nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng enzyme protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá

i

MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 3
1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC 3
1.1.1. Mực ống (squid) 3
1.1.2. Mực nang (cutlefish) 4
1.1.3. Mực tuộc (octopus) 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME 6
1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN 11
1.3.1. Quá trình thủy phân 11
1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein 13
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme 15
1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN TRÊN THẾ
GIỚI VÀ ỨNG DỤNG 18
CHƯƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU 24
2.1.1. Phế liệu mực 24
2.1.2. Ezyme Protease 25
2.1.3. Cá kèo : 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26
2.2.1. Phương pháp thu nhận và xử lý mẫu 26
2.2.2. Phương pháp phân tích hóa học: 26
2.2.3. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu 29
2.2.4. Một số thiết bị sử dụng trong đề tài 39
2.2.5. Phương pháp xử lý số liệu 40
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41

3.1. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA PHẾ LIỆU MỰC TUỘC 41


ii

3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ THÍCH HỢP CHO QUÁ TRÌNH THỦY
PHÂN PROTEIN CỦA PHẾ LIỆU MỰC 41
3.2.1. Xác định loại enzyme protease 41
3.2.2. Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase 45
3.2.3. Ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 49
3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình thủy phân 53
3.2.5. Xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá trình thủy phân 56
3.2.6. Xác định tỷ lệ ẩm cho quá trình thủy phân 58
3.2.7. Xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung làm chất phòng thối cho
quá trình thủy phân 62
3.3. THỬ NGHIỆM DÙNG DỊCH THỦY PHÂN PHẾ LIỆU MỰC LÀM
THỨC ĂN BỔ SUNG CHO CÁ 67
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 71
TÀI LIỆU THAM KHẢO 72

iii


DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN

TÊN BẢNG Trang

Bảng 2.1. Điều kiện làm việc của Neutrase, Alcalase và Protamex 25
Bảng 2.2. Giá trị các hằng số , ß, h
total
, của protein từ các vật liệu khác nhau
(Adler-Nissen 1986, trích từ P.M. Nielsen và cộng sự, 2001) 28
Bảng 3.1. Thành phần khối lượng của mực (%) 41
Bảng 3.2. Thành phần hóa học của phế liệu mực (%) 41
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của loại enzyme tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo
thời gian của các mẫu thủy phân . 42
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase tới sự thay đổi trạng thái cảm

quan theo thời gian của các mẫu thủy phân . 46
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của pH tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời gian
của các mẫu thủy phân 50
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời
gian của các mẫu thủy phân . 54
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm tới sự thay đổi trạng thái cảm quan theo thời
gian của các mẫu thủy phân . 59
Bảng 3.8. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng N
aa
, N
NH3
của
dịch thủy phân dưới ảnh hưởng của NaCl và sorbitol bổ sung. 63
Bảng 3.9. Kết quả phân tích cảm quan, DH (%) và hàm lượng N
aa
, N
NH3
của
dịch thủy phân phế liệu mực theo thời gian. 67









iv

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ TRONG LUẬN VĂN

TÊN HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang
Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa 4
Hình 1.2. Mực nang vân hổ 5
Hình 1.3. Mực tuộc 5
Hình 1.4. Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004 6
Hình 2.1. Mực tuộc 24
Hình 2.2. Phế liệu mực tuộc thu gom từ xí nghiệp chế biến 24
Hình 2.3. Cá kèo 25
Hình 2.4. Bể nuôi thử nghiệm cá kèo 25
Hình 2.5. Phản ứng tạo phức của thuốc thử OPA với hợp chất chứa nhóm
amino (H
2
N-R) 27
Hình 2.6. Qui trình thủy phân phế liệu mực 29
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định loại enzyme protease thích hợp cho
quá trình thủy phân 30
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme protease thích hợp cho
quá trình thủy phân 31
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến quá trình
thủy phân 32
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá
trình thủy phân 33
Hình 2.11. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định pH và nhiệt độ tối thích cho quá
trình thủy phân 34
Hình 2.12. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ ẩm thích hợp cho quá trình
thủy phân 35
Hình 2.13. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ NaCl và sorbitol bổ sung

thích hợp cho quá trình thủy phân 36


v

Hình 2.14. Qui trình nuôi thử nghiệm cá kèo bằng các dịch thủy phân phế liệu
mực 37
Hình 2.15. Thiết bị xác định protein theo phương pháp Kejldahn 39
Hình 2.16. Máy so màu UV/VIS 39
Hình 2.17. Thiết bị điện di 39
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến độ thủy phân
(DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân 43
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng N
aa

theo thời gian của các mẫu thủy phân 43
Hình 3.3. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của các loại enzyme đến hàm lượng
N
NH3
theo thời gian của các mẫu thủy phân 44
Hình 3.4. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến độ thủy
phân (DH %) theo thời gian của các mẫu thủy phân 47
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm
lượng N
aa
theo thời gian của các mẫu thủy phân 47
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme Alcalase đến hàm
lượng N
NH3
theo thời gian của các mẫu thủy phân 48

Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến độ thủy phân (DH %) theo
thời gian của các mẫu thủy phân 51
Hình 3.8. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng N
aa
theo thời gian
của các mẫu thủy phân 51
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến hàm lượng N
NH3
theo thời
gian của các mẫu thủy phân 52
Hình 3.10. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ thủy phân (DH %)
theo thời gian của các mẫu thủy phân 55
Hình 3.11. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng N
aa
theo
thời gian của các mẫu thủy phân 55
Hình 3.12. Đồ thị biễu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng N
NH3
theo
thời gian của các mẫu thủy phân 56


vi

Hình 3.13. Đồ thị mặt đáp ứng DH (%)

theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân 57
Hình 3.14. Đồ thị đường mức DH (%) theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân 57
Hình 3.15. Đồ thị mặt đáp ứng N
aa

theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân 58
Hình 3.16. Đồ thị đường mức N
aa
theo pH và nhiệt độ tại 6 giờ thủy phân 58
Hình 3.17. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến độ thủy phân (DH %)
theo thời gian của các mẫu thủy phân 60
Hình 3.18. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng N
aa
theo
thời gian của các mẫu thủy phân 60
Hình 3.19. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ ẩm đến hàm lượng N
NH3
theo
thời gian của các mẫu thủy phân 61
Hình 3.20. Đồ thị mặt đáp ứng DH(%)

theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy
phân 64
Hình 3.21. Đồ thị đường mức DH (%) theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy
phân 64
Hình 3.22. Đồ thị mặt đáp ứng N
aa
theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân 64
Hình 3.23. Đồ thị đường mức N
aa
theo NaCl và sorbitol tại 6 giờ thủy phân 65
Hình 3.24. Đồ thị mặt đáp ứng N
NH3
theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ
thủy phân 65

Hình 3.25. Đồ thị đường mức N
NH3
theo NaCl và sorbitol tại thời điểm 6 giờ
thủy phân 65
Hình 3.26: Dịch phế liệu mực sau 6 giờ thủy phân (mẫu 7) 66
Hình 3.27: Phổ điện di của phế liệu mực theo thời gian thủy phân 68
Hình 3.28: Biểu đồ tổng lượng thức ăn (viên) cá kèo sử dụng ở 30 phút đầu cho
ăn của các bể trong thời gian 10 ngày thí nghiệm 69
Hình 3.29: Biểu đồ khối lượng tăng trung bình hằng ngày của cá kèo ở các bể
trong thời gian 10 ngày thí nghiệm 69






vii




DANH MỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN

Kí hiệu viết tắt
Diễn giải

DH : Độ thủy phân

DTP : Dịch thủy phân

ĐC : Đối chứng

N
aa
: Nitơ acid amin

N
F
: Nitơ foocmol

N
NH3
: Nitơ amoniac


N
TS
: Nitơ tổng số

pH
opt
: pH tối thích

pH
th
: pH thích hợp

t
opt
: Nhiệt độ tối thích

t
th
: Nhiệt độ thích hợp

TLK : Trọng lượng chất khô


1

MỞ ĐẦU
Ngày nay, cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ngành chế biến thủy
sản được coi là ngành mũi nhọn và được xem là nhiệm vụ chiến lược của nước ta.
Theo Tổng cục Thống kê, năm 2009 kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt
khoảng 4,2 tỷ USD, đó là nguồn ngoại tệ đáng kể trong ngân sách nhà nước. Các
mặt hàng xuất khẩu rất đa dạng, bao gồm các mặt hàng đông lạnh, đồ hộp, các mặt
hàng chế biến khô,…Các đối tượng dùng sản xuất thường là các loài tôm, cá,
mực,… Bên cạnh các mặt hàng xuất khẩu có giá trị lớn như tôm và cá thì mực cũng
là một trong những sản phẩm có đóng góp rất lớn cho sức tăng trưởng xuất khẩu
chung của thủy sản Việt Nam trong nhiều năm qua (Vasep). Các mặt hàng chế biến
của mực phần lớn dưới dạng đông lạnh Block, IQF, semi-IQF, đông lạnh khay hoặc
đóng gói hút chân không. Hình thức các sản phẩm chế biến như phi lê, cắt miếng,
tỉa hoa, chế biến sẵn để nấu hoặc dưới dạng sản phẩm sushi, sashimi để ăn gỏi, tẩm
bột hay các sản phẩm phối chế khác. Cùng với sự gia tăng của khối lượng mực xuất
khẩu, lượng phế liệu từ mực cũng tăng lên dẫn đến sự tồn tại nhiều vấn đề như làm
tăng chi phí xử lý nước thải, làm tăng ô nhiễm môi trường.
Lượng phế liệu mực thải ra từ các qui trình sản xuất mực là rất lớn, chiếm
khoảng 40% nguyên liệu. Hàm lượng protein trong phế liệu mực chiếm từ 72-77%
trong thành phần chất khô [46]. Theo theo Takaoka, 1995 và Meyers, 1989 (trích từ
P. Z. Lian, 2005) [46] trong thành phần protein của mực có chứa betain, các acid

amin tự do và khoảng 1,5% các peppid có trọng lượng phân tử thấp là các chất gây
kích thích bắt mồi cho tôm. Theo Jobling, 1998 hàm lượng protein trong phế liệu
mực đủ cao cho quá trình thủy phân tạo ra các peptid và các acid amin, nó có chứa
hầu hết các acid amin cần thiết cho sự phát triển và tăng tỷ lệ sống của cá nuôi.
Nhưng nhìn chung hiện nay ở nước ta phế liệu mực là đối tượng chưa được tận
dụng tốt. Đó là do phế liệu mực (bao gồm da và nội tạng…) khó phơi khô và nhanh
ôi thối, dẫn đến phế liệu mực làm khô (dùng làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn
nuôi) thu được có chất lượng không cao. Vì vậy, nếu chúng ta đem thủy phân lượng
phế liệu này để thu hồi nguồn chất dinh dưỡng sau đó bổ sung vào thức ăn cho vật


2

nuôi thì sẽ nâng cao được giá trị của nguyên liệu trong qui trình sản xuất mực và
còn có tác dụng giảm tải rất lớn cho quá trình xử lý nước thải, hạn chế sự ô nhiễm
môi trường.
Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu quá trình thủy phân phế liệu mực bằng Enzyme
Protease và thử nghiệm bổ sung dịch thủy phân vào thức ăn nuôi cá” là một hướng
nghiên cứu cần thiết.
Ý nghĩa khoa học: Là tìm ra chế độ thủy phân thích hợp phế liệu mực làm
nền tảng cho việc nghiên cứu ở qui mô pilot và sản xuất công nghiệp sau này.
Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần vào việc xây dựng công nghiệp tận dụng các
phế liệu mực mang lại giá trị gia tăng cho ngành thủy sản, sử dụng nguồn nguyên
liệu hiệu quả hơn, tạo ra mặt hàng mới, giảm ô nhiễm môi trường…

