NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC - CHƯƠNG 3 ppt

CHƯƠNG III
CÁC KỸ THUẬT CỦA CÔNG
NGHỆ GEN
I- SƠ ĐỒ KHÁI QUÁT
II- CÁC CÔNG CỤ
III- CÁC KỸ THUẬT VÀ PHƯƠNG
PHÁP CĂN BẢN
IV- PHƯƠNG PHÁP PCR
V. XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ CÁC
NUCLEOTIDE CỦA GEN
• Vào năm 1972 – 1973, Berg, Boyer và Cohen ở
Mó đã tạo nên phân tử DNA tái tổ hợp in vitro từ
ba nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Tiếp
theo, 1973 – 1974, nhóm Cohen, Helinski, Boyer
đã lần đầu tiên nhận được DNA tái tổ hợp có
hoạt tính sinh học.
Sự khác nhau căn bản
của kó thuật mới với phương pháp cũ ở
chỗ cho phép trong điều kiện thí nghiệm in
vitro (trong ống nghiệm) tạo thành (ghép
nối) các tổ hợp có hoạt tính khi đưa trở vào
tế bào sống từ các đoạn DNA khác nhau
có lựa chọn.
Kể THUAT TAI TO HễẽP DNA.
1. Sụ ủoõ khaựựi quaựựt.
1.Tách DNA plasmid và DNA tế
bào cho (người).
2. Cắt cả hai loại DNA
restriction endonuclesae tạo
các đầu so le cố kết. 3. Trộn

2 loại DNA để gắn gen lạ
vào plasmid. 4. Ligase tạo
liên kết hóa trò
(Phosphodiester) . 5.
Chuyển ADN tái tổ hợp vào
tế bào nhận (vi khuẩn
E.coli).
6. Tạo dòng.
II. CAC CONG CUẽ
1. CAC CONG CUẽ ENZYME.
Restriction endonuclease (caột).
Ligase (noỏi).
Reverse transcriptase.
DNA-polymerase
Nuclease.
Taq-polymerase.
RESTRICTION ENDONUCLEASE
(RE)
•- Phân lập từ vi khuẩn, mà 25% có
ít nhất 1 RE.
- Trình tự nhận biết (recognition
site) trên DNA mạch kép. Ví dụ
e.g. EcoRI: GAATTC
CTTAAC
- Có 3.000 RE đã được phát hiệän với
hơn 230 trình tự nhậän biết
Wadsworth CenterWadsworth Center
ORNL
b. Enzyme Ligase (nối).

•Liên kết phosphodiester được tạo
ra giữa G-A hay A-G trên mỗi
mạch DNA .
c
) Enzyme phiên mã ng
ư
ơ
ï
c
(Reverse
transcriptase)
• Enzyme reverse transcriptase có khả năng tổng hợp nên
DNA một mạch được gọi là c-DNA (complementary DNA)
từ khuôn mRNA hoặc từ một đoạn polyribonucleotide tổng
hợp hoá học. Nhờ enzyme reverse transcriptase này có
thể tổng hợp hầu như bất cứ gen riêng biệt nào miễn có
mặt mRNA của gen đó. Các c-DNA mạch đơn có thể
được biến thành mạch kép nhờ DNA polymerase và được
gọi là c-DNA kép (c-DNA duplex) .
• Đoạn c-DNA kép được gắn vào plasmid và biến nạp vào
vi khuẩn để tạo dòng c-DNA.
d) Các enzyme khác
Enzyme Chức năng
Dnase I Phân huỷ DNA mạch kép bằng
thuỷ giải nội liên kết
phosphodiester.
Nuclease BAL31 Phân huỷ cả 2 đầu mút 3’ và 5’ của
DNA không cắt nội liên kết.
S1 nuclease Phân huỷ DNA mạch đơn.

Đoạn Klenow DNA polymerase chỉ còn hoạt tính
exonuclease 3’ –> 5’
Taq DNA
polymerase
DNA polymerase chòu nhiệt từ vi
khuẩn Thermophilus aquatus
2. CÁC VECTOR CHUYỂN GEN
• - Vector plasmid
• - Phage lamda
• - Cosmid
• - YAC (Yeast artificial chromosome –NST
nhân tạo của nấm men)
• - Ti-plasmid từ vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
• - Phage 1 mach M13.
MCR : MULTICLONING REGION
Ca
ù
c vector chuye
å
n gen phải thoả mãn ca
ù
c
yêu cầu tối thiểu :
• – Có các trình tự khởi sự sao chép (ori) để tự sao
chép mà tồn tại độc lập.
• –Cócác trình tự nhận biết, nơi cắt để hở làm chỗ
ráp đoạn gen lạ vào.

• –Các trình tự điều hòa (promoter) tạo thuận lợi
cho sự phiên mã gen lạ.
• – Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ
hợp.
• –Cócác gen đánh dấu để dễ dàng phát hiện ra
chúng hoặc các gen lạ.
Ca
ù
c vector chuye
å
n gen co
ù
5 ứng dụng
quan trọng chủ yếu :
• – Tạo dòng và khuếch đại trình tự của
DNA (nhiều bản sao giống nhau).
• – Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn
trình tự DNA.
• – Chuyển gen vào tế bào các sinh vật khác.
• – Sản xuất RNA.
• – Sản xuất protein từ gen được tạo dòng.
a
) Ca
ù
c
vector plasmid
• Một trong những plasmid được sử dụng rộng rãi
nhất là pBR322 (hình 3.4). Như mô tả, plasmid này
có gen kháng ampicilline (ampR), gen kháng
tetracyline (tetR), trình tự xuất phát sao chép (ori)

và nhiều trình tự nhận biết đặc hiệu cho các RE
như EcoRI , HindIII, BamHI, SalI, Nó có khả
năng sao chép độc lập với bộ gen tế bào E.coli và
tồn tại với số lượng trung bình 20 – 30 bản sao cho
mỗi tế bào.
P
lasmid pBR322
3. Các hệ thống tế bào chủ.
• – Nuôi số lượng lớn để tách plasmid
cho thí nghiệm tạo dòng.
• – Dùng để biểu hiện gen tái tổ hợp,
đặc biệt ở Eukaryotae bậc cao như tế
bào động thực vật.
• – Dùøng để sản xuất các protein tái tổ
hợp.
a. Vi khua
å
n Escherichia coli (E.
coli).
E. coli doøøng JM109
a. Vi khuẩn Escherichia coli
(E. coli).
E.coli là vi khuẩn Gram âm,
hình que (~ 1 micromet), không
độc, thường gặp trong ruột
người. Bộ gen là một phân tử
DNA (nhiễm sắc thể) vòng tròn
khoảng 4,6 x 10
6
cặp base, nằm

ở vùng nhân (nucleoid).
Tế bào vật chủ đơn giản nhất
b. Nấm men Saccharomyces
cerevisiae.
• – Thứ nhất, nó là một Eukaryotae đơn bào (~ 5
micromet), biết rất chi tiết về DT và SL
• – Thứ hai, vài promoter mạnh được phân lập từ S.
cerevisiae, đặc biệt YAC.
• –Thứ ba, S. cerevisiae có khả năng thực hiện các
biến đổi sau dòch mã
• – Thứ tư, thường tiết ra rất ít loại protein
• – Thứ năm, nó đã được sử dụng nhiều thế kỉ trong
sản xuất bánh mì và bia, đưa vào danh sách sinh
vật an toàn thực phẩm