80 axit amin. Đây
là đoạn peptit được biểu hiện dễ dàng nhất dưới dạng protein dung hợp (fusion

139
protein) và thường được biểu hiện trong tế bào E. coli.

Nhóm thứ hai là các chuỗi polipeptit thường được tiết ra ngoài tế bào (như
enzyme, cytokin, hormon ) có kích thước trong khoảng 80-500 axit amin. Các
protein thuộc nhóm này có thể biểu hiện được trong cả 4 hệ biểu hiện.
Nhóm thứ 3 gồm các protein tiết và protein đóng vai trò thụ thể trên bề
mặt tế bào có kích thước hơn 500 axit amin.
Nhóm thứ tư bao gồm tất cả các protein không tiết có kích thước lớn hơn
80 axit amin.
Hầu hết các protein đều có thể được biểu hiện trong tế bào E. coli nếu
protein đó không quá nhỏ hoặc quá lớn, hoặc quá kị nước, hoặc chứa quá nhiều
gốc cystein. Các protein nhỏ và polipeptit thường không bền vững trong tế bào
chủ nên muốn biểu hiện tốt trong E. coli thì cần được gắn với một đoàn protein
khác. Đoạn protein này sẽ giúp cho đoàn peptit dược bền vững trong tế bào E.
coli sau đi được tổng hợp và hiện nay nó có còn được dùng như một dấu nhận
biết tinh chế protein lai này. Sở dĩ các protein có chứa nhiều gốc cystein và cầu
disulfit không được biểu hiện tốt trong E. coli là do môi trường bên trong tế bào
E. coli có tính khử cao.
B. subtilis và nấm men mặc dù không phải là hệ được sử dụng rộng rãi
trong nghiên cứu để biểu hiện gene ngoại lai như E. coli nhưng những hệ biểu
hiện này cũng có nhiều ưu điểm đáng chú ý. Điển hình là B. subtilis có khả năng
biểu hiện và tiết rất tốt protein có nguồn gốc từ Prokaryot ra ngoài môi trường
nuôi cấy còn nấm men lại có những ưu điểm quan trọng của cả Eukaryot và
Prokaryot. Nấm men sinh trưởng nhanh và có khả năng chế biến protein sau khi
dịch mã rất tốt để trở thành dạng protein hoạt động mà hệ biểu hiện gene ở vi
khuẩn không có. Hơn nữa nấm men có mức độ an toàn sinh học cao, được sử
dụng nhiều trong công nghiệp dược liệu và thực phẩm. Vì vậy, nấm men rất
được ưa chuộng để biểu hiện các gene của Eukaryot và gene mã hoá cho protein
sử dụng trong thực phẩm và chữa bệnh.
Hệ biểu hiện trong tế bào động vật có khả năng biểu hiện được tất cả
protein của 4 nhóm nhưng tốn thời gian và quá trình chọn lọc, nhân dòng và
nuôi cấy dòng tế bào phức tạp hơn nên hệ biểu hiện này thường không được sử

dụng rộng rãi.
Những đặc tính sinh học phân tử để điều chỉnh sự biểu hiện gene thể hiện
ở (1) Đặc điểm tự nhiên của những trình tự promotor và terminator liên quan
đến dịch mã; (2) Độ mạnh yếu và vị trí bám của ribosome; (3) Số phiên bản của
gene tách dòng; (4) Vị trí tổng hợp protein trong tế bào, (5) Hiệu suất của quá

140
trình giải mã trong tế bào chủ; (6) Sự bền vững của phân tử protein được mã hoá
bởi gene tách dòng trong tế bào chủ.
Mức độ biểu hiện gene ngoại lai (foreign gene) còn phụ thuộc vào sự
nhận biết của cơ thể vật chủ. Hiện nay đã có phổ rất rộng các cơ thể biểu hiện
gene ngoại lai (cả Prokaryot và Eukaryot) nhưng đa số các sản phẩm được sản
xuất bởi công nghệ ADN tái tổ hợp được tổng hợp ở E. coli.
3.1.2. Biểu hiện gene từ những promotor mạnh và điều khiển được
Yêu cầu tối thiểu với một hệ thống biểu hiện gene có hiệu quả là sự có
mặt của một trình tự promotor mạnh và có thể điều khiển được (strong and
regulatable promotor) nằm ở phía trước gene tách dòng.
Promotor mạnh là một promotor có ái lực cao với enzyme ARN
polimerase và sẽ bảo đảm cho trình tự nằm sau promotor dược phiên mã với tần
suất cao. Khả năng điều khiển promotor đã cho phép tế bào chủ kiểm soát quy
mô phiên mã một cách chính xác. Promotor lac-operon đã được sử dụng rộng rãi
trong việc biểu hiện gene tách dòng. Ngoài ra nhiều promotor đã được phân lập
từ nhiều cá thể khác nhau để sử dụng trong biểu gene. Phương pháp tối ưu hoá
sự biểu hiện của gene tách dòng là gắn gene đó vào plasmid dưới sự kiểm soát
của promotor phiên mã liên tục và mạnh. Tuy nhiên, sự biểu hiện liên tục và ở
mức độ cao của một gene ngoại lai thường gây hại cho tế bào chủ vì nó gây ra
sự thiếu hụt năng lượng, mất cân bằng trong tế bào là suy giảm những chức năng
thiết yếu của tế bào. Đồng thời một số hay toàn bộ các plasmid chứa gene tách
dòng sẽ bị mất đi sau một số lần phân chia tế bào. Những tế bào không chứa các
plasmid mang gene tách dòng sẽ phân chia mạnh hơn các tế bào chứa plasmid