3

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU VỀ CÁC LOÀI MỰC
Mực thuộc ngành động vật thân mềm (Mollusca), bao gồm các loài mực ống,
mực nang, mực tuộc là nguồn lợi hải sản xuất khẩu rất quan trọng của Việt Nam sau
tôm và cá. Nhuyễn thể chân đầu phân bố khắp các vùng biển của Việt Nam, bao
gồm vùng Vịnh Bắc bộ, vùng biển miền Trung và vùng biển Đông, Tây Nam bộ.
Trong đó, một số loài có vùng phân bố hẹp trong phạm vi một, hai vùng biển, song
cũng có những loài có mặt ở khắp các vùng biển.
Những loài phổ biến và có giá trị kinh tế cao nhất là mực nang vân hổ (Sepia
pharaonis) mực nang mắt cáo (S.lycidas), mực nang lửa (S.latimanus), mực nang
vàng (S. esculenta), mực lá (Sepioteuthis lessoniana), mực ống Đài Loan (Loligo
chinensis), mực thẻ (L. edulis), mực tuộc (Octopus dollfusi), mực tuộc Ôxen
(Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (O. vulgaris) [61].

Sản lượng nhuyễn thể chân đầu đã xuất khẩu hàng năm đạt khoảng 50.000-
60.000 tấn, trị giá khoảng 150 triệu USD. Theo Viện Nghiên cứu Hải sản, 10 tháng
đầu năm 2007, xuất khẩu mực và bạch tuộc đạt trên 67,7 nghìn tấn, trị giá 231 triệu
USD, tăng 21% về khối lượng và 31% về giá trị so với cùng kỳ năm 2006, chiếm
7,7% tổng giá trị XKTS của nước ta [60].
1.1.1. Mực ống (squid)
Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống
(mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập
trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài
thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa
khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở
độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các
vùng nước sâu 30-50m.




4










Hình 1.1. Mực ống Trung Hoa
Theo số liệu điều tra mới nhất, ở vùng biển Việt Nam có tới 25 loài mực ống

(mực lá), thuộc bộ Teuthoidea. Đa số mực ống sống ở độ sâu <100m nước, tập
trung nhiều nhất ở vùng nước sâu khoảng 30-50m. Ngoài ra còn có một số loài
thường sống ở các vùng biển khơi với độ sâu >100m nước. Trong các tháng mùa
khô (tháng 12-tháng 3 năm sau), mực ống di chuyển đến các vùng nước nông hơn, ở
độ sâu <30m. Trong các tháng mùa mưa (tháng 6-9), mực ống di chuyển đến các
vùng nước sâu 30-50m.
Sản lượng khai thác mực ống trên toàn vùng biển Việt nam hằng năm khoảng
24.000 tấn, trong đó vùng biển miền Nam có sản lượng cao nhất là khoảng trên
16.000 tấn (chiếm 70%), vịnh Bắc Bộ chiếm sản lượng lớn thứ nhì, khoảng 5000
tấn (20%), còn biển miền Trung có sản lượng thấp nhất khoảng 2.500 tấn (10%)
[62].
1.1.2. Mực nang (cutlefish)
Đã xác định được 15 loài mực nang thuộc lớp phụ Coleoidea, bộ Sepiodea
họ Sepiidea ở vùng biển Việt Nam. Nhìn chung, các loài mực nang đều sống tập
trung chủ yếu ở các vùng nước sâu khoảng 50m-200m. Đến mùa xuân (tháng 1,2,3)
chúng thường di cư vào gần bờ để đẻ trứng. Do đó, chúng đã trở thành sản phẩm
khai thác truyên thống lâu đời của người dân Việt Nam ở ven bờ. Tuy nhiên, việc


5

mở rộng khai thác xa bờ đã và đang giúp cho nghề khai thác mực của Việt nam có
nhiều triển vọng tăng sản lượng.

Hình 1.2. Mực nang vân hổ
Mực nang là thực phẩm có hàm lượng dinh dưỡng cao, dễ chế biến và được
làm thành nhiều món ăn ngon, vừa mang tính nghệ thuật vừa có giá trị xuất khẩu
cao trên thị trường quốc tế.
Sản lượng khai thác mực nang hằng năm của Việt Nam khoảng 26.000 tấn,
phần lớn ở vùng biển Nam Bộ đạt khoảng 20.000 tấn, chiếm khoảng 76% tổng sản
lượng mực nang. Miền Trung chiếm sản lượng khoảng 5.000 tấn (21%) và miền
Bắc khoảng 1.000 tấn (3 %) [63].
1.1.3. Mực tuộc (octopus)









Hình 1.3. Mực tuộc


6

Hiện nay đã xác định được 17 loài mực tuộc, như: Mực tuộc (Octopus
dollfusi), bạch tuộc Ôxen (Octopus ocellatus), mực tuộc đốm trắng (Octopus
vulgaris), … thuộc bộ Octopoda với hai bộ phụ là Incirrata & Cirrata và 3 họ là
Octodidae gồm 12 loài , họ Argonauthidae gồm 4 loài và 1 loài thuộc họ
Opisthoteuthidae. Thị trường xuất khẩu mực tuộc của Việt Nam mở rộng hơn qua
các năm. Hiện nay các mặt hàng mực tuộc của Việt Nam đã xuất sang 25 thị trường.
Theo số liệu thống kê xuất khẩu năm 2004, thị trường Nhật Bản chiếm giá trị xuất

khẩu lớn nhất (41%), tiếp theo lần lượt thứ tự là các thị trường Hàn Quốc (35,6%),
Italia (6,9%), Trung Quốc (3,6%), Tây Ban Nha (3,6%), Ôxtrâylia (2,5%) và Mỹ
(1,8%) [59].



