Báo cáo y học: "Đánh giá tính an toàn và hiệu lực bảo vệ của kháng huyết thanh khán Bacillus Anthracis tinh chế trên động vật thực nghiệm" docx

ỏnh giỏ tớnh an ton v hiu lc bo v ca khỏng huyt thanh khỏn
Bacillus Anthracis tinh ch trờn ng vt thc nghim


Hong Th Thu H
*
; Tng Th Nga
*
; Phm Thanh Hi
*

Nguyn Thỏi Sn
**
; Phan Bn
***
; Phựng c Cam*
Tóm tắt
Bnh than l bnh nhim khun cp tớnh, lm tn thng da, ng hụ hp di, ng tiờu
húa v nhiu ph tng. Bnh hay gp ng vt n c, lõy sang ngi do tip xỳc. Bnh xy ra
nhiu ni trờn th gii, trong ú cú Vit Nam. T l t vong cao i vi c ngi v ng vt. Vcxin
v khỏng huyt thanh (KHT) chng vi khun (VK) than l ch phm cú tỏc dng
phũng nga v
iu tr bnh than. Hin trờn th trng cha cú sn nhng sinh phm ny dựng cho nhõn dõn v
quõn i khi cú tỡnh hung xy ra. KHT chng VK than do Hc vin Quõn y phi hp vi Cụng ty
Vcxin Pasteur Lt sn xut c th nghim, ỏnh giỏ tớnh an ton cng nh hiu lc bo v
trờn ng vt thc nghim cho thy t yờu cu v tớnh an ton v hiu lc bo v
liu gõy cht 10
x LD
50
ca chng VK c lc B. anthracis 17JB.
* T khúa: Khỏng huyt thanh chng bnh than; Tớnh an ton; Hiu lc bo v.

Evaluation of Safety and Potency of the Bacillus anthracis antisera in the
experimental animals in Vietnam

Summary
Anthrax in nature is a usually fatal zoonotic disease and caused by Bacillus anthracis. Animals
acquire the disease from consuming contaminated soil in which pre-existing anthrax spores are likely
to have germinated, then repopulated under appropriate soil and weather conditions, increasing their
concentration in soil to infectious levels. Human disease results from exposure to contaminated
animal products. There is need to use the vaccine and/or anti-sera for prevention and treatment of
the disease. The biological produces, however, need to evaluate their characteristics before using.
The Bacillus anthracis anti-sera was produced in a rabies by injecting spores of the Sterne strain of
Bacillus anthracis at in Dalat Vaccination Pasteur Institute and Military Medical University in Vietnam.
The anti-sera was investigated for its safety and potency. The results showed that the anti-sera
achieve the National Center for Control of Medical Biological Products and Vietnam pharmacopoeia-
No.3 criteria for safety and potency with 10 x LD
50
of B. anthracis 17JB strain.
* Key words: Anthrax anti-sera; Safety, Potency.


* Viện Vệ sinh Dịch tễ TW
** Bệnh viện 103
*** Công ty Vắcxin Pasteur Đà Lạt
Phản biện khoa học: PGS. TS. Nguyễn Văn Minh
ặt vấn đề
Bnh than l bnh nhim khun cp
tớnh, thng lm tn thng da, ng hụ
hp di v tiờu húa. Bnh hay gp ng
vt n c, nhng cú th gõy bnh cho

ngi v ng vt cú vỳ khỏc qua tiếp xúc.
Bnh xy ra rng khp trờn th gii, t l t
vong cú th rt cao i vi c ngi v
ng vt [4, 5].
Tỏc nhõn gõy bnh l trc khun gram
dng Bacillus anthracis (B. anthracis) cú
nha bo, cú th chu c tỏc ng ca
nhit , tia cc tớm, bc x v mt s húa
cht [6]. Vỡ vy, VK cú kh nng tn ti
nhiu nm mụi trng v phỏt tỏn nhanh.
Hn na, B. anthracis cú th ch dng
bt, nờn ó c s dng lm v khớ sinh
hc gõy nguy him cho loi ngi. G
n õy
nht, nm 2001, v khng b sinh hc bng
VK B. anthracis ti M lm 5 ngi cht
trờn tng s 22 ca mc bnh [4].
gúp phn ngn nga dch bnh than
trờn c ngi v ng vt, nhiu nc trờn
th gii ó nghiờn cu sn xut KHT than
tinh ch v vcxin nhng cỏc ch phm ny
cú giỏ thnh khỏ cao. Trên thực tế nhu cu
sn xut vcxin hay KHT trong n
c rt
cn thit. Tuy nhiờn, cỏc ch phm sinh hc
nh KHT, vcxin cn kim tra tớnh an ton
cng nh hiu lc bo v trờn ng vt
thc nghim trc khi a vo s dng. Vỡ
vy, nghiờn cu ny nhm mc tiờu: Đỏnh
giỏ tớnh an ton v hiu lc bo v ca

