Nghiên cứu sử dụng pepsin để khử protein trong qui trình sản xuất chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng

LỜI CẢM ƠN
Báo cáo này là một trong những báo cáo lớn nhất để đánh dấu kết thúc quá
trình học tập, là thành quả 16 năm học và phấn đấu. Đây là cơ hội để em bày tỏ lòng
biết ơn sâu sắc tới những người đã giúp đỡ em trong suốt những năm tháng qua.
Qua 3 tháng nỗ lực phấn đấu, cuối cùng với sự giúp đỡ tận tình của các thầy
cô và bạn bè em đã hoàn thành đề tài này. Qua đây em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu
sắc đến cô, Thạc Sĩ Ngô Thị Hoài Dương, người đã tận tình truyền đạt những kiến
thức trong quá trình thực tập, chỉ bảo những kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành
đề tài này.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn trân trọng nhất tới các thầy cô trong khoa chế
biến đã nhiệt tình truyền đạt cho em những kiến thức trong những năm học vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến các thầy, cô phụ trách phòng thí nghiệm Viện Công
Nghê Sinh Học và Môi Trường, cùng thầy cô bộ môn công nghệ chế biến, bộ môn
quản lý chất lượng và an toàn thực phẩm, bộ môn công nghệ lạnh đã tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực tập. Chân thành cảm ơn các bạn sinh viên
lớp 50CBTS, các chị cùng các bạn sinh viên thực tập tại phòng thí nghiệm đã nhiệt
tình giúp đỡ động viên em.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến bố, mẹ kính mến cùng anh chị em
thân yêu. Những người đã ủng hộ nhiệt tình cả vật chất lẫn tinh thần trong quá trình
thực tập và thực hiện đề tài.
Sinh viên
Nguyễn Thị Vân

i
MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
MỤC LỤC i
DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC HÌNH vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
PHẦN 1: TỔNG QUAN 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN
TÔM ĐÔNG LẠNH. 3
1.1.1. Tình hình xuất khẩu tôm ở Việt Nam những năm gần đây 3
1.1.2 Nguyên liệu còn lại (NLCL) trong chế biến tôm. 3
1.1.2. Thành phần, tính chất của đầu và vỏ tôm. 4
1.1.2.1. Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm 4
1.1.2.2. Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm 5
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITIN 6
1.2.1. Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên. 6
1.2.2. Cấu tạo-tính chất của chitin 7
1.2.2.1. Cấu tạo của chitin 7
1.2.2.2. Tính chất của chitin 7
1.2.3. Ứng dụng của chitin - chitosan 8
1.2.4. Các phương pháp sản xuất chitin 10
1.2.5. Yêu cầu chất lượng sản phẩm chitin 11
1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE. 12
1.3.1. Enzyme, phân loại enzyme 12
1.3.2. Nguồn thu nhận enzyme protease 14
1.3.3. Cơ chế tác dụng của protease 15
1.3.4. Hoạt độ enzyme 16
1.3.5. Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease 16
ii
1.3.5.1. Protein thủy phân 16
1.3.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein của enzyme
protease 18
1.3.7. Tính ưu việt của enzyme protease và ứng dụng của chúng. 20
1.3.7.1. Tính ưu việt của enzyme protease. 20

1.3.7.2. Ứng dụng của enzyme protease 21
1.4. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHITIN 23
1.4.1. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản. 23
1.4.2. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học
với một công đoạn xử lý kiềm 25
1.4.3. Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản 26
1.4.3. Quy trình sử dụng enzyme Papain để sản xuất chitosan Luyến, 2003) 27
1.4.4. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto 28
PHẦN 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 31
2.1.1. Nguyên liệu vỏ tôm 31
2.1.2. Enzyme Protease 31
2.1.3. Hóa chất sử dụng 31
Tất cả các hóa chất sử dụng trong đề tài đều ở dạng tinh khiết dùng cho
phân tích. 31
2.1.4 Thiết bị: 31
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.2.1. Phương pháp thu nhận mẫu 31
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm. 32
2.2.3. Bố trí thí nghiệm tổng quát 32
2.2.4. Bố trí thí nghiệm xác định các thông số kỹ thuật. 33
2.2.4.1. Bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng
khoáng còn lại sau quá trình khử khoáng 2 giờ. 33
iii
2.2.4.2. Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ
sung enzyme Pepsin 34
2.2.4.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin đến hiệu quả
khử protein và hiệu quả khử khoáng 35
2.2.4.4. Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình
thủy phân bằng pepsin. 36

2.2.4.5. Thí nghiệm tối ưu hóa quá trình khử protein bằng enzyme Pepsin 37
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH HÓA HỌC 39
2.3.1. Xác định hàm lượng ẩm bằng phương pháp sấy ở nhiệt độ 105
0
C
theo TCVN 3700-1990 39
2.3.2. Xác định hàm lượng khoáng bằng phương pháp nung ở 550
0
C theo
TCVN 4588–1988 39
2.3.3. Xác định hàm lượng protein còn lại: Hàm lượng protein còn lại trên
chitin được xác định dựa vào phương pháp đã được Gornall AG và cộng
sự giới thiệu 39
2.3.4. Xác định hiệu xuất khử khoáng và protein: 39
Hiệu suất khử protein (DP (%)) và khử khoáng (DA (%)) được xác định
dựa trên công thức của Rao và cộng sự (2000) 39
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 40
3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng
với HCl 1% 40
3.2. Kết quả đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung
enzyme Pepsin 40
3.2.1. Ảnh hưởng tới hiệu quả khử protein 40
3.2.2. Ảnh hưởng đến hiệu quả khử khoáng: 42
3.3. Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme pepsin tới hiệu quả khử protein 43
3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình thủy phân của enzyme pepsin. 44
3.5. Kết quả tối ưu hóa quá trình thủy phân protein bằng enzyme pepsin 50
3.6. Đề xuất qui trình sản xuất chitin 62
iv
3.6.1. Thuyết minh quy trình 62
3.6.2. Sơ đồ 62