Hình 1.4. Biểu đồ xuất khẫu mực tuộc năm 2000-2004

1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME
Trong sự phát triển của hóa sinh học, bước nhảy vọt đã đạt được khi người ta
thực hiện thành công việc tách chiết các chất xúc tác sinh học ra khỏi tế bào và
nghiên cứu tính chất của chúng, lúc đó người ta nhận biết rằng enzyme có bản chất
Nguồn:
/>


7

protein. Năm 1926, Sumner là người đầu tiên thu được urease ở dạng kết tinh. Cho
đến nay đã có khoảng hơn 150 enzyme được rút ra ở dạng tinh khiết. Trong số các
enzyme đó, một số đã được biết trọn vẹn về cấu trúc bậc I như ribonuclease,
trypsin, chymotrypsin, …
Enzyme, cũng như những protein khác, có trọng lượng phân tử khoảng
12.000 đến hơn 1000.000. Một số enzyme cấu tạo gồm toàn những phân tử L amino
acid liên kết với nhau tạo thành, gọi là enzyme một thành phần. Đa số enzyme là
những protein phức tạp gọi là enzyme hai thành phần. Phần không phải protein gọi
là nhóm ngoại hay coenzyme.
Khi đặt vấn đề nghiên cứu về cơ chế xúc tác của enzyme người ta xuất phát
từ giả thiết cho rằng trong các phản ứng được enzyme xúc tác, phức tạm thời
“Enzyme – Cơ chất” được tạo thành. Quá trình này gồm 3 giai đoạn:

E
-
+ S
+
ES P + E
Trong đó:
E: Enzyme
S: Cơ chất
ES: Phức hợp của enzyme-cơ chất
P: Sản phẩm
- Ở giai đoạn 1 phản ứng xảy ra tương đối nhanh cơ chất được liên kết với
enzyme nhờ các liên kết yếu. Giai đoạn này có sự hình thành phức hợp trung gian
ES, sự tạo thành phức hợp này có thể theo hai kiểu sau:
+ Kiểu cơ chế thứ nhất: Là kiểu hình thành đơn giản, tâm ái nhân (–) của
enzyme tương tác nhanh với một trong hai nguyên tử tích điện dương của liên kết
nhị dương (dipositive bond). Sau khi tương tác sẽ làm thay đổi mật độ electron (e)
và làm suy yếu liên kết nhị dương tạo điều kiện cắt đứt liên kết. Các nhà nghiên cứu
cho rằng kiểu cơ chế này xảy ra khi tâm ái nhân của enzyme mạnh và sự khuyết
điện tử của liên kết nhị dương lớn [17].
+ Kiểu cơ chế thứ hai: Lúc đầu các nguyên tử khuyết điện tử trong liên kết
nhị dương chưa thể đính trực tiếp vào tâm ái nhân của trung tâm hoạt động của


8

enzyme mà cơ chất gắn vào tâm ái nhân bằng một phản ứng hóa học nào đó giữa
tâm ái nhân ở trung tâm hoạt động enzyme với một nhóm hóa học ở vị trí gần kề
với liên kết nhị dương trong cơ chất. Dưới ảnh hưởng của trung tâm hoạt động của
enzyme sẽ dần dần làm tăng mức độ khuyết điện tử vốn đã tồn tại trước đó, bằng
cách tạo liên kết tương ứng với cơ chất ở những vị trí gần gũi với liên kết nhị

dương. Nhờ vậy, làm cho sự phân bố điện tử trong phân tử cơ chất bị thay đổi theo
chiều hướng cần thiết, khiến cho liên kết nhị dương được tăng cường và có thể
tương tác với các tác nhân ái nhân của trung tâm hoạt động của enzyme và tiến hành
làm yếu liên kết và tiến đến liên kết bị thuỷ phân khi có yếu tố nước tham gia [17].
- Ở giai đoạn 2 xảy ra sự biến đổi của cơ chất (S) có liên quan tới việc phá vỡ
hay hình thành các liên kết cộng hóa trị. Ở giai đoạn này, cơ chất được hoạt hóa
(một hoặc vài phức chất ES chuyển tiếp được hoạt hóa). Ở đây, cấu trúc bậc 3 của
enzyme luôn biến đổi tạo khả năng tiếp xúc giữa các nhóm hoạt động của enzyme
với cơ chất đang biến đổi. Enzyme đã làm biến đổi phần tử cơ chất làm cho các liên
kết bên trong phân tử trở nên “lỏng lẻo” hơn, do đó chỉ cần một lượng năng lượng
nhỏ cũng đủ làm cho cơ chất biến thành các sản phẩm (P) khác nhau.
Người ta đã chứng minh rằng trong khi hình thành phức chất ES có 2 quá
trình đồng thời xảy ra nhanh chóng đó là:
+ Sự thay đổi mật độ điện tử gây nên sự phân cực hóa các liên kết.
+ Sự biến dạng về mặt hóa học của các liên kết “kéo căng” trong phân tử cơ
chất. Cả hai yếu tố này (biến hình và phân cực hóa các liên kết đồng hóa trị) đều
làm tăng thế năng nhiệt động của các liên kết này, nghĩa là xúc tiến việc vượt qua
“hàng rào” năng lượng hoạt hóa của quá trình chuyển tiếp phức “Enzyme-Cơ chất”.
- Giai đoạn cuối tạo thành sản phẩm, còn enzyme được giải phóng ra dưới
dạng tự do.
Các loại liên kết chủ yếu được tạo thành giữa E và S trong phức hợp ES là:
tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals. Mỗi loại liên kết
đòi hỏi những điều kiện khác nhau và chịu ảnh hưởng khác nhau khi có nước.



