Báo cáo lâm nghiệp: "Influence d’une réhydratation préalable la germination in vitro du pollen de douglas (Pseudotsuga menziesii) après conservation" docx

Influence
d’une
réhydratation
préalable
sur
la
germination
in
vitro
du
pollen
de
douglas
(Pseudotsuga
menziesii)
après
conservation
J.P.
CHARPENTIER
M.
BONNET-MASIMBERT
LN.R.A.,
Station
cl’Amélioration
des
Arbres
forestiers,
Centre
de
Recherrhc·s
d

’Orléa
l
1s,
Ar
d
ol1,
F
45160
Olivet
Résumé
Après
avoir
précisé
les
conditions
de
germination
in
vitro
du
pollen
de
douglas
(I!.1!PLI(IOtS’Lfgci
I77PI71
W’
,S’(f),
nous
avons
défini

les
modalités
d’utilisation
d’un
pollen
déshydraté
avant
conservation.
Pour
la
mise
en
route
du
processus
de
germination,
une
phase
préalable
d’hydratation
ménagée
s’est
avérée
indispensable.
Cette
hydratation
s’effectue
bien
à

26
"C
pendant
16
h.,
en
atmosphère
saturée
d’eau.
Elle
permet
il
certains
lots
de
passer
de
13
p.
J00
à
65
p.
100
de
germination.
En
parallèle,
une
étude

cytologique
a
révélé,
au
niveau
ultrastructural,
une
évolution
du
cytoplasme
au
cours
de
l’hydratation.
Celle-ci
concerne
notamment
le
chondriome
et
l’appareil
vacuolaire.
1.
Introduction
Toutes
les
techniques
de
conservation
du

pollen,
revues
notamment
par
S
NYDER
& C
I.
AUSEN

(1974),
reposent
sur
l’utilisation
de
températures
basses
nécessitant
une
déshydratation
parfois
très
importante
du
pollen.
Or,
si
de
nombreuses
études

concernent
les
techniques
de
conservation
clles-mêmes,
bien
peu
s’intéressent
à
la
manière
d’utiliser
le
pollen
après
conservation.
Cependant
certains
auteurs
signalent
qu’une
exposition
en
atmosphère
humide,
le
plus
souvent
réalisée

en
conditions
non
contrôlées,
favorise
la
germination.
C’est
le
cas
de
D
UFFIELD

&
S
NO
w
(1941)
sur
Pin i
lS

stt-obiis
et
P.
resinosa,
VISSER
(1955)
sur

poirier
et
pommier,
K
ING

(1965)
sur
plusieurs
angiospermes,
J[;
NSEN
( I 970)
sur
quelques
gymnospermes,
M URI!N
et
al.
( 1979)
sur
douglas.
S
IMONS

ri
al.
( 1972)
sur
Liliu

lI1

10
ngifolillll1,
Bna-SHnnoM
&
MnTTSSOrv
(1976)
sur
divers
angiospermes
et
G
II
-
ISSE
N
(1977)
sur
Petnnio
hyhrida
considèrent
cette
phase
de
réhydratation
comme
essentielle
pour
l’ohtcntion

d’unc
bonne
gcrmination,
et
notent
l’importance
du
mode
d’hydratation.
(1)
Adresse
présente :
Laboratoire
d-
6lude
des
C’emposes
Phénoliqtie,,.
U.E.R.
Sciences-
Orléans,
F
45046
Orléans
Cedex.
Un
travail
effectué
dans
notre

Station
depuis
1979
sur
la
conservation
et
la
germi-
nation
du
pollen
de
douglas
(Pseudotsuga
menziesii
Mirb.
Franco)
nous
a
conduits
à
supposer
que
de
mauvais
taux
de
gertnination
pouvaient

parfois
n’être
dus
qu’à
des
difficultés
d’hydratation.
Cette
étude
visait
donc,
après
mise
au
point
d’une
méthode
de
germination,
à
préciser,
y
compris
sous
l’angle
cytologique,
la
nature
et
l’ampleur

du
phénomène
et
à
définir
les
modalités
permettant
de
le
maîtriser.
2.
Matériel
et
techniques
2.1.
Pollen
Les
essais
préliminaires
et
mises
au
point
de
techniques
ont
été
effectués
avec

du
pollen
récolté
en
1979
et
en
1980
et
conservé
à
des
températures
variées
allant
de
-
4
4 &dquo;C
à
-
17
°C.
Les
essais
précis
concernant
la
déshydratation
et

la
réhydratation
portent
sur
du
pollen
frais
récolté
au
printemps
1981.
Dans
ces
essais,
la
déshydratation,
en
vue
d’obtenir
une
gamme
de
teneurs
en
eau
de
3,5
p.
100
à