3.6.3. Đánh giá chất lượng của sản phẩm chitin thu được 63
PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 64
4.1. KẾT LUẬN 64
4.2. ĐỀ XUẤT 64
TÀI LIỆU THAM KHẢO 65



v
DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Tỷ lệ nguyên liệu còn lại của các loại tôm 4
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm 5
Bảng 1.3. Yêu cầu chất lượng của chitin trong các lĩnh vực khác nhau 12
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của các thông số lên hoạt động của enzym protease và
chất xúc tác vô cơ 21
Bảng 1.5. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ vỏ tôm sú theo phương
pháp sử lý kiềm một giai đoạn 25
Bảng 1.6. Một số chỉ tiêu chất lượng của chitosan từ quy trình sử dụng
Emzyme papain để sản xuất Chitosan 28
Bảng 2.1. Một số thiết bị thí nghiệm 31
Bảng 2.2. Ma trận bố trí thí nghiệm 37
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm với biến ảo của công
đoạn khử protein bằng enzyme Pepsin 38
Bảng 3.1. Hàm lượng protein và hàm lượng khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng 40
Bảng 3.2. Kết quả thăm dò ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt động của
enzyme pepsin 45
Bảng 3.3. Kết quả thí nghiệm tối ưu quá trình thủy phân bằng enzyme Pepsin 51
Bảng 3.4. Kết quả phân tích bậc cho mô hình hồi qui 52
Bảng 3.5. Kết quả phân tích ANOVA của mô hình hồi qui đã chọn 52

Bảng 3.6. Kết quả phân tích các chỉ số thống kê 53
Bảng 3.7. Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 3 57
Bảng 3.8. So sánh chất lượng chitin giữa sơ đồ dự kiến và các quy trình khác 63


vi
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Cấu trúc của chitin 7
Hình 1.2. Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease 15
Hình 1.3. Phản ứng thủy phân protein 16
Hình 1.4. Quy trình của Đỗ Minh Phụng, Trường Đại Học Thủy Sản 24
Hình 1.5. Quy trình sản xuất chitosan từ vỏ tôm sú bằng phương pháp hóa học
với một công đoạn xử lý kiềm ( Trần Thị Luyến, 2003) 25
Hình 1.6. Quy trình của Trung Tâm Chế Biến Đại Học Thủy Sản 26
Hình 1.7. Quy trình sử dụng Emzyme papain để sản xuất chitosan 27
Hình 1.8. Quy trình sản xuất chitin của Holan da và Netto 28
Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 32
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định hàm lượng protein và hàm lượng
khoáng còn lại sau 2 giờ khử khoáng 33
Hình 2.3. Sơ đồ thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên
liệu và bổ sung enzyme Pepsin 34
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của nồng độ enzyme
pepsin đến hiệu quả khử protein và hiệu quả khử khoáng 35
Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ
sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử protein 41
Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ
sung enzyme Pepsin đến hiệu quả khử khoáng 42
Hình 3.3. Đồ thị thể hiện ảnh hưởng của nồng độ pepsin đến hiệu quả khử
protein và khoáng 43

Hình 3.4. Bảng đánh giá mức độ ảnh hưởng của các nhân tố 46
Hình 3.5. Mô hình Half-Nomal Plot 46
Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhân tố nhiệt độ 47
Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhân tố nồng độ 48
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nhân tố thời gian 48
vii
Hình 3.9. Sự tương quan giữa nhiệt độ và nồng độ 49
Hình 3.10. Sự tương quan giữa nhiệt độ và thời gian 50
Hình 3.11. Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 1 55
Hình 3.12. Kết quả tối ưu tương ứng với điều kiện 2 56
Hình 3.13. Mô hình thiết kế tối ưu 59
Hình 3.14. Kết quả tối ưu 60
Hình 3.15. Mặt đáp ứng và contour tại chế độ tối ưu 61
Hình 3.16. Quy trình sản xuất chitin với sự kết hợp của HCl và enzyme pepsin 62



1
LỜI MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài:
Ở Việt Nam hiện nay chủ yếu sản xuất chitin-chitosan theo phương pháp hóa
học có sử dụng các loại hóa chất với nồng độ cao, thời gian xử lý dài gây nên sự
thủy phân polymer (Simpson và cộng sự, 1994; Healy và cộng sự, 1994), biến đổi
tính chất vật lý (Gagne và Simpson, 1993) làm ảnh hưởng tới chất lượng của chitin-
chitosan. Ngoài ra sản xuất chitin theo phương pháp hóa học có nhiều hạn chế như
thải ra môi trường nhiều chất thải có chứa chất ăn mòn, các chất lơ lửng khó xử lý
quá lớn làm ô nhiễm môi trường sống, nên tốn chi phí xử lý môi trường kéo theo sự
tăng giá thành của sản phẩm, khi sản xuất theo phương pháp hóa học không tận thu
được các chế phẩm sinh học khác như protein, astaxanthin…Và nó cũng gây ảnh
hưởng đến sức khỏe của con người. Vì vậy, việc nghiên cứu một quy trình cho phép

