Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục

i

LỜI CẢM ƠN

Sau thời gian thực tập em đã hoàn thành đề tài “Nghiên cứu quy trình sản
xuất giấm ăn bằng vi sinh vật và ứng dụng phương pháp lên men liên tục”. Trong
thời gian nghiên cứu và thực tập tại phòng thí nghiệm, em đã nhận được sự giúp đỡ
tận tình của các thầy, cô trong khoa để em thực hiện đề tài này. Qua đây, em bày
tỏ lòng cảm ơn tới:
- Quý thầy, cô, cán bộ, công nhân viên chức trường Đại Học Nha Trang đã
trang bị truyền đạt kiến thức trong suốt khóa học.
- Lời cảm ơn chân thành tới giáo viên hướng dẫn, cô ThS. NGUYỄN THỊ
THANH HẢI đã giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt thời gian làm đồ án.
- Giáo viên hướng dẫn thực hành thí nghiệm phòng công nghệ thực phẩm, và
phòng thực hành hóa- vi sinh đã tạo điều kiện giúp đỡ trong quá trình làm các thí
nghiệm.
- Gia đình đã tại điều kiện cho em trong suốt thời gian học và cảm ơn tất cả
bạn bè luôn bên cạnh động viên, giúp đỡ trong suốt thời gian qua.

Tôi xin chân thành cảm ơn!


Nha trang, tháng 6 năm 2011
Sinh viên



Võ Thị Thu Hoài


ii

MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN i
MỤC LỤC ii
DANH MỤC CÁC HÌNH v
DANH MỤC CÁC BẢNG vii
CÁC KÍ HIỆU vii
LỜI MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Tổng quan về giấm 2
1.1.1 Khái niệm 2
1.1.2. Phân loại 2
1.1.3. Các phương pháp sản xuất acid acetic 2
1.1.4. Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới 4
1.2. Tổng quan về quá trình lên men 5
1.2.1. Khái quát chung 5
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men 6
1.3. Tổng quan quá trình lên men giấm 8
1.3.1. Bản chất của quá trình 8
1.3.2. Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn 9
1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm: 10
1.3.4. Các phương pháp lên men tạo axit axetic 12
1.3.5. Phương pháp nâng cao nồng độ acid acetic trong dịch lên men 15
1.3.6. Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong quá trình lên men 17
1.3.7 Thành phần hóa học của giấm nuôi 19
1.3.8. Một số hư hỏng giấm và nguyên nhân 20
1.4. Hệ VSV sử dụng trong lên men giấm 21
iii

1.4.1. Đặc điểm hình thái 21
1.4.2. Đặc điểm sinh trưởng 22
1.4.3. Một số vi khuẩn thường gặp trong lên men giấm 23
1.5. Một số ứng dụng của acid acetic 26
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Đối tượng nghiên cứu 28
2.1.1. Vi khuẩn acetobacter pasteurianum 28
2.1.2. Cơ chất 28
2.1.3. Thiết bị, dụng cụ thí nhgiệm 30
2.1.4. Bao bì thủy tinh 30
2.2. Phương pháp nghiên cứu 30
2.2.1. Nội dung nghiên cứu: 30
2.2.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm 31
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm xác định các thông số dịch lên men 33
2.3.1. Bố trí thí nghiêm xác định nồng độ rượu dịch lên men 33
2.3.2 Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ đường thích hợp 33
2.3.3 Bố trí thí nghiệm xác định pH thích hợp 34
2.4. Tiến hành nhân giống và xác định tỷ lệ bổ sung giống vi khuẩn acetobater
pasteurianum vào dịch lên men 35
2.4.1 Quy trình nhân giống dự kiến 35
2.4.2. Thuyết minh quy trình nhân giống thuần chủng 35
2.4.3. Bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vào dịch lên men 36
2.5. Bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men 37
2.6 . Nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục 38
2.6.1. Thiết bị lên men liên tục 38
2.6.2. Xác định thời gian tạo màng VSV trên chất mang 39
2.6.3. Xác định thông số quá trình lên men liên tục: 40
2.7. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng sản phẩm 42
2.5. Phương pháp phân tích đánh giá cảm quan, chất lượng sản phẩm 43