9

Nguồn thu nhận enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học, có nhiều trong cơ thể sống. Việc điều

chế chúng bằng phương pháp hóa học với số lượng lớn là việc làm rất khó khăn và
đầy tốn kém nếu không muốn nói là điều không tưởng, nên người ta thường thu
nhận chúng từ các nguồn sinh học. Mặc dù enzyme có trong tất cả các cơ quan, mô
của động vật thực vật cũng như trong tế bào vi sinh vật, song việc tách enzyme đáp
ứng yêu cầu về mặt kinh tế chỉ có thể tiến hành khi nguyên liệu có chứa một lượng
lớn enzyme cũng như cho phép thu được enzyme với hiệu suất cao và dễ dàng tinh
chế chúng. Việc phân bố của enzyme trong tế bào cũng không đồng đều, trong một
loại tế bào cũng có thể có nhiều enzyme này song không có enzyme khác. Đối với
tế bào vi sinh vật, lượng enzyme lại thay đổi tùy theo giai đoạn sinh trưởng phát
triển của sinh vật và tùy theo loài nên chúng ta phải chọn nguồn nguyên liệu thích
hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme. Có ba nguồn nguyên liệu sinh học cơ
bản: Các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật.
- Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tuỵ, màng nhầy
dạ dày, tim dùng để tách enzyme rất thuận lợi. Dịch tuỵ tạng có chứa amylase,
lipase, protease, ribonuclease và một số enzyme khác. Ví dụ như từ ngăn tư của dạ
dày bê nghé người ta có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản
xuất fomat. Người ta cũng sản xuất pepsin từ dạ dày động vật.
Trong động vật thủy sản, thường gặp một số enzyme protease quan trọng như:
+ Pepsin: Pepsin là enzyme do màng nhầy dạ dày tiết ra, phân tử lượng của
Pepsin 4200, điểm đẳng điện ở pH = 3,7. Tùy vào mỗi loài thủy sản mà Pepsin của
chúng có pH và nhiệt độ thích hợp khác nhau, pH
opt
= 1,6 - 3,8; t
opt
= 31 – 55
0
C [5].
+ Trysin: Loại enzyme này ở trong dịch tụy tạng, trong ruột non, gan…Tác
dụng tự phân giải trong tổ chức cơ thịt hầu như chủ yếu là do loại này. Trysin là loại
protein tính kiềm, phân tử lượng khoảng 23.800, điểm đẳng điện ở pH = 10,5. Đa số

Trysin hoạt động ở pH tối ưu là 8, khả năng tác dụng của Trysin khá mạnh với các
loại protit, với các phân tử thấp không chỉ ở mối liên kết peptid mà còn cả mối liên


10

kết amit và cả liên kết este. Nhiệt độ thích hợp của trysin cá minh thái và cá tuyết là
38 – 50
0
C và pH = 6,4 – 8,2 [5].
+ Peptidase, Ereptase (Erepsin) và các loại khác: Khả năng tác dụng cũng như
tính đặc hiệu của các enzyme này phụ thuộc vào bản chất của các nhóm nằm kề bên
liên kết peptid. Qua thí nghiệm cho thấy Ereptase có hoạt lực rất mạnh, điều kiện
làm việc của mực nang là pH = 6,1; của carboxypolypeptidase pH = 5,5; của
dipeptidase là pH = 8,2; của cathepsin trong mực tuộc là pH = 4,7; của
aminopolypeptidase là pH = 8,2 [5].
- Ở thực vật, thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữ như hạt,
củ, quả. Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy. Ví dụ
trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương có nhiều enzyme
Urease. Trong thóc nảy mầm chứa nhiều  - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều 
– Amylase. Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, Bromelain thu được từ các bộ
phận (lá, thân, quả) cây dứa, còn ficin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus [7].
- Đối với vi sinh vật, đây là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme và
cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng
của vi sinh vật ngắn, tốc độ sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối
lượng lại nhỏ, kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn. Hệ
enzyme vi sinh vật vô cùng phong phú. Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại
enzyme khác nhau, trong đó có những enzyme ở động, thực vật không tổng hợp
được. Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác đồng thời
vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡng

nuôi chúng cũng như một số tác nhân lý hóa, cơ học khác. Do đó có thể thay đổi
những điều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng
enzyme đáng kể với hoạt tính xúc tác cao.
Đối với enzyme protease từ vi sinh vật, nguồn thu nhận chủ yếu là từ vi
khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus,
Penicillium, Clotridium, Streptomyces và một số và một số loại nấm men [7].


11

Protease của động vật hay thực vật chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase
hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả năng sinh ra cả hai loại trên, do đó
protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất cao. Chúng có khả năng phân hủy tới
80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus
subtilis, B. mesentericus và một số giống thuộc chi Clostridium. Trong đó, B.
subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất [7]. Các vi khuẩn thường tổng
hợp các protease hoạt động thích hợp ở vùng pH trung tính và kiềm yếu.
Các protease trung tính của vi khuẩn hoạt động ở khoảng pH hẹp (pH 5-8) và
có khả năng chịu nhiệt thấp. Các protease trung tính tạo ra dịch thủy phân protein
thực phẩm ít đắng hơn so với protease động vật và tăng giá trị dinh dưỡng. Các
protease trung tính có khả năng ái lực cao đối với các amino acid ưa béo và thơm.
Chúng được sinh ra nhiều bởi B. subtilis, B. mesentericus và một số giống thuộc chi
Clostridium.
Nhiều loại nấm mốc có khả năng tổng hợp một lượng lớn protease được ứng
dụng trong công nghiệp thực phẩm là các chủng: Aspergillus oryzae, A. terricola, A.
fumigatus, A. saitoi, Penicillium chysogenum… Các loại nấm mốc này có khả năng
tổng hợp cả ba loại protease: acid, kiềm và trung tính.
Một số nấm mốc khác như: A. candidatus, P. cameberti, P. roqueforti… cũng
có khả năng tổng hợp protease có khả năng đông tụ sữa sử dụng trong sản xuất pho