mang gene tách dòng và các tế bào không chứa các plasmid mang gene tách
dòng sẽ chiếm ưu thế. Điều này đã cản trở quá trình biểu hiện và sản xuất các
sản phẩm từ gene tách dòng. Để khắc phục khó khăn này người ta có ý tưởng
mong muốn kiểm soát được sự phiên mã của gene táchdòng ở mức chỉ cho gene
này biểu hiện ở một giai đoạn sinh trưởng hất định của tế bào. Sử dụng một
promotor mạnh và điều khiển được sẽ là giải pháp thực hiện mong muốn đó.
Promotor mạnh và điều khiển được đang sử dụng rộng rãi là promotor của
operon lac và tryp của E. conli Promotor lac được thiết kế và chế tạo invitro
chứa:
- Vùng -10 của lac promotor.
- Vùng -35 của tryp promotor.
- Promotor bên trái (p
L
) của bacteriophage
λ

- Promotor gene 10 của bacteriophage T7.

141
Mỗi promotor này tương tác với chất ức chế và nhờ đó có thể tắt hoặc mở
sự phiên mã của những gene tách dòng. Mỗi promotor lại dược nhận ra bởi cấu
trúc của ARN polimerase holoenzyme nhờ nhân tố
σ
(nhân tố
σ
bám vào lõi
của ARN polimerase để hình thành holoenzyme, định hướng cho enzyme bám
vào những vùng promotor).
Promotor lac bị ức chế (tắt) bởi protein kìm hãm lac khi môi trường thiếu
lactose và được mở bằng cách bổ sung vào môi trường nuôi cấy lactose hoặc

isopropyl-
β -D-thiogalactopyranoside (IPTG). Lactose và IPTG bán vào
promotor lac và quá trình phiên mã sảy ra. Quá trình phiên mã từ promotor lac
còn được điều khiển bởi protein hoạt hoá chuyển hoá (catabolite activator
protein-CAP). Khi CAP bám vào promotor lac sẽ làm tăng ái lực của promotor
với enzyme phiên mã.
Promotor tryp bị ức chế bởi phức hệ protein kìm hãm, phức hệ này bám
vào operator tryp và ngăn can quá trình phiên mã. Promotor mở bằng việc loại
bỏ tryptophan hoặc thêm vào môi trường axit 3-indoleacrylic.
Promotor p
L
được kiểm soát bởi protein kim hãm cI của bacteriophage
λ
.
Promotor của bacteriophage T7 đòi hỏi phải có enzyme polimerase T7 ARN để
thực hiện phiên mã.
3.2. Kĩ thuật biểu hiện gene
Gene được biểu hiện là gene đã được phân lập và đã biết trình tự. Các
gene này có thể được phân lập bằng các phương pháp khác nhau. Sau khi có
đoạn gene mong muốn chúng sẽ được biểu hiện trong các hệ thích hợp theo các
bước các cạnh.
Bước 1: Lựa chọn hệ thích hợp để biểu hiện gene.
Bước 2: Dựa vào trình tự gene, thiết kế các đoạn mồi để nhân gene. Tổng
hợp mồi.
Bước 3: Chuẩn bị ADN không để nhân gene.
Bước 4: Nhân gene bằng PCR từ ADN hệ gene của vi khuẩn hoặc từ ngân
hàng cADN nhưng tốt nhất là nhân gene trực tiếp từ chính plasmid mang gene
đã từng dùng để đọc trình tự gene đó.
Bước 5: Đưa gene vào vector tách dòng và biến nạp vào tế bào E. coli để
khuếch đại dòng gene.