iv

2.5.1. Phương pháp đánh giá chất lượng cảm quan 43
2.5.2. Phương pháp xác định các chỉ tiêu hóa học 45
2.5.3. Phân tích các chỉ tiêu vi sinh của giấm ăn theo TCVN 45
2.5.4. Xử lý số liệu thực nghiệm, vẽ đồ thị biểu diễn quy luật biến đổi các thông
số 45
Chương 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 46
3.1. Kết quả nghiên cứu xác định thông số dịch lên men 46
3.1.1. Kết quả nghiên cứu xác định nồng độ rượu thích hợp 46
3.1.2. Kết quả xác định hàm lượng đường bổ sung vào dịch lên men 48
3.1.3. Kết quả thí nghiệm xác định pH dịch lên men thích hợp 50
3.2. Tiến hành nhân giống và kết quả thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung giống vi
khuẩn Acetobater pasteurianum vào dịch lên men 52
3.3. Kết quả thí nghiệm xác định thời gian lên men 54
3.4. Kết quả nghiên cứu quá trình lên men giấm bằng thiết bị lên men liên tục 56
3.4.1. Kết quả xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang 56
3.5. Kết quả TN xác đinh thời gian lên men liên tục 59
3.6. Kết quả xác định chế độ thanh trùng sản phẩm 61
3.7. Quy trình sản xuất hoàn thiện 63
3.8. Kết quả sản xuất thực nghiệm 65
3.9 Kết quả xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sản phẩm giấm 66
3.9.1 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan 66
3.9.2 Tiêu chuẩn hóa học 66
3.9.2 Tiêu chuẩn về vi sinh vật 66
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 67
TÀI LIỆU THAM KHẢO 69
PHỤ LỤC

v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong tế bào vi khuẩn. 9
Hình 1.2. Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh 17
Hình 1.3. Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy liên tục 19
Hình 1.4. Acetobacter pasteurianum 24
Hình 2.1. Công thức hóa học của đường saccarose 29
Hình 2.2. Sơ đồ quy trình dự kiến 31
Hình 2.3 Sơ đồ nhân giống thuần chủng 35
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 36
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian lên men 37
Hình 2.6. Thiết bị lên men liên tục…………………………………………………38
Hình 2.7. Sơ đồ bố trí xác định thời gian tạo màng VSV trên vật liệu chất mang 39
Hình 2.8. Sơ đồ bố trí xác định vận tốc dòng môi trường 41
Hình 2.9. Sơ đồ bố trí TN xác định thời gian lên men 42
Hình 2.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định chế độ thanh trùng 43
Hình 3.1. Hàm lượng acid, rượu dư của mẫu TN xác định nồng độ rượu thích hợp46
Hình 3.2 Điểm cảm quan các mẫu TN xác định nồng độ rượu dịch lên men 47
Hình 3.3. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định hàm lượng đường thích
hợp sau lên men 48
Hình 3.4. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định hàm lượng đường dịch lên men 49
Hình 3.5. Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư của các mẫu TN xác định pH dịch lên
men 50
Hình 3.6. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 51
Hình 3.7. Kết quả hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ
sung chủng VSV 52
Hình 3.8. Kết quả điểm cảm quan các mẫu TN xác định tỷ lệ bổ sung chủng VSV 53
Hình 3.9. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên men 54

vi

Hình 3.10. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 55
Bảng 3.17. Kết quả hàm lượng acid thu được các mẫu TN xác định thời gian tạo
màng VSV 56
Hình 3.11. Hàm lượng acid, rượu dư các mẫu TN xác định vận tốc dòng môi trường
57
Hình 3.12. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định pH dịch lên men 58
Hình 3.13. Hàm lượng acid, nồng độ rượu dư các mẫu TN xác định thời gian lên
men liên tục 59
Hình 3.14. Điểm cảm quan các mẫu TN xác định thời gian lên men liên tục 60
Hình 3.15. Điểm cảm quan xác định chế độ thanh trùng 61
Hình 3.9. Sơ đồ quy trình sản xuất sản phẩm hoàn chỉnh 63