giảm tối đa lượng hóa chất sử dụng là rất cần thiết để góp phần giảm chi phí sản
xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm.
Phương pháp sản xuất chitin-chitosan bằng cách sử dụng enzyme đã góp
phần khắc phục hạn chế nói trên của phương pháp hóa học như: thể tích chất thải
không lớn, protein sau quá trình thủy phân bằng enzyme có thể thu hồi làm bột dinh
dưỡng, thức ăn cho gia súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được
thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn chế được việc xử lí môi trường…Tuy nhiên việc sử dụng
phương pháp sinh học cũng gặp rất nhiều khó khăn như tăng chi phí, hiệu quả khử
khoáng và protein thấp, thời gian kéo dài.
Xuất phát từ thực tế như trên, được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Chế
Biến- Khoa Công Nghệ Thực Phẩm- Trường Đại Học Nha Trang, dưới sự hướng
dẫn của cô Thạc Sỹ Ngô Thị Hoài Dương, đề tài “Nghiên cứu sử dụng Pepsin để
khử protein trong qui trình sản xuất Chitin từ vỏ tôm thẻ chân trắng” đã được thực hiện.
2. Mục đích của đề tài:
Xác lập các thông số cho quá trình khử protein trên vỏ tôm thẻ chân trắng
với enzyme Pepsin nhằm giảm thiểu hóa chất sử dụng, giảm ô nhiễm môi trường,
nâng cao chất lượng của chitin thành phẩm.
2
3. Tính khoa học, thực tiễn của đề tài.
Cung cấp thêm các dẫn liệu khoa học về việc sử dụng enzyme trong công
nghệ sản xuất chitin.
Kết quả của đề tài sẽ là cơ sở để tiếp tục nghiên cứu triển khai hướng sản
xuất chitin thân thiện với môi trường ở quy mô lớn.
4. Nội dung của đề tài.
- Tổng quan về công nghệ sản xuất chitin.
- Đánh giá ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu và bổ sung enzyme
tới khả năng khử protein của enzyme Pepsin.
- Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ Pepsin đến hiệu quả khử khoáng và khử
protein.
- Đánh giá ảnh hưởng của các nhân tố đến quá trình thủy phân protein với

enzyme pepsin.
- Tối ưu quá trình khử protein với Pepsin.
- Đề xuất quy trình và đánh giá chất lượng của sản phẩm chitin thu được.
3
PHẦN 1: TỔNG QUAN
1.1. TỔNG QUAN VỀ NGUYÊN LIỆU CÒN LẠI TRONG CHẾ BIẾN TÔM
ĐÔNG LẠNH.
1.1.1. Tình hình xuất khẩu tôm ở Việt Nam những năm gần đây
Trong những năm gần đây ngành chế biến thủy sản ở nước ta phát triển
mạnh mẽ, các sản phẩm thủy sản của chúng ta đã vươn ra nhiều nước trên thế giới
ngay cả những thị trường khó tính như: Mỹ, Nhật Bản, Châu Âu… Ngành đã tạo
công ăn việc làm cho hàng triệu người lao động. Bên cạnh đó còn đem về cho nhà
nước một nguồn ngoại tệ không nhỏ nhờ việc xuất khẩu các mặt hàng thủy sản đặc
biệt là mặt hàng thủy sản đông lạnh như: tôm, mực, cá….Trong đó tôm đông lạnh
chiếm tỉ lệ không nhỏ trong tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản hàng năm
Các mặt hàng tôm xuất khẩu rất đa dạng, nhưng chủ yếu đều được phát triển
từ tôm nguyên con bỏ đầu hoặc tôm lột.
Năm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng 12% so
với năm 2006. Năm 2008 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 4,27 tỉ USD. Năm 2009
kim ngạch xuất khẩu cả năm nước đạt 4,3 tỷ USD. Năm 2010 xuất khẩu thủy sản
của Việt Nam thiết lập kỷ lục mới với trên 5 tỷ USD, tăng 18% so với năm 2009.
Tôm là mặt hàng chủ lực đem lại con số 5 tỷ USD của thủy sản Việt Nam năm 2010.
Đây là lần đầu tiên xuất khẩu tôm của Việt Nam vượt con số 2 tỷ USD, với 241.000
tấn, tăng 13,4% về khối lượng và 24,4% về giá trị so với 209.567 tấn và 1,675 tỷ
USD của năm 2009. Năm 2011, XK thủy sản của Việt Nam đã cán đích 6,1 tỷ USD,
tăng 21% so với năm 2010 và tăng gấp hơn 3 lần so với mức 2 tỷ USD năm 2002,
XK tôm của Việt Nam tiếp tục đà tăng trưởng mạnh với giá trị năm 2011 đạt gần
2,4 tỷ USD, trong đó XK tôm sú chiếm 59,7% tổng giá trị, XK tôm thẻ chân trắng
chiếm 29,3%, còn lại là tôm các loại khác. Bộ NN và PTNT đặt mục tiêu năm 2012,
cả nước phấn đấu đạt tổng kim ngạch XK thủy sản 6,5 tỷ USD.

1.1.2 Nguyên liệu còn lại (NLCL) trong chế biến tôm.
Nguyên liệu còn lại sau quá trình sản xuất tôm đông lạnh xuất khẩu gồm có:
đầu, vỏ, thịt vụn. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu tôm từ 30-
4
70%, trung bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến (Watkin và cộng
sự, 1982; Evers và Carroll.
Trong đó phần đầu thường chiếm 34-45% và phần vỏ 10-15% so với lượng
tôm nguyên liệu đưa vào chế biến [1]. Tuy nhiên, tỷ lệ này tùy thuộc vào giống loài
và giai đoạn sinh trưởng của chúng. [1] [2].
Nguồn phế liệu này nếu biết tận dụng triệt để sẽ đem lại nguồn lợi nhuận
khổng lồ. Nó không chỉ đem lại giá trị kinh tế cao mà còn có ý nghĩa bảo vệ môi
trường [14].
Bảng 1.1. Tỷ lệ nguyên liệu còn lại của các loại tôm [3]
Đơn vị (%)
Loại tôm Tôm vỏ bỏ đầu

Tôm thịt Đầu tôm Vỏ tôm
He 61,19 52,05 29,80 10,00
Thẻ 62,95 53,62 28,00 9,00
Sú 62,96 52,84 31,40 8,90
Rằn 58,23 48,60 33,90 10,40
Gân 59,36 41,45 33,14 11,27
Chì 57,71 47,43 31,85 11,07
Bộp 60,32 49,02 31,55 12,15
Rảo 58,68 46,49 33,20 12,20
Vàng 60,25 48,04 31,75 13,07
Sắt 50,47 39,15 42,38 11,62
Càng 40,21 31,61 51,95 8,56
Hùm 28,08 22,20 63,40 5,50
Mủ ni 41,51 30,74 52,02 12,57