Bước 6: Tách plasmid từ các thể biến nạp E. coli. Kiểm tra gene trong
vector tách dòng bằng enzym hạn chế. Kiểm tra gene và đặc biệt là chiều của
gene trong vector biểu hiện. Gene cần biểu hiện phải nằm đúng chiều của
prromotor.

142
Bước 7: Đưa gene vào vector biểu hiện và biến nạp vào tế bào E. coli
Bước 9: Biến nạp vector biểu hiện có mang gene vào tế bào chủ (E. coli
hoặc nấm men). Bắt đầu từ bước này, các thao tác để biểu hiện gene ở các chủng
khác nhau là khác nhau.
Bước 10: Kiểm tra sự biểu hiện của gene.
3.2.1. Lựa chọn hệ biểu hiện
E. coli và Nấm men là hai hệ được sử dụng nhiều trong kĩ thuật biểu hiện
gene. E. coli được dùng để biểu hiện rất nhiều gene có nguồn gốc cả từ
Prokaryot và Eukaryot. Nấm men là cơ thể có ích được sử dụng rất rộng rãi để
sản xuất nhiều loại protein tái tổ hợp dùng làm dược liệu để chữa bệnh và cả
protein dùng trong công nghiệp thực phẩm. Các gene khi được biểu hiện trong tế
bào E. coli tránh được hiện tượng protein bị glicosil hoá, trong khi đó ở nấm
men lại có hiện tượng glicosil hóa. Tế bào E.coli sinh trưởng nhanh, thuận tiện
cho các thao tác sinh học phân tử nên E. coli cũng thường được chọn để biểu
hiện gene dùng cho những mục đích nghiên cứu khác nhau. Tuy nhiên, việc biểu
hiện các đoạn gene lớn trong tế bào E. coli có những hạn chế như protein tái tổ
hợp bị tồn tại ở dạng không tan, dạng thể vùi và không được tiết ra ngoài môi
trường. Ở nấm men các protein tái tổ hợp này thường được tiết ra ngoài môi
trường rất hiệu quả, có độ tinh sạch cao và đảm bảo hoạt tính sinh học của
chúng. Men có thể biểu hiện và tiết tốt các sản phẩm có nguồn gốc từ động vật,
thực vật bậc cao, nấm và vi khuẩn ra ngoài môi trường.
3.2.2. Thiết kế mồi để nhân gene
Mồi dùng để nhân gene bằng PCR là một cặp mồi (mồi xuôi và ngược
được thiết kế để bám vào vùng tận cùng ở 2 đầu của gene cần nhân.

Trước khi thiết kế mồi để nhân gene, việc đầu tiên quan trọng là phải
kiểm tra trình tự gene, quyết định đoạn gene cần nhân để đưa vào biểu hiện và
kiểm tra các điểm cắt của enzyme hạn chế trong đoạn gene. Để tiện cho việc đưa
gene vào vector biểu hiện, các đoạn mồi nhân gene thường được thiết kế có chứa
thêm trình tự của enzyme hạn chế ở 2 đầu tận cùng của gene. Khi đó gene có thể
được cắt trực tiếp bằng các enzyme này để dưa vào vector biểu hiện. Trình tự
enzyme hạn chế được đưa thêm vào mồi cũng được lựa chọn rất kĩ càng. Trước
hết các trình tự này phải có mặt trong vùng đa nối (polilinkers, multiple cloning
sites) của vector biểu hiện. Tiếp theo, các trình tự này phải là trình tự rất hiếm
gặp ở trong gene cần biểu hiện (tốt nhất là trình tự này không có mặt trong gene
cần biểu hiện). Trình tự enzyme được thêm vào mồi xuôi nên là trình tự enzyme
giới hạn đứng ngay đầu 5' của vùng đa nối còn enzyme hạn chế được thêm vào
mồi ngược là trình tự enzyme đứng tận cùng đầu 3' của vùng đa nối. Nếu 2 mồi

143
có thêm 2 enzyme giới hạn khác nhau thì enzyme giới hạn ở mồi xuôi phải đứng
trước cnzyme giới hạn ở mồi ngược trong vùng đa nối, tính theo chiều promotor
để đảm bảo đoạn gene đưa vào sẽ nằm xuôi chiều với promotor.
Mồi luôn được thiết kế và được ghi theo chiều từ 5' đến 3' của gene. Mồi
xuôi có trình tự tương đồng với đoạn trình tự của sợi không mã hoá (sợi
antisense). Đoạn trình tự tương đồng thường được sử dụng ở mỗi mồi để đảm
bảo kết cặp đặc hiệu là khoảng trên 15 nucleotit trở lên. Tận cùng đầu 5' của mồi
nên để dư ra ít nhất một nucleotit để đoạn gene nhân lên có trình tự được nguyên
vẹn. Nucleotit dư ra ở đầu 5' không nên là nucleotit có khả năng bắt cặp tương
đồng tốt với nucleotit ở tận cùng đều 3' trên cùng đoạn mồi, kích thước đoạn
mồi cũng không nên quá dài. Tối thiểu chỉ cần 18 nucleotit của đoạn mồi bắt cặp
chính xác với đoạn gene cần nhân là được. Tất nhiên độ dài của đoạn mồi có thể
thay đổi phụ thuộc vào tỉ lệ các gốc A, T tại vị trí trong đoạn gene mà đoạn mồi
cần bắt gặp.
Sau khi thiết kế được mồi, việc quan trọng là kiểm tra sự dịch mã của