mát.
Về phương diện tổng hợp protease, xạ khuẩn được nghiên cứu ít hơn vi
khuẩn và nấm mốc. Tuy nhiên, người ta cũng đã tìm được một số chủng có khả
năng tổng hợp protease cao như: Streptomyces grieus, S. fradiae, S. trerimosus
1.3. TỔNG QUAN VỀ QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN PROTEIN
1.3.1. Quá trình thủy phân
Quá trình thủy phân là quá trình phân cắt một số liên kết nhị dương
(dipositive bond) trong hợp chất hữu cơ thành các thành phần đơn giản dưới tác
dụng của các chất xúc tác và có sự tham gia của yếu tố nước trong phản ứng [17].


12

Cơ chất của quá trình thủy phân là tập hợp những hợp chất cao phân tử và chứa
đựng liên kết nhị dương như: tinh bột, protein, xenluloza, pectin, glucoza và một số
hợp chất hữu cơ như lipit, ATP,…các chất này thường là các thành phần cấu tạo của
nguyên liệu.
Sơ đồ quá trình thủy phân protein:

Protein Polypeptid Peptid Acid amin

Quá trình thủy phân protein là quá trình phân cắt mạch peptid tại các liên kết
peptid qua các dạng trung gian như pepton, polypeptid, peptid và cuối cùng là acid
amin theo phản ứng sau:


… – NH – CH – C
+
– N
+

– CH – C – … + H
2
O


… – NH – CH – C – OH + NH
2
– CH – C – …


Như vậy sản phẩm thủy phân của protein là bao gồm các pepton, polypeptid,
peptid và các acid amin.
Trong hầu hết các acid amin thu nhận được khi thuỷ phân protein đều ở dạng
L-α amino acid. Vị của acid amin phụ thuộc vào cấu trúc không gian, Dạng L có vị
đắng, dạng D có vị ngọt, còn acid amin có gốc R mạch vòng có cả vị đắng và vị ngọt.
Cường độ vị phụ thuộc vào giá trị “ngưỡng nồng độ”, là nồng độ thấp nhất để có thể
cảm nhận sự có mặt của acid amin. Ngưỡng này lại phụ thuộc vào tính kỵ nước của
gốc R trong phân tử acid amin. L-tryptophan và L-tyrosine có vị đắng nhất. Acid L-
glutamit acid ở nồng độ cao có vị ngọt của thịt, ở nồng độ thấp là chất tăng vị cho sản
phẩm thực phẩm [1].
R
1
O
–

O
H R
2

Xúc tác
R
1
O O

Xúc tác

Xúc tác

Xúc tác


R
2



13

Đối với dipeptid ngoại trừ dipeptid của acid aspartic có vị ngọt, các dipeptid
còn lại có vị đắng hoặc vị trung dung [1]. Sự thủy phân có thúc đẩy thường giải
phóng ra các peptid kỵ nước có dính các gốc lơxin hoặc phenylalanin ở cuối nên có vị
đắng [27]. Vị của peptid không phụ thuộc cấu hình không gian L hoặc D như acid
amin. Cường độ vị cũng phụ thuộc vào tính kỵ nước của các gốc R mà không phụ
thuộc vào trình tự của acid amin [1].
1.3.2. Các phương pháp thủy phân protein
* Thủy phân bằng acid
Trong sản xuất thường dùng HCl ngoài ra có thể dùng H
2
SO

4
. Acid phân ly
càng mạnh thì phản ứng thủy phân xảy ra càng nhanh.
Acid clohydric (HCl) có hoạt độ lớn nhất nên được sử dụng phổ biến nhất,
ngoài ra sau khi thủy phân phản ứng trung hoà tạo thành NaCl có lợi cho sản phẩm
thực phẩm. Phương pháp này là dùng acid HCL 6N dư thừa ở nhiệt độ 100-120
o
C
trong khoảng 24 giờ. Sản phẩm thu được chủ yếu là các acid amin tự do dưới dạng
hydrogenclorate. Một số acid amin như serine và threonine bị phá huỷ một phần,
tryptophan bị phá huỷ hoàn toàn, glutamine và asparagine phân ly thành acid
glutamic, acid aspartic và NH
4
+
.
* Thuỷ phân bằng kiềm
Người ta cũng có thể thu nhận các amino acid bằng phương pháp thuỷ phân
với NaOH, bằng cách đun nóng trong nhiều giờ. Sản phẩm thu được hầu hết là các
amino acid nhưng đều bị racemic hóa, các amino acid cysteine, serine và treonine bị
phá huỷ nhưng tryptophan không bị phá huỷ. Vì vậy, phương pháp thuỷ phân bằng
kiềm thường chỉ dùng để xác định tryptophan.
* Thuỷ phân bằng enzyme
Để thu nhận chế phẩm acid amin ngày nay việc thuỷ phân bằng enzyme
protease được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khoa học khác nhau bởi sử
dụng enzyme có nhiều ưu điểm là không có sản phẩm phụ do enzyme có tính đặc
hiệu cao, thủy phân trong điều kiện nhiệt độ thấp nên ít ảnh hưởng đến chất lượng
sản phẩm, ít tốn năng lượng.