vii

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.3. Khảo sát ảnh hưởng của pH tới quá trình lên men 33
Bảng 2.2. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến quá trình lên men 34
Bảng 2.1. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ rượu đến quá trình lên men 34
Bảng 2.4 Bảng đánh giá sản phẩm qua hệ số quan trọng 44
Bảng 2.5. Bảng cơ sở chấm điểm cảm quan các chỉ tiêu sản phẩm giấm 44
Bảng 3.1. Điểm cảm quan của hội đồng cảm quan của sảm phẩm 65
Bảng 3.2 Tiêu chuẩn chất lượng cảm quan sản phẩm giấm 66
Bảng 3.3. Chỉ tiêu hóa học sản phẩm giấm 66



CÁC KÍ HIỆU

TN: thí nghiệm
TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam
ĐCQ: Điểm cảm quan
h: giờ
tb: tế bào
VSV: vi sinh vật
NADP: nicotinamide adennine dinucleotide
NADPH
2
:nicotinamide adennine dinucleotide dihidro

1

LỜI MỞ ĐẦU

Từ xưa, giấm đã được sử dụng như một gia vị trong ẩm thực và ngày nay
giấm đã đuợc ứng dụng rộng rãi hơn trong đời sống. Nó không chỉ được sử dụng
nhiều trong công nghệ thực phẩm mà còn được ứng dụng nhiều trong ngành công
nghiệp nhẹ, y học và còn như một loại mỹ phẩm dành cho phái đẹp.
Trong quá trình lên men, rượu, đường bị oxy hóa không hoàn toàn tạo acid
acetic. Bên cạnh quá trình lên men tạo acid acetic còn có quá trình chuyển hóa các
thành phần khác trong môi trường tạo nên các sản phẩm phụ như các acid hữu cơ,
vitamin,…rất tốt cho sức khỏe. Các sản phẩm phụ này đã làm cho giấm lên men có
vị chua thanh, dịu ngọt, mà giấm hóa học không có được.
Nguyên liệu chính sản xuất giấm là rượu gạo, đường và có thể một số loại
trái cây. Trong sản xuất rượu gạo, rượu có nồng độ cồn thấp (rượu bào) hầu như
không có giá trị kinh tế. Để tận dụng nguyên liệu thừa này, từ lâu con người đã sử
dụng nó để lên men giấm phục vụ cho những bữa ăn gia đình. Tuy nhiên quá trình
sản xuất giấm vẫn còn ở quy mô nhỏ, hộ gia đình và bằng phương pháp thủ công.
Vì vậy tôi đề xuất “Nghiên cứu quy trình sản xuất giấm từ vi sinh vật và ứng dụng
phương pháp lên men liên tục” ở phòng thí nghiệm.
Do kiến thức bản thân còn hạn chế, bước đầu làm quen với công tác nghiên
cứu thực tế còn gặp nhiều khó khăn, cùng với thời gian thực hiện có hạn nên nội
dung không tránh khỏi những thiếu sót. Rất mong nhận được ý kiến đóng góp của
các thầy cô giáo và các bạn để nội dung đề tài được tốt hơn.
Tôi xin chân thành cảm ơn!