khỏng huyt thanh bacillus anthracis tinh
ch trờn ng vt thc nghim.
Vật liệu và phơng pháp
nghiên cứu
1. Vt liu nghiờn cu.
* Sinh ph
m:
- KHT than tinh ch, úng l 1ml (hiu
giỏ 1/640) (do Hc vin Quõn y v Cụng ty
Vcxin Pasteur Lt phi hp sn xut),
hạn sử dụng đến năm 2012.
- Chng VK cú c lc B. anthracis 17JB
dựng th thỏch hiu qu bo v.
- Nc mui sinh lý 0,85% (NaCl 0,85%),
pH t 7,0 - 7,2.
- Mụi trng thch mỏu cu 5%, thch
dinh dng, thch bỏn lng.
- Mụi trng ng cỏc loi: salicin,
glucose, sacarose, manitol, arabinose.
- Dung dch H
2
O
2 ,
NaClO 1%, 10%.
* ng vt thớ nghim:
- Chut lang cú trng lng t 250 - 350g.
- Chut nht (ng gii) cú trng lng
t 17 - 22g.
* Dng c thớ nghim: b o c
McFarland; týp nha 15 ml, vụ trựng (Corning);

micropipette loi 200 àl, 1000 àl; u cụn
200 àl, 1000 àl; que cy nha vụ trựng 1 àl,
10 àl; bm tiờm 1 ml; bụng, cn 70
0
; t m
37
0
C, ốn cn, lam kớnh; kính hiển vi, cõn
in t hin s.
2. Phng phỏp nghiờn cu.
ỏnh giỏ tớnh an ton v hiu lc KHT
theo tiờu chun Dc in III [2], thc hin
ti phũng thớ nghim an ton sinh hc cp
3, Vin V sinh Dch t TW.
* ỏnh giỏ an ton ca KHT:
- Chn chut khe mnh v nuụi cỏch ly
5 ngy trc th nghim, cho n ung y
.
- Chut chia lm 2 nhúm:
+ Chut lang: tr
ng lng chut 250g/con
(3 con).
42
+ Chut nht: cõn trng lng chut
18g/con (3 con).
- Cỏch tiờm: tiờm di da vựng ựi bn
(01 con tiờm KHT tinh ch, 01 con tiờm
NaCl 0,85% v 01 con khụng tiờm).
- Liu tiờm: 5 ml/con i vi chut lang
v 1 ml/con i vi chut nht.

- Thi gian theo dừi: chm súc v theo
dừi chut cho n ngy th 14, theo dừi
sc khe v cõn trng lng chut.
* Tiờu chun ỏnh giỏ: tiờu chun an
ton ca KHT khỏng B. anthracis tinh ch l
chut sng khe mnh, khụng cú du hiu
bnh lý v trng lng gim khụng quỏ 1/5
so vi ban u [2, 4, 6].
2. ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT
than tinh ch.
* Cy chng VK v chun b liu tiờm
chut:
+ Chng VK 17JB cy trong canh thang
nóo tim bũ, nhit 37
0
C/24 gi. Sau
ú, ly huyn dch ny cy lờn mụi trng
thch mỏu cu 5% v thch dinh dng,
nhit 37
0
C/24 gi.
+ Ly khun lc in hỡnh nhum soi
di kớnh hin vi xỏc nh hỡnh th v
kim tra tớnh cht sinh vt hoỏ hc, tớnh c
ca VK bng cỏc mụi trng thch bỏn
lng, catalase, ng (salicin, glucose,
sacarose, manitol, arabinose).
+ Ly 01 khun lc hũa vo týp 10 ml
dung dch NaCl 0,85% t nng McFarland
0,5 (tng ng 1 - 1,5 x 10

8
VK/ml) c
coi l huyn dch ban u cho th nghim.
Huyn dch ny tip tc pha loóng bc 10
c cỏc nng 10
0
, 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
.
- Tin hnh th nghim trờn ng vt.
- Chn chut nht khe mnh, trng
lng chut 18 - 20g/con v nuụi cỏch ly 5
ngy trc th nghim v cho n ung y
, c bit ch vitamin.
- S lng chut s dng: 100 con.
+ Chut tớnh liu gõy c (LD
50
): 40 con,
chia 5 nhúm, tiờm cỏc liu gõy c sau: 10
1
,
10
0
, 10
-1
, 10

-2
, 10
-3
.
+ Nhúm chut ỏnh giỏ hiu lc KHT: 60
con, chia thnh 4 nhúm:
Nhúm 1: tiờm liu 2 x LD
50
.
Nhúm 2: tiờm liu 4 x LD
50.