14

Do mỗi loại enzyme có tính đặc hiệu riêng nên vị trí liên kết peptid bị cắt
mạch là tùy vào loại enzyme protease. Protease được phân chia thành hai loại là
endopeptidase và exopeptidase.
- Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, mà exopeptidase được phân
chia thành hai loại:
+ Aminopeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptide để giải phóng ra một acid amin, một dipeptide hoặc một
tripeptide.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptide ở đầu C của chuỗi
polypeptide và giải phóng ra một acid amin hoặc một dipeptide.
- Dựa vào động học của cơ chế xúc tác, endopeptidase được chia thành bốn
nhóm:
+ Serin proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc serine trong
trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của
enzyme. Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: Chymotrypsin và subtilisin. Nhóm
chymotrypsin bao gồm các enzyme động vật như chymotrypsin, trypsin, elastase.
Nhóm subtilisin bao gồm hai loại enzyme vi khuẩn như subtilisin carlsberg,
subtilisin BPN (bacterial protease Nagase). Các serine proteinase thường hoạt động
mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng.
+ Cysteine proteinase: Các proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâm hoạt
động. Cystein proteinase bao gồm các proteinase thực vật như papayin, bromelin,
một vài protein động vật và proteinase ký sinh trùng. Các cystein proteinase thường
hoạt động ở vùng pH trung tính, có tính đặc hiệu cơ chất rộng.
+ Aspartic proteinase: Hầu hết các aspartic proteinase thuộc nhóm pepsin.
Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiêu hóa như: pepsin, chymosin, cathepsin,
renin. Các aspartic proteinase có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm hoạt động và
thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
+ Metallo proteinase: Metallo proteinase là nhóm proteinase được tìm thấy ở
vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật bậc cao hơn. Các metallo proteinase

15

thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của
EDTA (Ethylen Diamine Tetra Acetic Acid).
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân protein bằng enzyme
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Trong một phạm vi nhiệt độ nhất định, tốc độ của phản ứng tăng lên cùng
với sự tăng của nhiệt độ. Nhưng khi vượt quá phạm vi nào đó, các phản ứng được
enzyme xúc tác bị ảnh hưởng do sự biến tính của phân tử protein-enzyme. Kết quả
này phụ thuộc vào nhiệt độ tối thích của enzyme, là nhiệt độ mà tại đó tốc độ phản
ứng enzyme đạt cực đại. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau. Sự khác nhau
này tùy thuộc vào nguồn gốc của các enzyme, tùy theo từng điều kiện hoặc từng sự
khác nhau về tính nhạy cảm với nhiệt độ của phân tử protein-enzyme. Ở nhiệt độ
thấp hơn 10
0
C sẽ kìm hãm sự hoạt động của enzyme nhưng nếu thấp quá thì
enzyme sẽ mất hoạt động. Nhiệt độ từ 60
0
C trở lên đa số enzyme sẽ giảm hoặc
ngừng hoạt động. Đa số enzyme mất hoạt tính xúc tác ở nhiệt độ cao hơn 80
0
C, trừ
Papain, Myokinase có thể tồn tại ở 100
0
C. Nhiệt độ thích hợp của enzyme thông
thường từ 30 – 50
0
C [6].

* Ảnh hưởng của pH
Sự phân li khác nhau của một phân tử protein ở các giá trị pH khác nhau làm
thay đổi tính chất của trung tâm liên kết cơ chất và hoạt động ở phân tử enzyme,
dẫn đến giá trị xúc tác khác nhau phụ thuộc vào giá trị pH. Như vậy enzyme rất
nhạy cảm với sự thay đổi pH của môi trường. Mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất
ở một vùng pH xác định, gọi là pH tối thích. pH tối thích của mỗi enzyme không cố
định, có thể thay đổi tùy theo tính chất và nồng độ của cơ chất, nhiệt độ.
* Ảnh hưởng nồng độ cơ chất và nồng độ enzyme
Khi môi trường có đầy đủ cơ chất thì tốc độ phản ứng tỷ lệ thuận với lượng
enzyme. Khi nồng độ cơ chất thấp, không đủ để lôi kéo tất cả lượng enzyme vào
phản ứng thì tốc độ phản ứng tăng tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Tốc độ phản ứng
đạt tối đa khi tất cả enzyme đều kết hợp vào cơ chất.



16

* Ảnh hưởng của chất hoạt hóa và chất kìm hãm enzyme
Những chất nào có khả năng làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme thì được
gọi là chất hoạt hóa enzyme. Các chất đó thường là các ion kim loại như: K
+
, Na
+
,
Mg
+2
, Ca
+2
, Co
+2

, Zn
+2
, Mn
+2
, … Sự hoạt động của các enzyme đều có thể bị kìm
hãm bởi các tác động gây biến tính protein.
Đối với muối ăn (NaCl) khi cho vào hỗn hợp thủy phân thì sẽ làm thay đổi
hoạt độ của nước (a
w
), dẫn đến ảnh hưởng hoạt động sống của vi sinh vật. Vì vậy
trong thủy phân người ta thường dùng NaCl để khống chế hoạt động của vi sinh vật
gây thối rữa. Do khả năng chịu muối của enzyme thủy phân tốt hơn vi sinh vật cho
nên trong phạm vi độ mặn nhất định enzyme vẫn có tác dụng thủy phân protein,
thậm chí trong môi trường muối bão hòa enzyme vẫn hoạt động được nhưng tác
dụng thủy phân rất chậm [6].
* Ảnh hưởng của tỷ lệ nước
Nước không những là môi trường để khuếch tán enzyme và cơ chất mà còn
là tác nhân tham gia vào phản ứng nữa. Nước không những có ảnh hưởng đến vận
tốc mà cả chiều hướng của phản ứng thủy phân bởi enzyme. Việc bổ sung thêm
nước là tạo môi trường lỏng giúp cho enzyme hoạt động được dễ dàng, làm tăng
khả năng thủy phân. Lượng nước cho vào nếu ít quá thì tác dụng thủy phân của
enzyme kém nhưng nếu nhiều quá thì không khống chế được quá trình thối rữa.
Lượng nước bổ sung vào cho quá trình thủy phân là tùy thuộc vào đặc điểm của
nguyên liệu.
* Ảnh hưởng của thời gian thủy phân
Thời gian thủy phân có ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình thủy phân, thời
gian thuỷ phân càng dài thì protease càng có điều kiện thuỷ phân cơ chất càng triệt
để. Nhưng nếu thời gian thủy phân quá dài sẽ dẫn tới vi sinh vật hoạt động làm sản
sinh ra càng nhiều các sản phẩm thứ cấp như: NH
3