1.1.2. Thành phần, tính chất của đầu và vỏ tôm.
1.1.2.1. Cấu tạo và thành phần sinh hóa của vỏ tôm [1] [4]
Lớp ngoài cùng của vỏ tôm có cấu trúc chitin-protein bao phủ, lớp vỏ này thường
bị hóa cứng khắp bề mặt cơ thể do sự lắng đọng của muối canxi và các chất hữu cơ khác
nằm dưới dạng phức tạp do sự tương tác của protein và các chất không hòa tan.
5
Vỏ chia làm 4 lớp chính: Lớp biểu bì, lớp màu, lớp canxi, lớp không bị canxi hóa.
Lớp màu: Tính chất của lớp này do sự hiện diện những thể hình hạt của vật
chất mang màu giống dạng melanin. Chúng gồm những túi khí hoặc những không
bào. Một vài vùng xuất hiện những hệ thống rãnh thẳng đứng có phân nhánh, là con
đường cho canxi thẩm thấu vào và lớp này có chứa chitin.
Lớp biểu bì: Những nghiên cứu cho thấy lớp màng nhanh chóng bị biến đỏ
bởi Fucxin, có điểm pH = 5,1; không chứa chitin. Nó khác với các lớp vỏ còn lại,
bắt màu xanh với aniline xanh. Lớp biểu bì có lipid vì vậy nó cản trở tác động của
acid ở nhiệt độ thường hơn các lớp bên trong. Màu của lớp này thường vàng rất nhạt.
Lớp canxi hóa: Lớp này chiếm phần lớn lớp vỏ, thường có màu xanh trải
đều khắp và lớp có chứa chitin.
Lớp không bị canxi hóa: Vùng trong cùng của lớp vỏ được tạo bởi một
phần tương đối nhỏ so với tổng chiều dày bao gồm các phức chitin-protein bền
vững không có canxi và puinone.
1.1.2.2.Thành phần hóa học của đầu và vỏ tôm
Bảng 1.2. Thành phần hóa học cơ bản của vỏ tôm [5]
Đơn vị: (%)
Bộ phận Protein Chất béo

Chitin Tro Canxi Photpho

Đầu 53,5 8,9 11,1 22,6 7,2 1,69
Vỏ 28,8 0,4 27,2 31,7 11,1 3,16

Tỷ lệ các thành phần này không ổn định, chúng thay đổi theo giống, loài, đặc
điểm sinh thái, sinh lý…
 Thành phần:
- Protein
Protein đầu vỏ tôm phần lớn thuộc loại khó tiêu và khó trích ly, protein đầu
và vỏ tôm thường tồn tại ở 2 dạng chính là dạng tự do (có trong nội tạng và cơ gắn
với phần thân tôm) và dạng liên kết không hòa tan, thường liên kết với chitin hoặc
canxi cacbonat, lipid tạo thành lipoprotein, sắc tố tạo proteincarotenoid…như một
thể thống nhất quyết định tính bền vững của vỏ tôm.
6
- Enzyme
Trong đầu tôm chứa một lượng không nhỏ enzyme nội tại, đó là enzyme
protease. Nó tồn tại trong nội tạng nên chủ yếu nằm trong đầu tôm. Hoạt độ enzyme
protease của đầu tôm khoảng 6,5 đv hoạt độ/g tươi. Ngoài ra còn có enzyme
alkaline phosphatease, chitinase, N-acetyl glucosamidase, lipaza, tyrozinaza.
- Chitin
Tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và những hợp chất hữu cơ khác.
- Khoáng
Trong đầu tôm chứa một lượng muối vô cơ, chủ yếu là canxi cacbonat.
- Sắc tố
Sắc tố trong đầu tôm cũng như vỏ tôm chủ yếu là Astaxanthin. Chất này kết
hợp với protein một cách chặt chẽ. Nhờ liên kết này mà thành phần astaxanthin
trong vỏ được bảo vệ, khi liên kết này bị phá vỡ thì astaxanthin dễ dàng tách ra và
bị oxi hóa thành Astaxin.
1.2. TỔNG QUAN VỀ CHITIN [1]
1.2.1. Sự tồn tại của chitin trong tự nhiên.
Chitin là polysaccharide mạch thẳng, phổ biến trong tự nhiên chỉ sau
cellulose, chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Ở động vật thủy sản, chitin tồn tại
rất nhiều, nó là thành phần cấu trúc quan trọng của vỏ bao ở một số động vật không

xương sống như côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác (tôm, cua, ghẹ), giun tròn, chitin
được coi là chất tạo xương hữu cơ chính ở động vật không xương sống.
Trong thực vật: Chitin có trong vách tế bào của nấm và một số loại tảo
chlorophyceae. Vì vậy, chúng là nguồn nguyên liệu dồi dào để sản xuất Chitin-Chitosan.
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể. Nó có cấu trúc gồm nhiều phân
tử đường được nối với nhau bằng cầu nối hydro và tạo thành một hệ thống dạng sợi
ít nhiều có tổ chức. Trong tự nhiên rất ít gặp dạng tồn tại tự do của Chitin, nó liên
kết dưới dạng phức hợp chitin-protein, chitin với các hợp chất hữu cơ,…khi tồn tại
như thế chitin có sự đề kháng với các chất thủy phân, hóa học và enzyme. Do đó nó
gây khó khăn cho việc tách chiết và tinh chế. Tùy thuộc vào đặc tính của cơ thể và
7
sự thay đổi từng giai đoạn sinh lý mà trong cùng một loài, người ta có thể thấy sự
thay đổi về hàm lượng cũng như chất lượng của Chitin.
Trong tự nhiên, Chitosan rất hiếm gặp, chỉ có trong vách một số lớp vi nấm (đặc
biệt: zygomycetes, mucor,…) và ở vài loại côn trùng như ở thành bụng của mối chúa.
1.2.2. Cấu tạo-tính chất của chitin
1.2.2.1. Cấu tạo của chitin.
Chitin là một polysaccharide mạch thẳng, có cấu trúc tuyến tính gồm các đơn
vị N-acetyl-glucosamine nối với nhau nhờ cầu β-1,4glucoside. R:-NH-COCH
3