2

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về giấm [4]
1.1.1 Khái niệm: Giấm là dung dịch acetic loãng có nồng độ ≤8%.
1.1.2. Phân loại [9]
Tùy theo nguyên liệu sản xuất giấm mà người ta phân giấm ra 2 loại:
- Giấm gạo: Hay còn gọi là giấm cất, đó là quá trình sản xuất mà dùng lương
thực, ngũ quả, đường và rượu gạo làm nguyên liệu chính nhờ quá trình lên men của
vi khuẩn acetic. Loại giấm này có nhiều hương vị khác nhau, thành phần dinh
dưỡng cũng phong phú nhờ quá trình thủy phân các thành phần dinh dưỡng được
dùng chế biến thực phẩm và mục đích nội trợ.
- Giấm pha chế: Hay còn gọi là giấm hóa học được sản xuất dựa trên nguyên
liệu chính là acid acetic tinh luyện pha thêm nước mà thành, không có thêm thành
phần dinh dưỡng khác. Lọai này thường dùng trong công nghiệp luyện kim hoặc
sát khuẩn hoặc trong ngành công nghiệp nhẹ…
1.1.3. Các phương pháp sản xuất acid acetic [3]
Acid acetic là một loại acid hữu cơ được ứng dụng rộng rãi và từ lâu. Do đó,
loài người đã phát minh ra nhiều phương pháp khác nhau để sản xuất acid acetic.
Những phương pháp sản xuất cid acetic bao gồm:
 Phương pháp hóa gỗ.
 Phương pháp hóa học.
 Phương pháp sinh học.
 Phương pháp kết hợp.
a- Phương pháp hóa gỗ
Cùng với sự phát triển của ngành khai thác và chế biến gỗ loài người cũng đã
biết cách sản xuất acid acetic từ dạng nguyên liệu này.
3

Bằng cách chưng cất gỗ đã lên men, người ta thu được một hỗn hợp nhiều

chất khác nhau, trong đó acid acetic với hàm lượng rất lớn. Hiện nay phương pháp
này đã không còn được ứng dụng.
b- Phương pháp hóa học
Phương pháp này dựa trên quá trình oxy hóa axetaldehyd thành acid acetic,
có xúc tác của mangan rồi sau đó chưng cất phân đoạn ở nhiệt độ 50-80
o
C
Phản ứng oxy hóa xảy ra như sau:
CH≡ CH + H
2
O
CH
2
≡CH
2
+O
2
Hiện nay, người ta tổng hợp acid acetic từ methanol và CO bằng phản ứng
carbonyl hóa. Trong quy trình này, metanol và cacbon monoxit phản ứng với nhau
tạo ra acid acetic theo phương trình:
CH
3
OH + CO → CH
3
COOH

c- Phương pháp hỗn hợp
Trước tiên, người ta tiến hành quá trình oxy hóa hydrat cacbon có mạch
cacbon ngắn như propan hay butan để tạo thành acid acetal dehyt, formaldehyde
methanol và acetone.

Sau đó acetaldehyd được oxy hóa để tạo thành acid acetic.
Rồi người ta trung hòa khối thủy phân này và tiến hành lên men để thu nhận
được dung dịch chứa acid acetic.
d- Phương pháp sinh học: Hiện nay, người ta sản xuất acid acetic chủ yếu bằng
phương pháp lên men. So với những phương pháp khác thì phương pháp này có
nhiều ưu điểm:
a. Nguyên liệu để sản xuất acid acetic bằng phương pháp lên men rất dễ kiếm.
Có thể sử dụng nguyên liệu chứa đường (nước ép trái cây, nước trái dừa, nước ép
mía…) có thể sử dụng nguyên liệu chứa tinh bột và có thể sử dụng cồn công
nghiệp.
- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa tinh bột, phải qua 3 giai đoạn chuyển hóa.
CH
3
CHO CH
3
COOH
+O
2
4

Giai đoạn chuyển tinh bột thành đừờng. (đường hóa)
Giai đoạn chuyển đường thành cồn. (rượu hóa)
Giai đoạn chuyển rượu thành acid acetic.
- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa đường thì qua 2 giai đoạn.
Giai đoạn chuyển đường thành cồn.
Giai đoạn chuyển cồn thành acid acetic.
- Nếu sản xuất từ nguyên liệu chứa cồn thì chỉ cần tạo điều kiện thuận lợi để vi
khuẩn acid acetic chuyển cồn thành acid acetic.
b. Quá trình chuyển hóa hay quá trình lên men được thực hiện ở điều kiện rất
ôn hòa, không cần ở nhiệt độ cao, áp suất cao hay máy móc, thiết bị phức tạp.