đoạn gene sẽ được nhân lên bằng 2 mồi vừa thiết kế trong vector biểu hiện.
Khung đọc của gene phải được đảm bảo một cách nghiêm ngặt.
3.2.3. Chuẩn bị ADN khuôn để nhân gene
Để nhân được gene bằng PCR, nguyên liệu đầu tiên cần phải chuẩn bị đó
là ADN khuôn.
3.2.4. Nhân gene bằng PCR
Trước hết, sợi ADN khuôn phải được biến tính để sợi ADN khuôn trở
thành dạng sợi đơn. Sau đó việc tổng hợp và nhân gene diễn ra với khoảng 25 -
30 chu kì. Sau khi kết thúc các chu kì trên, mẫu được ủ ở 75
0
C trong khoảng 3
đến 6 phút, sau đó giữ mẫu ở 4
0
C.
Để tiến hành nhân gene bằng PCR, ngoài 2 đoạn mồi và ADN sợi khuôn
ra thì phức hợp mẫu được trộn còn có nước khử ion vô trùng, 4 loại
deoxyribonucleotit, Taq DNA polimerase hoặc Vent polimerase, đệm thích hợp
cho Taq polimerase hoặc Vent polimerase, MgCl
2
. Thông thường MgCl
2
có sẵn
trong đệm nên có thể không cần phái bổ sung thêm nữa. Nồng độ MgCl
2
ở trong
mẫu càng lớn thì càng làm tăng khả năng bắt cặp không đặc hiệu của mồi. Taq
polimerase tổng hợp gene có dư ra một nucleotit A ở đầu 3' còn Vent polimerase
tổng hợp gene cho đầu bằng. Vì vậy, tuỳ theo điều kiện tách dòng mà chọn Taq
hay Vent cho PCR. Nếu sản phẩm PCR được đưa vào vector tách dòng là đầu
bằng thì nên chạy PCR bằng Vent. Vent ít gây ra sai sót trong trình tự gene được

nhân hơn Taq. Nếu sử dụng một số vector tách dòng được mua từ các hãng, các
vector này đã được thiết kế ở dạng thẳng và có dư nucleotit T có khả năng kết

144
cặp tương đồng với nucleotit A dư ra ở sản phẩm PCR thì nên sử dụng Taq
polimerase.
Kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose. ADN tích điện âm có khả năng
chuyển động trong điện trường theo chiều từ cực âm tới cực dương. Tốc độ
chuyển động phụ thuộc vào 2 yếu tố: dạng tồn tại của ADN và kích thước ADN.
Các ADN có kích thước lớn sẽ chuyển động chậm trong gel agarose còn ADN
có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn. CÁC ADN ở dạng siêu xoắn cũng
chuyển động nhanh hơn ADN dạng thẳng. Từ một phạm vi nhất định phụ thuộc
vào nồng độ gel agarose, kích thước phân tử tuyến tính với quãng đường địch
chuyển của ADN trên gel agarose. Thường các đoạn gene có kích thước từ 300
đến 10000bp có thể được phân tách trên gel agarose 0,8%. Đoạn gene càng nhỏ
thì nồng độ agarose càng phải tăng lên và để phát hiện các đoạn gene nhỏ tới vài
chục nucleotit hoặc một chuỗi nhỏ nucleotit người ta thường phải sử dụng gel
poliacrylamid. Các đoạn gene trên gel agarose được phát hiện bằng cách nhuộm
với EtBr hoặc bằng đánh dấu phóng xạ. Thông thường nhất là các đoạn gel được
nhuộm bằng ethidium bromit và được phát hiện bằng đèn chiếu tia UV.
Để xác định được kích thước sản phẩm PCR, thường sản phẩm PCR được
chạy song song với đoạn phức hợp ADN chuẩn đã biết kích thước.
3.2.5. Đưa gene vào vector tách dòng và biến nạp vào tế bào E. coli
Đưa gene vào vector tách dòng
Sản phẩm PCR gắn trực tiếp với vector và sau đó được biến nạp vào tế
bào E. coli DH5
α
để chọn lọc. Plasmid dùng cho tách dòng dược sử dụng rộng
rãi là pCR2.1 và pUC118. Hai vector tách dòng này có khả năng cho số lượng
bản sao lớn trong tế bào (200 bản sao/tế bào), có khả năng tải các đoạn gene tốt