, H
2
S, CO
2
, indol, … Nhưng nếu
thời gian thủy phân rút ngắn, sự thuỷ phân protein chưa triệt để, hiệu suất thủy phân
kém, gây lãng phí nguyên liệu. Thường thì trong thời gian đầu tốc độ của quá trình
thủy phân xảy ra mạnh, càng về sau do nồng độ cơ chất giảm trong khi nồng độ sản


17

phẩm tạo thành tăng, đồng thời do độ bền của enzyme giảm theo thời gian nên tốc
độ của phản ứng thủy phân giảm dần.
* Ảnh hưởng của diện tích tiếp xúc
Trong quá trình thủy phân yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình thủy phân là
diện tích tiếp xúc. Để tạo điều kiện tốt hơn cho sự thủy phân của enzyme là làm
tăng khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, muốn vậy phải làm nhỏ kích thước
cơ chất trước khi thủy phân.
* Ứng dụng quá trình thủy phân protein
Thủy phân protein là nhằm phân giải các nguyên liệu có chứa thành phần
protein ở trạng thái phân tử lượng lớn (khó tiêu hóa) về thành các peptid ngắn mạch
hay amino acid dễ hấp thụ cho các cơ thể sống. Sản phẩm của quá trình thủy phân
protein là dịch đạm thủy phân. Hiện nay dịch đạm thủy phân được ứng dụng trong
nhiều lĩnh vực.
Trong y dược: Dùng sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản
xuất huyết thanh miễn dịch. Sản xuất dịch đạm truyền cho người bệnh suy kiệt,
người không tự ăn uống được, người bị chấn thương nặng, bệnh nhân phải phẫu
thuật lớn. Trong hương liệu mỹ phẩm, người ta trộn một lượng nhỏ enzym protease
và kem thoa, kem cạo râu, dầu gội, dầu bôi tóc, kem giặt…để làm cho da, tóc mềm

mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già…
Trong thực phẩm: Dùng sản xuất bột đạm, nước chấm, nước mắm, tương,
chao, bánh kẹo, thức ăn bổ sung, thực phẩm chức năng …
Trong nông nghiệp: Dùng làm phân bón cải tạo đất…
Trong chăn nuôi: Dùng làm tăng độ tiêu hóa, bổ sung đạm vào thành phần
thức ăn giúp động vật tăng trưởng tốt nhằm rút ngắn thời gian nuôi. Khi nuôi thủy
sản người nuôi còn dùng dịch thủy phân làm chất tăng vị kích thích bắt mồi cho
động vật thủy sản, đặc biệt là dùng khi thời tiết thay đổi hay khi sử dụng kháng sinh
trị bệnh (cá biến ăn).



18

1.4. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU THỦY PHÂN PROTEIN TRÊN THẾ GIỚI
VÀ ỨNG DỤNG
Năm 1857, Corvisat tách được trypsin từ dịch tụy đây là protease tách được
dưới dạng chế phẩm, nhưng chưa được tinh sạch. Năm 1861, Bruke tách được
pepsin ở dịch dạ dày chó dưới dạng tương đối tinh khiết.
Năm 1862, Danivevski đã tách được trypsin, amylase tụy tạng bằng phương
pháp hấp phụ.
Năm 1970, Kerry T. Yasunobu và James Mc Conn đã nghiên cứu tách chiết
protease trung tính từ môi trường nuôi B.subtilis theo phương pháp bán rắn và nhận
thấy protease này là một protease kim loại có ion Ca2+ trong trung tâm hoạt động,
có pHopt từ 6,5-7,5, topt là 57
0
C. Protease này bị ức chế bởi Cu2+,Ni2+, Hg2+,
Pb2+, Cd2+, Fe2+ và khi có mặt của ion Ca2+ thì enzyme này có thể bền trong
khoảng pH từ 5,5-10 [43].
Dong Ho Ahn, Hoon Kim và Pack My (1993) đã nghiên cứu về protease tách

từ Bacillus megaterim ATCC 14945 và nhận thấy protease này có thể bị kết tủa
bằng amonium sulphate, có pHopt 7,5, nhiệt độ tối thích 55
0
C, protease này cần có
ion Ca2+ và bị ức chế mạnh bởi EDTA [33].
Gonchar Am và Auslender VI (1996) đã tiến hành nghiên cứu cố định các
protease của vi khuẩn B.subtilis trên 1,4 – polyalkylene oxid bằng phương pháp
chiếu chùm tia electron và chỉ ra rằng các protease cố định bền với nhiệt hơn các
protease dạng tự nhiên [39].
Theo P.M. Nielsen và cộng sự, (2001) có các phương pháp theo dõi độ thủy
phân (DH) trong quá trình thủy phân protein, như: pH-stat, osmometry, soluble
nitrogen content, và trinitro-benzen-sulfonic acid (TNBS). Nhưng các phương pháp
này có những hạn chế nhất định.
Phương pháp pH-stat cần phải bổ sung kiềm (hay acid) nhằm giữ pH không
đổi trong suốt quá trình thủy phân.
Phương pháp osmometry là dựa vào sự thay đổi của điểm đông đặc, dùng thiết
bị cryoscope để đo sự tương quan để tính DH. Phương pháp này có hạn chế là không