Mặt khác, lên men theo phương pháp sinh học tạo ra một số sản phẩm phụ
làm cho hương vị sản phẩm rất đặc trưng.
1.1.4. Tình hình sản xuất giấm ở Việt Nam và các nước trên thế giới:
Công nghệ sản xuất giấm đã có từ lâu. Công nghệ sản xuất ban đầu chỉ mang
tính chất thủ công. Mãi cuối thế kỷ XIX và đầu thế kỷ XX công nghệ thủ công mới
được thay thế bằng công nghệ sản xuất theo quy mô công nghiệp.
a. Tình hình trên thế giới [1]
Các tài liệu nghiên cứu trước đây đã cho thấy giấm xuất hiện từ khoảng 5000
năm trước công nguyên , khi người Babilon đã sử dụng nước quả chà là để làm
rượu vang và giấm. Họ sử dụng nó như là một loại thực phẩm và dùng để bảo quản
hoặc làm tác nhân acid (để tẩy rửa). Các vết tích còn sót lại của giấm đã được tìm
thấy trong các cái vại của người Ai Cập cổ xưa có niên đại từ khoảng 3000 năm
trước công nguyên.
Tương tự, giấm được phát hiện ở Trung Quốc từ các tài liệu cổ ghi lại là
khoảng 1200 năm trước công nguyên.
Ở Ai Cập cổ đại khoảng 400 năm trước công nguyên , Hippocrates, cha đẻ của
ngành y học hiện đại , đã sớm biết công dụng của giấm táo kết hợp với mật ong để
chữa trị bệnh cúm bao gồm cả ho và cảm lạnh.
5

Từ thời kỳ phục hưng, làm giấm là nghề đem lại lợi nhuận ở Pháp. Nước này
đã sản xuất gần 150 loại giấm có mùi vị khác nhau từ việc bổ sung tiêu, cỏ ba lá,
hoa hồng, mâm xôi.
Sản xuất giấm cũng được phát triển ở Anh, sinh lời đến nỗi năm 1693 Nghị
viện thiết lập thuế trên giấm – bia.
Vào thời kỳ đầu ở Mỹ, sản xuất giấm rượu táo là nền tảng của nông nghiệp và
kinh tế hộ gia đình, được đánh giá là gấp 3 lần rượu táo thô truyền thống. Ngày nay
thì sản xuất giấm đã phát triển mạnh và sản xuất với quy mô công nghiệp. Hàng
năm sản xuất hàng triệu lít giấm để cung cấp cho nhu cầu sử dụng của con người.
Chiếm thị trường phần lớn tại Đức là dòng giấm làm từ rượu chưng cất. Đó là

loại giấm công nghiệp, làm từ gỗ cặn bã. Một sản phẩm không có chút hương
thơm, thêm vào đó còn được nhuộm màu, thêm chút muối hoặc có trộn lẫn chút
dấm làm từ rượu nho thật để tăng thêm hương vị.
b. Tình hình trong nước
Quá trình sản xuất giấm ở Việt Nam vẫn ở quy mô nhỏ lẻ theo từng hộ gia
đình bằng phương pháp thủ công. Sản phẩm tạo ra chỉ để mục đích sử dụng trong
gia đình mà chưa có sản phẩm trên thị trường nhiều. Tùy vào mùa vụ mà người ta
có thể tạo giấm từ xoài, chuối hay từ hồng xiêm…nhu cầu sử dụng ngày càng
nhiều trong khi đó việc sản xuất acid hữu cơ bằng công nghệ lên men không đủ đáp
ứng những nhu cầu trên.
Hiện nay, đã có một số doanh nghiệp nhỏ lẻ sản xuất giấm bán ra trên thị
trường nhưng chất lượng và số lượng chưa ổn định. Hoặc có một số doanh nghiệp
đã dùng giấm được pha chế từ axit vô cơ để bán ra trên thị trường (doanh nghiệp
giấm ăn Trung Thành số 2, Lĩnh Nam, Q.Hoàng Mai, Hà Nội).
1.2. Tổng quan về quá trình lên men
1.2.1. Khái quát chung [5]
1.2.1.1. Khái niệm chung
- Sự lên men theo nghĩa rộng là quá trình trao đổi chất, qua đó các chất hữu cơ
mà trước tiên là đường bị biến đổi dưới tác dụng của các enzyme của vi sinh vật.
6