và ổn định trong tế bào chủ. Để đưa đoạn gene vào vector tách dòng bằng đầu
bằng, trước hết plasmid phải được cắt trực tiếp bằng enzyme hạn chế đầu bằng
có mặt trong vùng đa nối của vector tách dòng. Sau khi được cắt bằng một
enzyme, plasmid rất dễ bị đóng vòng ngay cả khi không có DNA-ligase, vì vậy
vector đã được mở vòng phải được xử lí bằng Alkaline photphatase. Enzyme
này có khả năng loại gốc phosphate ở đầu 5' của ADN.
Sản phẩm PCR không có gốc phosphate. Vì vậy, để có thể gắn với vector
đã bị loại phosphate thì sản phẩm PCR phải được gắn thêm gốc phosphate nhờ
polinucleotit kanase. Nếu sản phẩm PCR được nhân lên bằng Taq polimerase thì
trước khi gắn phosphate, đoạn ADN đó phải được làm bằng đầu bằng enzyme.
Xử lí ADN bằng enzyme hạn chế
Phản ứng nối ghép gene

145
Biến nạp sản phẩm lai vào tế bào E. coli: Có hai cách chính để biến nạp
sản phẩm lai vào tế bào E. coli là phương pháp sốc nhiệt và phương pháp xung
điện.
3.2.6. Tách ADN plasmid và kiểm tra gene trong plasmid
• Tách plasmid
Các tế bào E. coli mang plasmid sau khi nuôi cấy đến pha dừng thì được li
tâm thư lại. Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạo sức căng
bề mặt. Sau đó ADN hệ gene và protein được tủa lại cùng với SDS bằng muối
axetat kali và bị loại bỏ khỏi ADN plasmid bằng cách li tâm. ADN plasmid được
tủa lại bằng cồn.
• Kiểm tra gene trong plasmid
Gene ngoại lai trong plasmid được kiểm tra sơ bộ dựa trên trình tự các
enzyme hạn chế có trong gene. Enzyme hạn chế được chọn để cắt kiểm tra là
enzyme có thể cho ra những đoạn ADN có kích thước thích hợp có thể phát hiện
được trên gel agarose.
3.2.7. Đưa gene vào vector biểu hiện

Các plasmid tách dòng mang đoạn gene mong muốn được cắt hoàn toàn
bằng hai enzyme hạn chế đã được thiết kế ở hai mồi. Vector biểu hiện cũng
được cắt bằng enzyme tương tự. Sau đó vector và đoạn gene có kích thước như
mong muốn được tinh sạch từ gel agarose và được nối lại với nhau bằng DNA-
ligase.
Nếu đoạn gene được đưa vào vector biểu hiện bằng một enzyme hạn chế
thì phải kiểm tra chiều của gene để tránh hiện tượng các đoạn gene nằm ngược
chiều với chiều phiên mã các promotor.
3.2.8. Biến nạp vector biểu hiện vào tế bào chủ
Việc biến nạp vector vào tế bào E. coli và tế bào nấm men là khác nhau.
Các tế bào E. coli thường được biến nạp bằng phương pháp sốc nhiệt (như đã
được trình bày ở phần trên) còn các tế bào nấm men được biến nạp bằng phương
pháp xung điện hoặc bằng muối lithium acetat những phương pháp xung điện
cho hiệu quả biến nạp tốt hơn và được sử dụng rộng rãi hơn là phương pháp
dùng muối.
3.2.9. Kiểm tra sự biểu hiện của gene
Bước quan trọng để kiểm tra sự biểu hiện của gene là nuôi cấy các thể
biến nạp trong môi trường có chất cảm ứng promotor để protein tái tổ hợp có thể
được tổng hợp. Tiếp theo, để kiểm tra protein tái tổ hợp người ta thường dùng
phương pháp điện di protein tổng số trên gel acrylamit để phát hiện sơ bộ băng
protein tái tổ hợp.