Nhúm 3: tiờm liu 8 x LD
50
.
Nhúm 4: tiờm liu 10 x LD
50.
+ Cỏch tiờm: tiờm di da vựng ựi bn.
+ Liu tiờm: nhúm tiờm tớnh liu gõy c:
1 ml/con.
+ Nhúm ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT:
05 con tiờm 1 ml liu c + 1 ml KHT nng
c.
05 con tiờm 1 ml liu c + 1 ml KHT
nng pha loóng 1/2
05 con tiờm 1 ml liu gõy c + 1 ml
NaCl 0,85%.
- Thi gian theo dừi:
. Nhúm tớnh liu gõy c: ngy th 3 n
ngy th 14.

. Nhúm ỏnh giỏ hiu lc: chm súc v
theo dừi chut cho n ngy th 10, theo
dừi tỡnh trng sc khe.
* Tiờu chun ỏnh giỏ: theo tiờu chun
ca Dc in Vit Nam III v T chc Y t
Th gii [1, 3]. ỏnh giỏ hiu lc bo v
ca KHT khỏng B. anthracis tinh ch da
trờn nguyờn lý phn ng trung ho in vivo
ca liu VK vi cỏc pha loóng KHT than
v kt qu chut sng sau khi th nghim.
Kết quả nghiên cứu và bàn luận
1. Kt qu ỏnh giỏ an ton.
Thc t khụng cú KHT no c coi l tuyt i an ton. Cỏc phn ng ph cú th xy
ra v
i mt t l nht nh trong s nhng cỏ th dựng KHT. Vỡ th, tớnh an ton ca KHT
cn c kim tra bng th nghim in vivo. õy, chỳng tụi ó ỏp dng th nghim tng
trọng của chuột [2, 4]. Thử nghiệm này có thể bị ảnh hưởng bởi các yếu tố không liên quan
đến KHT như chủng loại chuột sử dụng, điều kiện nuôi dưỡng chăm sóc. Vì thế, ®· sử
dụng 02 nhóm chứng và 02 chủng loại chuột khác nhau. Sau khi tiêm KHT kháng B.
anthracis tinh chế vào chuột lang và chuột nhắt, theo dõi trong 14 ngày tại phòng nuôi động
vật thí nghiệm, kết quả cho thấy: chuột sống khỏe mạ
nh và không có dấu hiệu bệnh lý (100%)
- Trọng lượng chuột tăng so với trọng lượng ban đầu (hình 1 và 2):
240
250
260
270
280
290
300

01234567891011121314
Ngày theo dõi
Trọng luợng
Tiêm KHT
Tiêm NMSL
Không tiêm

(g)


H×nh 1: Theo dâi chuét lang thö tÝnh an toµn cña kh¸ng huyÕt thanh tinh chÕ.

240
250
260
270
280
290
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Ngày theo dõi
Trọ ng luợ ng
Tiêm KHT
Tiêm NMSL
Không tiêm

(g)_
H×nh 2: Theo dâi chuét nh¾t thö tÝnh an toµn cña kh¸ng huyÕt thanh tinh chÕ.
44
So vi nhúm chut khụng tiờm, nhúm tiờm nc mui sinh lý v KHT u gim trng

lng sau khi tiờm th nghim. õy l phn ng thụng thng ca ng vt th nghim sau
khi tiờm. ở nhúm tiờm KHT, trng lng chut gim nhiu hn. Hin tng ny cú th do
nh hng ca cỏc thnh phn trong KHT. Tuy nhiờn, sang ngy th 4, trng lng ca
chut ở c 2 nhúm tiờm u tng tr li, iu ny chng t quỏ trỡnh tiờm th
nghim t
hiu qu.
Vi kt qu thu c v theo tiờu chun ỏnh giỏ ca Dc đin Vit Nam [2] v T chc
Y t Th gii [4], KHT khỏng B. anthracis tinh ch ny m bo tớnh an ton trờn ng vt thc
nghim.
2. Kết quả đỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT tinh ch.
* Liu gõy c (LD
50
): tiờm cỏc liu gõy c vi nhng nng khỏc nhau, thu c kt
qu:
Bng 1: Tiờm chut tớnh liu gõy c LD
50
.