Dựa vào cơ chế của quá trình lên men có thể chia ra: lên men yếm khí và lên men
hiếu khí. Lên men yếm khí là quá trình phân giải bằng enzyme các hợp chất hữu cơ
phức tạp thành các hợp chất đơn giản mà không có sự tham gia của oxy phân tử. Ví
dụ lên men rượu, lên men axetonbutylic, lên men lactic… Lên men hiếu khí cũng
là quá trình phân giải đường thành các hợp chất đơn giản nhưng cần phải có oxy tự
do. Ví dụ lên men axetic, lên men xitric.
- Trong sản xuất lên men, người ta dùng các vi sinh vật khác nhau như nấm
mốc, nấm men, vi khuẩn.
- Các sản phẩm thu được của các quá trình lên men cũng khác nhau và rất đa

dạng. Dựa vào tính chất của các sản phẩm lên men người ta chia ra: công nghiệp
lên men cổ điển và công nghiệp lên men hiện đại.
- Công nghiệp lên men cổ điển là những ngành lên men qua đó người ta thu
được những sản phẩm có phân tử lượng nhỏ hơn chất “khởi thủy” trong nguyên
liệu. Một đặc điểm nữa là có thể thay thế bằng phương pháp hóa học. Ví dụ sản
xuất rượu, sản xuất lactic, axit axetic…
- Công nghệ lên men hiện đại là các sản phẩm thu được phức tạp hơn, khác xa
về bản chất của các chất “khởi thủy” ban đầu trong nguyên liệu và không thể thay
thế bằng phương pháp hóa học. Ví dụ như sản xuất vitamin, kháng sinh…
1.2.1.2. Bản chất của các quá trình lên men
- Lên men thực chất là quá trình oxy hóa – khử sinh học (có sự tham gia của
enzyme xúc tác) để thu năng lượng và các hợp chất trung gian cho tế bào vi sinh
vật hoạt động.
- Lên men là quá trình để thu năng lượng, qua đó hydro tách ra khỏi cơ chất
được chuyển đến chất tiếp nhận cuối cùng là chất hữu cơ. Hợp chất hữu cơ được
khử đi vào môi trường dinh dưỡng và tích tụ lại trong đó. Tùy thuộc vào sản phẩm
cuối cùng được tích tụ chiếm ưu thế hoặc sản phẩm nào đặc trưng mà người ta
phân ra lên men rượu, lên men lactic hay lên men butilic,…
1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men [5]
1.2.2.1. Các cấu tử của môi trường
7

a. Nguồn gluxit
Một trong những thành phần chủ yếu của quá trình lên men đó là gluxit. Nó
không những là nguồn cung cấp năng lượng mà còn là nguồn cung cấp vật liệu xây
dựng cần thiết để sinh tổng hợp các cấu tử cần thiết của tế bào. Trong điều kiện thí
nghiệm các chất này có thể cho vào hợp chất thuần khiết đặc biệt là glucose. Trong
công nghiệp thì đa dạng hơn.
b. Phosphat vô cơ
Phosphat có vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của hệ

thống sinh học.
c. Nitơ
Nitơ là hợp phần quan trọng protein, axit nucleic và phần lớn các hợp chất
phức tạp của chất sống. Nhiều vi sinh vật có thể đồng hóa nitơ dưới dạng ion
amoni, một số dưới dạng nitrat, …
d. Các nguyên tố vi lượng
Ngoài các nguyên tố trên, các nguyên tố vi lượng cũng rất cần thiết. Các
nguyên tố vi lượng có thể hiệu quả ở nồng độ cực kỳ nhỏ.  - analin có hiệu quả
khi nồng độ là 1:10
8
.
Các nguyên tố vi lượng cũng như các chất khác ở dạng vết là những yếu tố
sinh trưởng thường chứa trong các nguyên liệu ban đầu khi dùng để chuẩn bị các
cơ chất hay được chúng ta bổ sung vào trong quá trình lên men.
e. Vitamin
1.2.2.2 Các nhân tố bên ngoài
a. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng tới quá trình trao đổi chất của vi sinh vật. Do đó người
ta sử dụng nhân tố này để điều chỉnh quá trình lên men. Nhiệt độ có vai trò thực sự
đến một số khía cạnh khác của quá trình sinh tổng hợp như: chất lượng sản phẩm
tạo thành, vận tốc tạo thành và giải phóng sản phẩm…
b. Ảnh hưởng của pH
8