146
3.3. Biểu hiện gene ngoại lai ở vi khuẩn E. coli
Trong biểu hiện gene ở E. coli cần chú ý đối với các protein độc và trở
ngại lớn nhất là một số protein ngoại lai rất độc đối với E. coli (ví dụ như RIPs)
hoặc protein có khả năng gắn vào màng trong vi khuẩn E. coli và phá huỷ phức
hợp màng. Như vậy việc tổng hợp những protein này chắc chắn bị hạn chế. Tuy
nhiên, E. coli vẫn là một chủng chủ có giá trị để biểu hiện gene ngoại lai và
trong nhiều trường hợp nó vẫn là thủng được ưa chuộng sử dụng. Khi biểu hiện

bất cứ một gene ngoại lai nào ở E. coli cần quan tâm đến việc lựa chọn plasmid
và promolor phù hợp cho quá trình khởi đầu phiên mã.
3.3.1. Cấu trúc vector biểu hiện ở E. coli
Vector dùng để biểu hiện gene Prokaryot được thiết kế đầy đủ bao gồm
tập hợp tác nhân tố di truyền được sắp xếp hợp lí nhằm điều khiển tối ưu cả quá
trình phiên mã, dịch mã để tổng hợp nên protein có chức năng dùng làm dấu
hiệu chọn lọc. Gene thường được sử dụng trong vector biểu hiện là gene kháng
chất kháng sinh. Gene này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nhận biết các dòng tế
bào mang plasmid. Đối với plasmid tự sao chép: một trình tự không thể thiếu đó
là tâm sao chép. Tâm sao chép quyết định số lượng bản copy của plasmid trong
một tế bào. Để tạo điều kiện thuận lợi cho việc đưa các đoạn gene vào vector
biểu hiện theo đúng chiều promotor. trên vector luôn phải chứa vùng đa nối
(Poilinker region) mang các trình tự của enzyme hạn chế có tần số xuất hiện
thấp trên các gene cấu trúc.
3.3.1.1. Promotor
Các promotor có khả năng biểu hiện gene cao có những đặc điểm chung
sau: (1) promotor mạnh có khả năng tạo protein ngoại lai lớn hơn 10 đến 30%
protein tổng số của tế bào. (2) Promotor chỉ hoạt động phiên mã gene ở mức độ
cơ sở (phiên mã khi không cảm ứng) với mức độ nhỏ tối đa: (3) Promotor được
cảm ứng theo cách đơn giản nhưng hiệu quả cao. Sự cảm ứng bằng nhiệt hoặc
bằng hoá chất thường được sử dụng rộng rãi để tạo ra lượng lớn protein mong
muốn.
Operon lac là một hệ điều hoà hoạt động của gene ở Prokaryot đượcbiết
đến sớm nhất và promotor lac được sử dụng rộng rãi để tạo protein ngoại lai.
Promotor từ operon tryptophan của E. coli được lựa chọn để biểu hiện
protein ở bên trong tế bào. Promotor tryp có một số ưu điểm: (1) là promotor
được nghiên cứu rất kĩ; (2) là promotor mạnh, các gene ngoại lai được phiên mã
và dịch mã bởi promotor tryp thường tạo ra lượng protein lớn; (3) mức biểu hiện
gene cơ bản (khi promotor không được cảm ứng) tương đối thấp, vì vậy việc
biểu hiện protein ngoại lai sẽ không ảnh hưởng tới sự sinh trưởng của tế bào và

147
làm cho plasmid tồn tại ổn định hơn trong tế bào; (4) vector biểu hiện sử dụng
promotor này có thể biến nạp vào hầu hết các chủng vi khuẩn E. coli, nhờ đó
người ta có thể chọn bất kì chủng E. coli nào có đặc điểm mong muốn để biểu
hiện gene; (5) việc cảm ứng promotor là rất đơn giản kể cả khi sử dụng bình lắc
hoặc nồi lên men.
3.3.1.2. Terminator (vùng kết thúc phiên mã)
Quá trình phiên mã được bắt đầu từ promotor, sau đó sợi mARN được
kéo dài đến khi gặp một trình tự đặc hiệu, tại đó quá trình phiên mã bị dừng lại.
Trình tự đặc hiệu đó là vùng kết thúc phiên mã (terminator). Có hai cơ chế
ngừng phiên mã là cơ chế làm giảm tốc độ phiên mã và cơ chế dừng không đặc
hiệu. Vị trí giảm phiên mã (attenuator) mang đặc điểm của một terminator đơn
giản, được gắn giữa promotor và gene cấu trúc đầu tiên trong một operon. Vì
attenuator là yếu tố điều khiển âm (negative regulatory elements) nên thường
không được sử dụng trong hệ biểu hiện.
Quá trình ngừng phiên mà không đặc hiệu có thể xuất hiện trong bất kì
một quá trình phiên mã nào do có chứa trình tự trên ARN thông tin giống với
trình tự của terminator một cách ngẫu nhiên. Các yếu tố chống lại sự dừng phiên
mã (antiterminator) cũng được đưa vào vector biểu hiện để chắc chắn đoạn ARN
thông tin được tổng hợp có độ dài đầy đủ.
3.3.1.3. Peptit tín hiệu (signal peptite)
Các protein ngoại lai được tổng hợp trong tế bào E. coli cần thiết phải
được tiết ra ngoài vì: (1) E. coli tiết rất ít protein ra ngoài môi trường nên protein
ngoại lai nếu được tiết ra sẽ có độ tinh sạch cao. (2) Protein tiết ra ngoài khoang
chu chất (perplasmid space) có khả năng hình thành cấu trúc bậc 4 đúng để trở
thành protein có hoạt tính sinh học. Quá trình cuộn xoắn và hình thành cầu
disulfit của protein nằm trong tế bào thường bị hạn chế và dẫn đến sai hỏng
trong cấu trúc protein. (3) Protein khi được tiết ra ngoài sẽ tránh bị phân cắt bởi
một số protease có trong tế bào.