Công thức phân tử: ( C
8
H
13
O
5
N)
n

Phân tử lượng: M=(203.19)
n

Trong đó n phụ thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu:
Đối với tôm hùm: n=700-800
Đối với cua: n=500-600
Đối với tôm thẻ: n= 400-500
Công thức cấu tạo:

Hình 1.1. Cấu trúc của chitin
1.2.2.2. Tính chất của chitin
Chitin có màu trắng, không tan trong nước, trong kiềm, trong acid loãng và
các dung môi hữu cơ khác như ete, rượu. Chitin hòa tan được trong dung dịch đậm
đặc, nóng của muối thyoxyanat liti (LiSCN) và muối thyoxyanat canxi (Ca(SCN)
2
)
tạo thành dung dịch keo.
Chitin ổn định với chất oxy hóa như KMnO
4
, nước Javen, NaClO,…người
ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho Chitin.
8
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại ở bước sóng 884-890cm.
Chitin là một polysaccharide nguồn gốc tự nhiên, có hoạt tính sinh học cao,
có tính hòa hợp sinh học và tự phân hủy trên da. Chitin bị enzyme kháng khuẩn
lysozyme, một loại enzyme chỉ có ở cơ thể người, phân giải thành monomer N-
acetyl-D-glucosamine.
Chitin kết tinh ở dạng vô định hình, khó hòa tan trong dung dịch amoniac
(NH
3

), không hòa tan trong thuốc thử Schueizer-Sacrpamonia. Điều này có thể là do
sự thay đổi nhóm hydroxyl (OH) tại vị trí C
2
bằng nhóm acetamic (NHCOCH
3
) đã
ngăn cản sự tạo thành các phức hợp cần thiết.
Khi nung nóng chitin trong dung dịch NaOH đặc thì chitin sẽ bị khử mất gốc
acetyl tạo thành chitosan. Khi đun nóng chitin trong acid HCl đặc thì chitin sẽ bị
thủy phân tạo thành Glucosamine 85.5%, acid acetic 14,5%.
1.2.3. Ứng dụng của chitin - chitosan [1] [6] [7]
- Trong y học và mỹ phẩm
Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược độn, tá dược
chính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…làm chất
mang sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polymer tác dụng chậm kéo dài, làm hoạt
chất chính để chữa bệnh như: Thuốc điều trị liền vết thương, vết bỏng, vết mổ vô
trùng, thuốc bổ dưỡng cơ thể, hạ lipid và cholesterol trong máu, thuốc chữa bệnh
đau dạ dày, tiểu đường, xương khớp, viêm khớp, viêm xương, loãng xương, chống
đông tụ máu, kháng nấm, kháng khuẩn, điều trị suy giảm miễn dịch, có khả năng
hạn chế sự phát triển của tế bào u, tế bào ung thư, chống HIV.
Dùng làm vật liệu y học: Da nhân tạo, màng sinh học, chất nền cho da nhân
tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép.
Trong mỹ phẩm Chitosan được bổ sung vào kem chống khô da, kem lột mặt
để tăng độ bám dính, tăng độ hòa hợp sinh học với da, chống tia cực tím.
- Trong công nghệ thực phẩm [8]
Chitosan được xem như một phụ gia tạo độ cứng, tạo keo, phân lớp và khử
acid của trái cây và đồ uống, tăng cường mùi vị tự nhiên. Tạo màng để bao gói thực
phẩm, hoa quả, rau tươi. Là một polymer dùng an toàn cho người, lại có hoạt tính
sinh học đa dạng, chitosan được coi là thành phần bổ dưỡng đưa vào thực phẩm,
9

bánh kẹo, nước giải khát, thức ăn vật nuôi và thủy sản. Chitosan được sử dụng để
chống hiện tượng mất nước trong quá trình làm lạnh, làm đông thực phẩm.
- Ứng dụng trong nông nghiệp [1] [7]
Dùng bảo quản hạt giống, tăng cường khả năng nảy mầm của hạt, tác nhân
chống nấm, chống vi khuẩn gây bệnh cho môi trường xung quanh.
Ngoài ra, chitosan còn dùng làm chất kích thích sinh trưởng cây trồng, thuốc
chống bệnh đạo ôn, khô vằn cho lúa.
- Ứng dụng trong sinh học
Làm giá thể hoạt hóa cho công nghệ cố định enzyme và các tế bào vi sinh
vật, làm chất mang sử dụng trong sắc kí chọn lọc, màng lọc sinh học, tổng hợp
polymer sinh học.
- Ứng dụng trong các nghành công nghiệp khác
Trong công nghiệp dệt:
Chitosan được dùng để hồ vải: cố định hình in hoa, ưu điểm có thể thay thế
được hồ tinh bột bằng chitosan làm cho vải hoa, ti, sợi bền chịu được cọ sát, bề mặt
đẹp, bền trong kiềm.
Làm vải chịu nước, không bắt lửa: Hòa tan Chitosan trong dung dịch acid
acetic loãng cùng với axetat nhôm và acid stearic thu được hỗn hợp. Hỗn hợp này
đem sơn lên vải, khi khô tạo thành màng mỏng, chắc, bền, chịu nước và không bắt
lửa. Vải này được sử dụng để sản xuất đồ bảo hộ lao động.
Làm sợi chitin: Ngâm chitosan trong dung dịch Na
2
SO
4
bảo hòa rồi đem kéo
sợi, rửa trong nước ở nhiệt độ cao thu được giống sợi gai. Đem sợi này trộn với sợi
cellulose tỷ lệ 30% thu được sợi chitin-cellulose. Khả năng bắt màu thuốc nhuộm
càng tăng khi ta tăng hệ sợi chitin.
Trong công nghiệp giấy:
Chitosan có tác dụng làm tăng độ bền của giấy, chỉ cần thêm trọng lượng