tỷ lệ chết

nồng độ
liều gây
độc

số
chuột
sống

số
chuột

chết
Tỷ
s
Phn
trm
(%)
10
1
0 8 8/8 100
10
0
3 5 5/8 62,5
10
-1
7 1 7/8 12,5
10
-2
8 0 0/8 0
10
-3
8 0 0/8 0

LD
50
vo khong gia nng pha loóng 10
0
v 10
-1
VK, phn trm cht tng ng vi
liu sỏt trờn 50% l 62,5%, phn trm tng ng liu sỏt di 50% l 12,5%. Tớnh toỏn

bng Spearman - Kọrber [8] thỡ LD
50
titer = 10
-1,33
.
* ỏnh giỏ hiu lc bo v: xỏc nh s chut tiờm liu gõy cht + KHT tinh ch cũn sng
ỏnh giỏ hiu lc bo v ca KHT.
Bng 2: Theo dừi chut sau tiờm liu gõy c LD
50
v 1 ml KHT pha loóng nng 1/2 .


liều tiêm

số
lợng
chuột

số chuột
sống
tỷ lệ chuột
sống/số
chuột thí
nghiệm
2 x LD
50
5 2 2/5
4 x LD
50
5 0 0

8 x LD
50
5 0 0
10 x LD
50
5 0 0

Từ hiệu giá của KHT sử dụng là 1/640, tiến hành tiêm liều KHT pha loãng 1/2 với các liều
gây độc đã định trước. Kết quả bảng 2 cho thấy, chỉ duy nhất nhóm tiêm liều gây độc 2 x
LD
50
có chuột còn sống. Tuy nhiên, số chuột sống sót ở nhóm này chỉ đạt 40%. Do vậy, sử
dụng liều tiêm KHT pha loãng 1/2 là không có tác dụng bảo vệ.
Bảng 3: Theo dõi chuột sau tiêm liều gây độc

và 1 ml KHT tinh chế hiệu giá 1/640.

liÒu tiªm
sè chuét
thö nghiÖm
sè chuét
sèng sãt
2 x LD
50
5 5 (100%)
4 x LD
50
5 5 (100%)
8 x LD
50

5 5 (100%)
10 x LD
50
5 5 (100%)

100% số chuột tiêm KHT không pha loãng với các liều gây độc khác nhau đều sống,
không có biểu hiện bệnh lý đến ngày thứ 10 của thử nghiệm. Điều đó chứng tỏ KHT hiệu giá
1/640 có tác dụng bảo vệ với các liều gây độc đã tiến hành trong thử nghiệm.

KÕt luËn
KHT chống VK than tinh chế hiệu giá 1/640 do Học viện Quân y và Công ty Vắcxin
Pasteur Đà Lạt sản xuất đảm bảo tính an toàn trên động vật thực nghiệm và có hiệu lực bảo
vệ ở liều gây chết 10 x LD
50
của chủng VK độc lực B. anthracis 17JB.

Tµi liÖu tham kh¶o

1. Dược điển học Việt Nam. Xuất bản lần 3. 2003.
2. Nguyễn Thị Lan Phương. Thẩm định thử nghiệm sinh học áp dụng trong kiểm định vắcxin và
huyết thanh. Tạp chí Y học Dự phòng. 2003. Tập XIII, số 6 (63), tr.108-112.
3. General requirements for the sterility of biological substances (Requirements for Biological
substances No.6, revised 1973). In: WHO. Expert Committee on Biological Standardization. Twenty-fifth
report. Geneva, World Health Organization, 1973 (WHO Technical Report Series, No. 530); and
Amendment 1995 in WHO Expert Committee on Biological Standardization. Forty-sixth report.
Geneva, World Health Organization, 1998 (WHO Technical Report Series, No 872).
4. Shirin S, Ramona D., Stephen R and et al. Inhalation anthrax: Epidemiology, diagnosis, and
management. CHEST. 1999.
5. Friedlander A.M, and Parker G.W Anthrax vaccine: evidence for safety and efficacy against
inhalational anthrax. JAMA. 1999. 282: 2104-2106.

6. World Health Organization (WHO). Emerging and other communicable diseases, surveillance and
control. Guidelines for the surveillance and control of anthrax in humans and animals. WHO Doc. No.
WHO/EMC/ZDI/98.6. Geneva: WHO; 1998. Available at:

zoonoses/docs/whoemczdi986.html. Accessed October 11, 2001.
7. F. X Mesline, M.M. Kaplan, H.Koprowski. Laboratory techniques in rabies. 4th edition. WHO
Geneva. 1996. Testing the safety and potency of vaccines.