Để được tiết ra khỏi màng trong tế bào, các chuỗi polipeptit bắt buộc phải
có trình tự peptit tín hiệu nằm ở tận cùng đầu N. Thông thường chuỗi peptit tín
hiệu được cấu tạo gồm 3 vùng: vùng tận cùng đầu N, vùng tận cùng đầu C và
vùng kị nước. Mỗi vùng có tối đa 20 axit amin và tối thiểu là 2 axit amin đối với
vùng N, 8 axit amin đối với vùng kị nước và 6 axit amin đối với vùng C.
3.3.1.4. Điểm sao chép (Ori)
Số lượng bản sao của plasmid trong tế bào phụ thuộc vào nhân tố khởi
đầu sự sao chép ADN tại một vị trí đặc hiệu gọi là tâm sao chép (Ori). Đối với
các plasmid sao chép tự do trong tế bào chủ, số lượng bản sao ít nhất cũng bị

148
ảnh hưởng bởi tốc độ sinh trưởng của tế bào. Những plasmid đa phiên bản
thường bị mất đi qua các thế hệ tế bào (10
-5
- 10
-6
trên một thế hệ) khi tế bào
mang plasmid được nuôi cấy trong môi trường không có áp lực chọn lọc hoặc
gene trên plasmid mã hoá cho protein gây độc cho tế bào.
3.3.1.5. Dấu chuẩn chọn lọc
Để tiện lợi cho việc nhận ra các tế bào biến nạp có mang plasmid, thông
thường người ta sử dụng môi trường nuôi cấy mà ở đó chỉ có tế bào có tính trạng
chọn lọc nhất định mới có thể sinh trưởng được. Có một cách giúp dễ dàng nhận
biết các thể biến nạp mang plasmid biến nạp đó là đưa các đoạn gene kháng
kháng sinh vào plasmid đó. Sự có mặt của plasmid trong tế bào giúp cho tế bào
sống sót trên môi trường có chất kháng sinh. Vì vậy, gene kháng kháng sinh có
mặt ở hầu hết các vector tách dòng hiện đang được sử dụng như dấu chuẩn chọn
lọc.
3.3.1.6. Vùng đa nối (Polilinker region)
Vùng đa nối bao gồm trình tự nhận biết đặc hiệu của các enzyme hạn chế

hay được sử dụng giúp cho quá trình đưa đoạn gene ngoại lai vào vector biểu
hiện trở nên dễ dàng. Hầu hết trình tự của các enzyme hạn chế trong vector biểu
hiện đều được đặt theo đúng khung đọc và nằm sau đoạn peptit tín hiệu (Signal
peptit). Để tiện cho việc ghép nối các đoạn gene cần biểu hiện, các điểm nhận
biết của các enzyme hạn chế trong vùng da nối được thiết kế sao cho chúng chỉ
tồn tại như những vị trí duy nhất trên toàn bộ phân tử plasmid.
3.3.2. Quá trình tổng hợp protein ngoại lai
Quá trình khởi đầu dịch mã trên phân tử ARN thông tin ở E. coli đòi hỏi
một trình tự nhận biết đặc hiệu Shine - Dalgarno (SD) bổ sung với tận cùng 3'
của ARN ribosom 16S. Đó là trình tự 5' - UAAGGAGG - 3' đứng trước bộ ba
khởi đầu. Bộ ba khởi đầu thông thường nhất là AUG. Có khoảng 8% bộ ba khởi
đầu dịch mã GUG, ngược lại trình tự UUG, AUU là trình tự khởi đầu rất hiếm
gặp, thường chỉ có mặt ở các gene điều khiển một cách tự phát (ví dụ gene mã
hoá cho protein S20 của ribosome, và nhân tố khởi đầu số 3). Khoảng cách từ
SD đến mã khởi đầu thường là 8 nucleotit để đảm bảo sự khởi đầu dịch mã tối
ưu nhất. Tuy nhiên, sự khởi đầu dịch mã chỉ ảnh hưởng rõ rệt khi khoảng cách
đó giảm xuống dưới 4 nucleotit hoặc dài hơn 14 nucleotit. Thường ở Prokaryot,
quá trình phiên mã và dịch mã diễn ra rất gần nhau, vì vậy cấu trúc bậc 2 của
mARN có thể bao quanh trình tự SD làm cho quá trình biểu hiện gene bị giảm.
Điều này được giải quyết bằng cách làm tăng trình tự tương đồng của SD với
trình từ 5' UAAGGAGG và tăng số lượng adenin trong vùng khởi đầu. Cấu trúc
của đoạn thêm vào của ARN thông tin (Dowstream Box - DB) có ảnh hưởng tới