bằng 1% trọng lượng của giấy thì sẽ làm tăng gấp đôi độ bên của giấy khi ẩm ướt,
tăng độ nét khi in. Các loại giấy này dùng làm giấy vệ sinh, giấy in, túi giấy.
Trong ngành phim ảnh:
Phim chitosan có độ nhớt rất cao, không tan trong nước, acid. Độ cứng được
cải thiện bằng cách tổng hợp đúc chitosan, rồi xử lý bằng dung dịch acid.
10
Ứng dụng trong mỹ phẩm:
Chitosan được ứng dụng trong sản xuất kem chống khô da, do bản chất
chitosan cố định dễ dàng trên biểu bì da bởi những nhóm NH
4
+
thường được các
nhà khoa học gắn với những chất giữ nước hoặc những chất lọc tia cực tím. Vì vậy,
chitosan là gạch nối giữa kem và da.
1.2.4. Các phương pháp sản xuất chitin [4][9]
Mặc dù chitin phân bố rộng rãi trong tự nhiên nhưng nó không được tìm thấy
ở dạng tinh khiết. Chitin ở trạng thái tự nhiên thì liên kết với protein, lipid, sắc tố và canxi.
Vì vậy, nó cần phải được làm sạch trước khi sử dụng cho bất kì mục đích
thương mại nào
Hiện nay việc làm sạch chitin bao gồm hai bước chính:
- Khử khoáng: Loại bỏ khoáng bằng acid hoặc một tác nhân tạo phức.
- Khử protein: Tách protein bằng kiềm hoặc một enzyme protease.
Phương pháp hóa học: Quá trình khử khoáng được thực hiện bằng việc
sử dụng HCl hoặc acid hữu cơ khác hoặc kết hợp cả hai ở nhiệt độ phòng với cơ chế
như sau:
CaCO
3
+ 2HCl = CaCl
2
+ CO

2
+ H
2
O
Ca
3
(PO4)
2
+ 6HCl = 3CaCl
2
+ 2H
3
PO
4

Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình này:
a. Nồng độ acid: Nồng độ acid quá thấp sẽ không khử được hết khoáng dẫn
đến sản phẩm còn nhiều tạp chất. Ngược lại, nồng độ quá cao sẽ gây đứt mạch
chitin, giảm chất lượng sản phẩm.
b. Tỷ lệ acid/nguyên liệu: Nếu tỷ lệ này quá thấp thì sẽ không khử hết
khoáng, nếu quá lớn sẽ ảnh hưởng xấu tới mạch, đồng thời tốn chi phí.
c. Nhiệt độ, thời gian xử lí: hai yếu tố này cũng rất quan trọng, ảnh hưởng
trực tiếp tới chất lượng của sản phẩm. Nếu thời gian xử lí dài và nhiệt độ cao thì sản
phẩm bị nát sẽ rất khó xử lí ở những công đoạn tiếp theo, đồng thời sẽ ảnh hưởng
tới độ nhớt của sản phẩm cuối cùng. Nếu nhiệt độ thấp và thời gian xử lí ngắn thì
khoáng sẽ không được loại triệt để.
11
Thông tường khi tiến hành ở nhiệt độ cao thì thời gian xử lí ngắn, ngược lại,
nếu có điều kiện thì tiến hành ở nhiệt độ thấp cùng với thời gian xử lí dài thì chất
lượng sản phẩm thu được sẽ cao hơn.

Phương pháp sinh học: Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc
sử dụng hệ enzyme có sẵn trong phế liệu tôm hoặc bổ sung enzyme nguồn gốc từ
thực vật (papain, bromelain…), động vật (nội tạng cá thu,cá ngừ, mực ống…), vi
sinh vật (protease từ nấm mốc và vi khuẩn) để thủy phân protein đầu tôm thành các
phần peptid, aminoacid và thu hồi chúng
Giống phương pháp sinh học, trải qua hai bước khử khoáng và khử protein
tuy nhiên khử khoáng có thể dùng phương pháp lên men lactic hoặc ủ xilo và công
đoạn khử protein không sử dụng hóa chất mà có thể sử dụng hệ vi khuẩn, nấm men
hoặc các enzyme để loại bỏ protein một cách triệt để. Phương pháp sinh học có thể
được thực hiện ở cả hai công đoạn hoặc kết hợp khử khoáng theo phương pháp hóa
học kết hợp khử protein theo phương pháp sinh học. [2]
Việc sử dụng phương pháp sinh học cũng gặp rất nhiều khó khăn như giá
thành sản phẩm cao tùy thuộc vào loại enzyme sử dụng, việc loại bỏ hoàn toàn
protein có thể đạt được bằng phương pháp hóa học nhưng không thể đạt được bằng
phương pháp sinh học. Vì vậy, người ta có thể kết hợp hai phương pháp này nhằm
khắc phục những nhược điểm của từng phương pháp.
Trong phương pháp sinh học thì thể tích chất thải không lớn, protein sau quá
trình thủy phân bằng enzyme có thể thu hồi làm bột dinh dưỡng, thức ăn cho gia
súc, gia cầm, các chất khác như lipid, các sắc tố cũng được thu hồi. Hơn nữa sẽ hạn
chế được việc xử lí môi trường. Vì vậy, muốn sản phẩm chitin có được sự đồng
nhất hơn về các đặc tính lý hóa thì chúng ta nên áp dụng phương pháp sử lý nhẹ hơn
như việc sử dụng enzyme.
1.2.5. Yêu cầu chất lượng sản phẩm chitin [18]
Tùy theo mục đích sử dụng và yêu cầu của khách hàng mà yêu cầu về chất
lượng của chitin cũng thay đổi.