8,5
p.
100
est
réalisée
en
plaçant
le
pollen,
en
fine
couche,
sur
papier
filtre
déposé
à
la
surface
d’un
lit
d’actigel
’(sel
déshydratant),
à
l’intérieur
d’une
enceinte
hermétique.
Le

pollen
est
ensuite
placé,
en
flacons
étanches,
à
-
1
°C.
2.2.
Test
de
germination
Il
convient
tout
d’abord
de
rappeler
que
chez
le
douglas,
il
n’y
a
individualisation
d’un tube

pollinique,
d’ailleurs
très
court,
qu’au
contact
du
nucelle
(BAR
NER
&
C
HRIS
TIAN-
SEN
,
1962 ;
A
LLE
rr
&
OwE
N
S,
1972,
etc.).
Par
contre,
c’est
l’ensemble

du
grain
qui
s’allonge
pour
former
une
structure
tubulaire.
Nous
avons
donc
considéré,
par
extension,
que
ce
processus
d’élongation
caractérisait
un
pollen
en
cours
de
germination.
Les
tests
ont
été

réalisés
en
germoirs,
à
25::!::
1
&dquo;C,
à
l’obscurité,
en
ambiance
saturée
d’humidité,
selon
la
technique
dite
en
« goutte
pendante ».
Le
milieu
de
base
pour
la
germination
est
celui
de

B
RE
wsnx
ER
&
K
WACK

(1963)
(H!BO!
(100
mg/1) ;
Ca(NO
ah
,
4
H2
0 (300
mg/1) ;
KNO,
:
(100
mg/1) ;
Mg
S0
4,
7
H2
0 (200
mg/1).

Il
est
stérilisé
par
autoclavage
à
120
&dquo;C
pendant
20
minutes.
L’étude
de
l’influence
du
pH
du
milieu
a
révélé
(tabl.
1)
que
c’était
entre
4,3
et
6,1
(pH
obtenu

avec
de
l’eau
distillée,
sans
ajustement)
que
les
taux
de
germination
étaient
les
meilleurs.
La
comparaison
de
milieux
avec
ou
sans
saccharose
(5
p.
100)
s’est
avérée
défavorable
au
milieu

sucré,
qui
stimule
surtout
le
développement
des
infections
et
provoque
un
éclatement
des
grains
de
pollen,
sans
stimulation
notable
de
leur
croissance.
Les
tests
de
germination
ont
donc
été
réalisés

en
l’absence
de
sucre.
Par
contre,
nous
avons
ajouté
dans
le
milieu,
après
autoclavage,
15
5 jtg/ml
de
nystatine
et
15
5
pg/ml
de
chloramphénicol
(MuRSrt
et
al.,
1979),
qui,
après

comparaison
avec
d’autres
produits
phytosanitaires
se
sont
avérés
les
plus
efficaces
pour
empêcher
la
prolifération
des
bactéries
et
champignons.
2.3.
Réhydratation
Les
échantillons
de
pollen,
placés
en
boîtes
de
Pétri

ouvertes,
sont
mis
dans
un
bocal
étanche
au-dessus
d’une
couche
d’eau
distillée
(hygrométrie
saturante)
ou
de
l’une
des
quatre
solutions
saturées
suivantes,
permettant
d’établir
dans
le
bocal
différents
degrés

d’humidité
relative
(HR)
(valeurs
données
à
20
&dquo;C) :
chlorure
de
calcium
(HR
=
35
p.
100),
nitrate
de
calcium
(HR =
55
p.
100),
nitrate
d’ammonium
(HR
=
63
p.
100),

sulfate
d’ammonium
(HR
=
80
p.
100).
La
température
avait
été
définie
dans
un
essai
préliminaire,
après
18
h
d’hydratation
(en
hygrométrie
saturante),
à
l’une
des
trois
températures
suivantes :
+