149
khởi đầu dịch mã được đặt vào đầu mã khởi đầu và bổ sung với bazơ nitơ 1469-
1483 của rARN 16S. Các DB có trình tự là 5' - AUGAAUCACAAAGUG 3'
đóng vai trò chủ yếu như nhân tố tăng cường dịch mã. Mặc dù khi đưa trình tự
DB vào đầu 5' của gene mã hoá cho protein tái tổ hợp có thể làm thay đổi trình
tự axit amin của chúng. Trong tế bào tốc độ kéo dài các chuỗi polipeptit không
xảy ra với tốc độ như nhau. Ở E. coli các bộ ba trong gene có mức độ sử dụng

khác nhau phụ thuộc vào sự có mặt của các ARN vận chuyển tương ứng trong tế
bào. Vì vậy các gene được biểu hiện yếu có thể là do gene có chứa nhiều bộ ba
chỉ dược nhận biết bởi một số loại ARN vận chuyển hiếm gặp. Trong 6 bộ ba
mã hoá cho Leu UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG, thì chỉ có CUG được
nhận biết tốt và được biểu hiện cao bởi ARN vận chuyển đặc thù cho bộ ba này
trong tế bào E. coli. Ở E. coli, chuỗi peptit mới tổng hợp rời khỏi phức hệ ARN
thông tin và ribosom nhờ các nhân tố nhận biết mã kết thúc: RF1 nhận biết mã
UAA và UAG còn RF2 nhận biết UAA, UGA. Ba mã kết thúc UAA, UAG và
UGA có hiệu quả dừng dịch mã khác nhau, trong đó bộ ba UAA được các nhân
tố kết thúc dịch mã nhận biết tốt nhất.
3.3.3. Quá trình sửa đối protein sau khi dịch mã
3.3.3.1. Quá trình thuỷ phân do protease
Việc biểu hiện protein ngoại lai trong tế bào E. coli nhiều khi không hiệu
quả do các protein này bị thuỷ phân bởi protease có trong tế bào chủ. Có nhiều
bằng chứng cho thấy quá trình thuỷ phân này phụ thuộc vào năng lượng. Vì vậy,
các thể đột biến ảnh hưởng tới protease phụ thuộc năng lượng sẽ đảm bảo ổn
định của protein ngoại lai. Bên cạnh đó việc định hướng protein tiết ra ngoài
khoang chu chất hoặc ra môi trường nuôi cấy tế bào ở nhiệt độ thấp, cho gene
ngoại lai biểu hiện cùng với sự biểu hiện của phân tử "bảo mẫu ("chaperone").
Trong tế bào các protease này có chức năng quan trọng là thuỷ phân các protein
bất thường và proteinkhông hoàn thiện.
3.3.3.2. Quá trình tiết protein
Một trong những vấn đề hay gặp khi biểu hiện protein ở nội bào của tế
bào E. coli là chúng thường tạo thành thể vùi (inclusion bodies). Mặc dù biểu
hiện protein dưới dạng thể vùi cũng có một số ưu điểm nhất định nhưng protein
tạo ra thường bị mất hoạt tính sinh học và quá trình tái tạo lại cấu trúc
(refolding) tương đối phức tạp và tốn kém. Hầu hết protein được biểu hiện trong
E. coli đều được thiết kế để sau khi biểu hiện chúng được chuyển ra khoang chu
chất (perplasmic space) của tế bào. Một yếu tố không thể thiếu để protein có thể
được chuyển qua màng trong ra ngoài khoang chu chất là đoạn peptit tín hiệu.

3.3.3.3. Hình thành cấu trúc không gian của protein

150