12
Bảng 1.3. Yêu cầu chất lượng của chitin trong các lĩnh vực khác nhau
Hạng mục
Dùng trong công

nghiệp
Dùng trong y dược

Dùng trong thực
phẩm
Hình dạng bên
ngoài
Dạng vảy màu trắng
hoặc vàng nhạt
Dạng vảy màu trắng

Màu trắng tinh
Độ ẩm ≤10.0% ≤8.0% ≤10.0%
Độ tro 8 – 12% ≤2% <1%
Quy cách bao gói
Bao tải dệt chuẩn, trọng lượng tịnh 10 kg/bao hoặc đóng gói
theo yêu cầu khách hàng.
1.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE. [10]
1.3.1. Enzyme, phân loại enzyme.
Enzym là protein có hoạt tính xúc tác, có phân tử lượng từ 20 000 đển 1 000 000
dalton (có kích thước nhỏ nhất là Ribonucleaza 12 700 dalton). Enzym có
hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn. Nó có thể gấp hàng trăm, hàng ngàn, hàng triệu lần các
chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác. Enzym có thể thực hiện hoạt động xúc tác trong
điều kiện nhẹ nhàng, ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể, pH môi trường
gần pH sinh lý.
Enzym có tính đặc hiệu cơ chất cao, đó là khả năng lựa chọn cao đối với kiểu
phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác dụng
+ Đặc hiệu cơ chất tuyệt đối: enzyme chỉ xúc tác cho một kiểu liên kết nhất
định và đòi hỏi rất khắt khe các nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà enzyme tác dụng.
+ Đặc hiệu cơ chất tương đối: enzyme chọn một kiểu liên kết để xúc tác

nhưng đòi hỏi không quá khắt khe với nhóm nguyên tử xung quanh liên kết mà nó
tác dụng.
Do những đặc điểm trên, việc nghiên cứu và ứng dụng của enzym có ý nghĩa
rất to lớn về mặt lý thuyết cũng như về mặt thực tế áp dụng.
Phân loại enzyme: [15]
 Theo phân loại quốc tế các enzyme protease được chia thành 4 nhóm phụ:
 Aminopeptidase: Enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ
của mạch polypeptit.
13
 Cacboxypeptidase: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon
của mạch polypeptit.
 Dipeptihydrolase: Xúc tác sự thủy phân các dipeptit.
 Proteinaza: Xúc tác sự thủy phân liên kết peptit nối mạch.
 Theo Barett và Donald (1956), protease được phân ra thành 2 nhóm lớn là:
 Endopeptidase: Là các enzyme phân giải các liên kết nằm trong mạch
polypeptit. Chúng là những enzyme được sử dụng nhiều nhất để thủy phân protein
cho tính đặc hiệu rộng hơn và được phân thành bốn nhóm sau:
- Phân nhóm 1: Proteinase – serin là những protease mà trong trung tâm
hoạt động của nó có nhóm (-OH) của axit amin serin. Phân nhóm này gồm các
enzyme như: Trypsin, Chymotrypsin.
- Phân nhóm 2: Proteinase – xistein là protease mà trong trung tâm hoạt
động của nó có nhóm Thiol (-SH) của axit amin xistein. Nhóm này gồm các enzyme
Cathepsin.
- Phân nhóm 3: Proteinase – aspartic là những protease mà trong trung tâm
hoạt động của nó có nhóm cacboxyl (-COOH) của aspartic như enzyme Pepsin.
- Phân nhóm 4: Protease – kim loại. Đây là những protease mà trong trung
tâm hoạt động của nó có ion kim loại. Enzyme này hoạt động trong môi trường
trung tính. Ví dụ như Collagenase.
 Exopeptidase (peptidase): Là các enzyme không có khả năng thủy phân
liên kết peptid ngoài cùng của chuỗi polypeptide hoặc đầu amin, hoặc đầu cacboxyl

để lần lượt giải phóng ra các axit amin tự do ra khỏi chuỗi polypeptit. Vì vậy, chúng
còn được gọi là aminopeptidase hoặc cacboxypeptidase. Ngoài ra, những
exopeptidase còn có thể liên kết với các endopeptidase để thực hiện một sự thủy
phân phức tạp hơn.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành 3 nhóm:
- Protease acid: pH 2-4.
- Protease trung tính: pH 7-8.
- Protease kiềm: pH 9-11.
14
1.3.2. Nguồn thu nhận enzyme protease.[15]
a. Từ động vật: enzyme đuợc tách ra từ các mô như: tụy tạng, dạ dày, ruột
và nội tạng của một số loài thủy sản (mực, cá,…) thường là trypsin, pepsin,
chymotrypsin, cathepsin…
b. Từ thực vật: có thể thu nhận được papain từ đu đủ, bromelain từ thân, lá,
vỏ dứa.
c. Nguồn vi sinh vật
Enzyme Protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm mốc và xạ khuẩn…gồm
nhiều loại thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium, Streptomyces và
một số loại nấm men.
- Vi khuẩn: Lượng protease sản xuất từ vi khuẩn được ước tính vào khoảng
500 tấn. Chiếm khoảng 59% enzyme sử dụng. Protease của động vật hay thực vật
chỉ chứa một trong hai loại endopeptidase hoặc exopeptidase, riêng vi khuẩn có khả
năng sinh ra cả hai loại trên, do đó protease của vi khuẩn có tính đặc hiệu cơ chất
cao. Chúng có khả năng phân hủy tới 80% các liên kết peptide trong phân tử protein.
[4]
Trong các chủng vi khuẩn có khả năng tổng hợp mạnh protease là Bacillus subtilis,
B. mesentericus, B. thermorpoteoliticus và một số giống thuộc chi Clostridium.
Trong đó, B. subtilis có khả năng tổng hợp protease mạnh nhất ( Nguyễn Trọng Cẩn
và cộng sự, 1998). Các vi khuẩn thường tổng hợp các protease hoạt động thích hợp
trong vùng pH trung tính và kiềm yếu.