4
&dquo;C,
-!
20
&dquo;C
et
+
26
&dquo;C.
Contrairement
à
M
UREN
et
al.
(1979)
qui
utilisaient
+ 4 &dquo;C,
nous
avons
obtenu
les
meilleurs
résultats
à
26
&dquo;C.
C’est
donc

cette
température
qui
a
été
retenue
pour
les
réhydratations.
Après
cette
phase,
une
partie
du
pollen
est
mise
en
germination,
le
reste
servant
à
la
mesure
de
la
teneur
en

eau.
Celle-ci
est
calculée
par
rapport
au
poids
frais,
sur
100
à
200
mg
de
pollen,
par
mesure
de
la
perte
en
eau
après
une
heure
de
séchage
à
105

&dquo;C.
2.4.
Microscopie
l;lectronique
Le
pollen
est
d’abord
fixé
par
une
solution
de
glutaraldéhyde
à
4
p.
100
dans
un
tampon
cacodylate
de
sodium
à
pH
7.
Il
est
ensuite

post-fixé
par
une
solution
de
tétroxyde
d’osmium
à
1 p.
100
dans
un
tampon
véronal
à
pH
7,4.
Après
chaque
bain,
le
pollen
est
récupéré
par
une
légère
centrifugation
(10
mn

à
1 000
t/mn).
Le
culot
de
pollen
est
ensuite
inclus
dans
la
gélose
à
10
gli.
Puis des
morceaux
de
gélose
contenant
une
forte
densité
de
pollen
sont
découpés
et
inclus

dans
l’araldite
selon
la
technique
de
G
LAUERT

&
G
LAUERT

(1958).
Les
coupes
ultrafines
débitées
à
l’ultra
microtome
peuvent
être
observées
sans
coloration,
ou
bien
contrastées,
soit

par
le
permanganate
de
potassium
à
1 p.
100
dans
l’eau,
soit
par
l’acétate
d’uranyle
et
le
citrate
de
plomb.
Les
observations
ont
été
faites
à
l’aide
d’un
microscope
électronique
Hitachi

HU
1
E.
3.
Résultats
et
commentaires
3.1.
Influence
de
la
1’l
;/
¡vd
Yl
ltation
sur
le
taux
de
gcrmimtioo
Un
premier
essai
a
porté
sur
deux
lots
de

pollen
conservés
pendant
3
mois
en
réci-
pients
étanches,
à
-
1 &dquo;C,
avec
des
teneurs
en
eau
respectivement
de
5,2
et
7,9
p.
100.
Nous
avons
étudié
l’influence,
sur
la

teneur
en
eau
et
la
germination,
de
l’humidité
relative
de
l’atmosphère
de
réhydratation,
pour
une
même
durée
de
18
h.
Les
résultats
obtenus,
après
48
h.
de
germination,
sont
donnés

dans
le
tableau
2.
Les
deux
lots
manifestent
une
même
évolution :
augmentation
du
taux
de
germination
avec
l’augmen-
tation
de
teneur
en
eau.
Cette
relation
est
beaucoup
plus
prononcée
pour

le
lot
1
qui
passe
par
hydratation
à
HR
=
100
p.
100
d’un
taux
de
germination
de
4,3
à
54,5
p.
100.
Le
lot
2,
moins
déshydraté
au
départ,

gagne
20
p.
!100
de
germination
(différence
significative)
grâce
à
la
phase
d’hydratation.
Enfin,
il
est
à
noter
que,
à
teneur
équi-
valente,
les
taux
de
germination
du
lot
1

restent
toujours
nettement
inférieurs
à
ceux
du
lot
2,
phénomène
qui
ne
s’atténue
qu’à
partir
de
22
p.
100
de
teneur
en
eau.
II
est
probable
que
ceci
traduit
des

difficultés
de
mise
en
route
des
processus
germinatifs
lorsque
la
déshydratation
préalable
a
été
trop
importante.
Enfin,
dans
les
deux
cas,
c’est
à
HR
=
100
p.
100
que
la