Có thể nói vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất
enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghệ và đời sống. Dùng nguồn vi sinh vật có
những lợi ích chính như sau:
 Chủ động về nguyên liệu nuôi cấy vi sinh vật và giống vi sinh vật.
 Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn: 16÷ 100 giờ nên có thể thu nhiều
lần quanh năm.
 Có thể điều khiển sinh tổng hợp enzyme dễ dàng theo hướng có lợi (định
hướng sử dụng và tăng hiệu suất tổng thu hồi).
 Giá thành tương đối thấp vì môi trường tương đối rẻ, đơn giản, dễ tổ chức
sản xuất.
15
Tuy nhiên trong mọi trường hợp cần lưu ý khả năng sinh độc tố (gây độc,
gây bệnh) để có biện pháp phòng ngừa, xử lý thích hợp. Để sản xuất chế phẩm
enzyme, người ta có thể phân lập các giống vi sinh vật có trong tự nhiên hoặc các
giống đột biến có lựa chọn theo hướng có lợi nhất, chỉ tổng hợp ưu thế một loại
enzyme nhất định cần thiết nào đó.
1.3.3. Cơ chế tác dụng của protease [15]
Enzyme là chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein có tính đặc hiệu
cao, nó có khả năng tương tác lên các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử
protein và cơ chất tương tự, làm cho các liên kết này bị suy yếu và dễ dàng bị đứt ra
khi có yếu tố nước tham gia. Thông thường enzyme tác dụng và chuyển hóa cơ chất
phải trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn 1: Enzyme kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu tạo thành phức
hợp enzyme – cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng
lượng thấp, các liên kết yếu tạo thành giữa enzyme và cơ chất trong phức hợp ES là
tương tác tĩnh điện, liên kết hydrogen, liên kết vandecvan.
Giai đoạn 2: Là giai đoạn tạo phức chất hoạt hóa xảy ra sự biến đổi cơ chất,
dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme làm
cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ
chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi.

Giai đoạn 3: Là giai đoạn tạo ra sản phẩm của phản ứng và enzyme được
giải phóng ra dưới dạng tự do như ban đầu .


Hình 1.2. Sơ đồ phản ứng thủy phân xúc tác bởi protease
Trong đó:
E: Kí hiệu cho enzyme
S: Kí hiệu cho cơ chất.
P và P+ biểu thị kết quả các peptid có kích thước khác nhau được tách ra.

E + S ES EP + H – P
+
E + P – OH + H – P
+

H
2
O

16
1.3.4. Hoạt độ enzyme [15]
Hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị enzyme/1mg protein
(UI/mg) cũng có thể 1g chế phẩm hoặc 1 ml dung dịch enzyme.
Công thức tính hoạt độ:


Trong đó:
a : nồng độ tyrosine ( µmol/ml)
b : độ pha loãng của dịch enzyme
c : thể tích của dịch thu được để đo

t : thời gian xảy ra phản ứng (phút)
1.3.5. Quá trình thủy phân protein bằng enzyme protease
1.3.5.1. Protein thủy phân [11][12]
Protein là một chuỗi polymer dài, bao gồm các nhóm amino gắn với nhau bởi
các liên peptid. Phản ứng liên quan tới việc phá vỡ chuỗi các nhóm amino này thành
các mạch, nhánh nhỏ hơn sử dụng nước được gọi là sự thủy phân protein.
Trong môi trường nước, sự thủy phân protein sẽ xảy ra như trong hình 1.3

Protease




Hình 1.3. Phản ứng thủy phân protein
Trong suốt quá trình phản ứng, liên kết peptid sẽ được tách ra do sự tấn công
nuclephilic bởi phân tử nước, tạo thành axit cacboxylic và amin. Nhóm cacboxyl và
nhóm amino tự do hình thành sau quá trình thủy phân sẽ nhiều hơn hay ít ion hóa
hơn, phụ thuộc vào pH của phản ứng thủy phân. Từ đây sẽ hình thành anion
RCOOH- và cation R-NH
3
+.
a*b*c
t
X =
– C – C – N – C – + H – O – H – C – C – OH + H – N – C
H O

H O H
H

R
1
H R
2
R
1
H R
2

Protein Nước Axit cacboxylic
17
Theo Alder – Nissen, thêm nước vào trong quá trình thủy phân protein có
liên quan đến sự tấn công nucleophilic, các nhóm amino tự do (-NH
2
) có thể cũng
hoạt động như nucleophilic phản ứng trực tiếp với protein để tách các liên kết
peptid. Phản ứng này cũng được xem như sự vận chuyển các peptid sinh ra anion
RCOOH
-
và cation R-NH
3
+
. Vì vậy trong quá trình thủy phân protein, các nhóm
amino tự do hình thành hỗ trợ cho sự phá vỡ, cắt mạch protein. Sự thủy phân
protein xảy ra rất chậm ở điều kiện bình thường như pH trung tính và nhiệt độ
phòng. Sử dụng enzyme sẽ thúc đẩy phản ứng thủy phân, dẫn tới việc cắt mạch
chuỗi peptid triệt để hơn, hình thành nhiều phân tử nhỏ hơn như amino axit.
Enzyme mà xúc tác cho phản ứng thủy phân protein là protease hay proteinase.
Quá trình thủy phân diễn ra như sau:

Enzyme enzyme enzyme
Protein polypeptide peptid axit amin

Do vậy, tùy thuộc vào mức độ thủy phân, thời gian thủy phân mà người ta có
thể thu được peptid hay axit amin.
Các đặc tính của protein thủy phân được đánh giá thông qua độ thủy phân và
cấu trúc của peptid tạo thành. Điều này phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein
và tính đặc hiệu của enzyme sử dụng, cũng như việc kiểm soát các thông số của quá
trình thủy phân như nhiệt độ, thời gian, pH… Giá trị dinh dưỡng của protein thường
được giữ nguyên hay tăng lên bởi enzyme thủy phân, khi mà tiến hành dưới các
điều kiện phản ứng nhẹ nhàng. Protein bị cắt mạch thành các đơn vị nhỏ hơn như
peptid hay acid amin.
Tỷ lệ giữa enzyme và cơ chất xác định tốc độ thủy phân, ban đầu tốc độ thủy
phân là cao nhất sau đó giảm dần theo thời gian. Phản ứng thủy phân tạm dừng khi
không còn nhiều liên kết peptid sẵn có cho enzyme. Độ thủy phân tối đa có thể đạt
được phụ thuộc vào tính chất tự nhiên của protein và đặc trưng của enzyme.