meilleure
germination
est
obtenue.
Nous
avons
alors,
dans
un
deuxième
essai,
étudié
l’influence
de
la
durée
de
la
phase
d’hydratation
sur
la
teneur
en
eau
et
la
germination
(après
30

h.).
L’essai
a
été
conduit à
HR
=
100
p.
100.
Les
résultats
sont
donnés
dans
le
tableau
3.
Là
aussi
le
taux
de
germination
s’élève
rapidement
avec
les
teneurs
en

eau
croissantes.
Déjà,
après
1
heure,
le
taux
est
passé
de
13,2
à
41,9
p.
100.
Il
passera
à
65,8
p.
100
après
16
h.
Des
durées
plus
longues
n’ont

pas
été
expérimentées,
mais
il
apparaît
déjà
possible
de
stimuler
considérablement
la
germination
in
vi!ro
par
simple
application
d’une
phase
de
réhydratation
préalable.
Ces
résultats
rejoignent
ceux
de Gt!!ssEN
(1977)

sur
pollen
de
Petunia
hybrida,
qui
a
montré
que,
par
prétraitement
en
atmosphère
saturée
d’eau,
on
pouvait
restaurer
une
germination
normale
de
grains inaptes
à
germer
immédiatement
après
stockage
en
atmosphère

à
HR
=
0
p.
100. L’auteur
relie
cette
différence
de
germination
à
une
différence
d’aptitude
au
gonflement
initial
des
grains,
elle
même
associée
à
une
différence
de
porosité
et
d’épaisseur

des
parois
du
pollen
et
des
membranes
plasmiques
selon
l’atmosphère
de
stockage.
3.2.
Etude
cytoloâi
q
ue
de
la
réhydratation
L’observation
en
microscopie
électronique
de
grains
très
déshydratés
est
rendue

pratiquement
impossible
à
cause
des
difficultés
de
fixation
et
d’inclusion.
Nous
n’avons
cependant
pas
essayé
la
technique
de
O
PIK

(1980)
qui,
par
séjour
prolongé
de
l’échantillon
en
présence

de
vapeurs
de
tétroxyde
d’osmium
permet
une
fixation
anhydre.
Donc,
sans
aller
jusqu’aux
teneurs
en
eau
très
basses,
nous
avons
pu
noter
une
évolution
de
la
structure
de
certains
organites

du
cytoplasme,
en
particulier
les
mitochondries
et
les
vacuoles,
que
l’on
peut
incontestablement
attribuer
aux
effets
de
la
réhydratation.
Dans
les
grains
peu
hydratés,
les
mitochondries
apparaissent
grandes,
sphériques,
claires

et
dépourvues
de
crêtes
(fig.
1 ),
aspect
assez
typique
d’une
mitochondrie
non
fonctionnelle.
Au
cours
de
la
réhydratation,
les
crêtes
se
développent
progressivement
et
les
mitochondries
prennent
une
forme
plus

allongée,
caractéristique
de
mitochondries
fonctionnelles
(fig.
2).
De
même,
à
un
stade
d’hydratation
peu
avancé,
on
distingue
des
structures
iden-
tifiables
à
des
grains
d’aleurone
(fig.
3).
En
cours
de

réhydratation,
on
note
le
dévelop-
pement
progressif
des
vacuoles
à
partir
de
ces
grains
d’aleurone
en
voie
de
dégradation
(fig.
4).
Enfin,
à
ce
stade,
les
grains
d’amidon
sont
bien

visibles
dans
les
très
nombreux
plastes.
Cette
évolution
cytologique,
en
particulier
au
niveau
des
mitochondries
et
des
vacuoles,
est
tout
à
fait
analogue
à
celle
qui
est
décrite
par
certains

auteurs
sur
divers
embryons
mis
en
germination
(N
OUGAREDE
,
1963
a - 1963
b,
sur
Tropaeolum
majus ;
H
ALLAM

et
al.,
1972,
sur
Secnle
cereale ;
Vozzo,
1973,
sur
Quercus
nigra).

4.
Conclusion
Ce
travail
montre
bien
qu’un
grain
de
pollen
n’est
pas
systématiquement
apte
à
germer
immédiatement,
au
moins
dans
les
conditions
d’une
germination
in
vitro.
Lors
de
la
déshydratation

rendue
nécessaire
pour
sa
conservation,
le
pollen
perdrait,
de
manière
réversible,
l’aptitude
à
absorber
très
rapidement
une
grande
quantité
d’eau,
phénomène
qui
se
produit
normalement
au
début
de
sa
germination.

On
peut
par
contre
réaliser
un
prétraitement
du
pollen
en
atmosphère
humide,
ce
qui
assure
une
première
phase
de
réhydratation
lente
au
cours
de
laquelle
le
métabolisme
se
réactive.
Durant

cette
phase,
la
teneur
en
eau
s’élève
pour
atteindre
au
bout de
16
h.
une
valeur
voisine
de
celle
d’un
pollen
considéré
au
moment
de
sa
déhiscence
en
conditions
naturelles,
et

l’on
constate
parallèlement
une
évolution
des
vacuoles
et
du
chondriome.
Mais
il
est
clair
qu’une
telle
évolution
ne
pourrait
être
instantanée.
Comme
chez
plusieurs
autres
espèces,
(D
UFFfELD

&

S
NOW
,
1941 ;
VISSER,
1955 ;
K
INC
,
t965 ;
Jervsetv,
1970 ;
GtLrssEH,
1977 ;
M
UREN

et
al.,
1979)
on
voit
donc
que
pour
du
pol!len
conservé
après
déshydra-

tation,
la
seule
introduction
de
cette
phase
de
réhydratation
ménagée
permet
à
certains
lots
de
retrouver
un
taux
élevé
de
germination.
Cette
constatation
pourrait
permettre
d’améliorer
les
techniques
de
conservation

en
autorisant
une
déshydratation
plus
poussée
que
celle
qui
est
actuellement
conseillée.
On
peut
notamment
penser
aux
techniques
de
lyophilisation
rarement
utilisées
pour
le
pollen
d’arbres
forestiers.
Il
resterait
enfin

à
déterminer
si
ce
phénomène
qui
se
manifeste
in
vitro,
peut
aussi
se
produire
lors
de
pollinisations
artificielles :
une
telle
expérimentation
est
actuellement
en
cours.
Quand
on
sait
l’importance
que

pourrait
prendre
ce
type
de
pollinisation
dans
les
vergers
à
graines,
on
voit
à
quel
point
il
y
aurait
lieu
d’approfondir
les
études
portant
sur
la
conservation
du
pollen
d’arbres

forestiers
et
sur
son
utilisation.
Reçu
p
Olir
p
ll
hlicatio
ll
le
26
octobre
1982.
Remerciements
Nous
tenons
tout
spécialement
à
remercier
Mademoiselle
L.
C
HESN
OY,
du
Laboratoire

de
Cytologie
et
Biologie
de
la
Reproduction,
Université
Paris
VII,
pour
l’aide
bienveil-
lante
qu’elle
nous
a
apportée
dans
la
partie
cytologique
de
ce
travail.
Summary
The
influence
of
a

rehydration
phase
before
the
in
vitro
germination
of
dou
b
lns-fir
pollen
(Pseudotsuga
menziesii)
after
storage
The
conditions
for
in
vitro
germination
of
douglas-fir
pollen
were
precised.
Then,
special
conditions

for
the
use
of
dessicated
pollen,
after
storage,
were
investigated.
A
slow
hydration
appeared
to
be
a
decisive
phase
for
the
early
processes
of
pollen
germination.
A
pretreatment
for
16

hours
at
26 °C,
under
100
p.
100
relative
humidity,
was
enough
to
allow
more
than
65
p.
100
pollen
grains
to
germinate
in
a
pollen
lot
germinating
less
than
13

p.
100
without
prehydration.
A
cytological
study
revealed
a
strong
evolution
of
the
chondriom
and
vacuoles
during
this
hydration
phase.
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Premières
observations
sur
l’infrastructure
et

sur
l’évolution
des
cellules
des
jeunes
ébauches
foliaires
embryonnaires
du
Tropaeolum
majus
L :
cyto-
logie
de
l’hydratation
germinative
et
des
premières
étapes
de
la
germination.
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