Các vi sinh vật có vận tốc sinh trưởng cực đại trong một khoảng pH nhất định
và có thể bị chết hoặc vô hoạt ở pH giới hạn. Các vi sinh vật khác nhau tồn tại ở
những pH tối ưu khác nhau. Vì vậy cần dựa vào từng loại vi sinh vật mà điều chỉnh
pH thích hợp cho loại vi sinh vật đó.
c. Ảnh hưởng của hàm lượng O
2

Tùy vào bản chất của quá trình lên men hiếu khí hay lên men kỵ khí mà ta
cung cấp lượng oxy cho phù hợp. Có những quá trình lên men cần cung cấp oxy
trong suốt quá trình lên men (lên men axetic), hay chỉ cần cung cấp oxy trong giai
đoạn đầu của quá trình lên men (lên men rượu), hay không cần cung cấp oxy trong
suốt quá trình lên men.
d. Các yếu tố khác
Tùy thuộc mỗi quá trình lên men khác nhau nên sẽ có các yếu tố ảnh hưởng
khác nhau, như điều kiện để yên hay khuấy đảo khác nhau sẽ có những ảnh hưởng
khác nhau tới quá trình các quá trình lên men khác nhau.
1.3. Tổng quan quá trình lên men giấm
1.3.1. Bản chất của quá trình [5]
Lên men giấm là quá trình oxy hóa không hoàn toàn trong đó etanol bị oxy
hóa tạo thành acid acetic trong điều kiện hiếu khí nhờ enzyme oxy hóa của vi
khuẩn acetic. Đồng thời, hidro được vận chuyển nhờ sự xuất hiện của NADP tạo
thành NADPH
2
và được chuyển qua chuỗi hô hấp để sinh năng lượng. Tuy nhiên,
cơ chất không bị oxy hóa hoàn toàn nên được gọi là quá trình oxy hóa không hòan
toàn.
Tất cả các hoạt động sống đều cần phải có năng lượng để thực hiện các hoạt
động sống, sinh trưởng phát triển. Quá trình lên men giấm là quá trình oxy hóa
không hoàn toàn sinh năng lượng và tổng hợp các hợp chất trung gian cho VSV
hoạt động.
Các rượu khác nhau, đường và một số axit cũng có thể bị vi khuẩn axetic oxy
hóa. Chẳng hạn nó có thể oxy hóa rượu butylic thành axit butyric, rượu propylic
thành axit propionic, glixerin thành dioxyaxeton…
9

1.3.2. Cơ chế tạo axit axetic trong tế bào vi khuẩn [5]
Phản ứng tạo axit axetic xảy ra trong tế bào của vi khuẩn. Muốn phản ứng
xảy ra thì đường, C
2
H
5
OH và O
2
phải được thẩm thấu vào trong tế bào. Khi đó các
enzyme oxy hóa có trong tế bào của vi khuẩn tham gia oxy hóa rượu tạo thành
CH
3
COOH. CH
3
COOH được tạo thành sẽ thoát ra khỏi tế bào và tan vô hạn trong
dung dịch của môi trường.
Phương trình phản ứng tổng quát của sự lên men giấm:

C
2
H
5
OH + O
2
 CH
3
COOH + H
2
O + 117 Kcal

Hình 1.1. Quá trình oxy hóa rượu thành acid acetic trong tế bào vi khuẩn.

Tùy vào nguyên liệu ban đầu mà quá trình lên men giấm mà có thể xảy ra theo
sơ đồ:

Tinh bột đường đường rượu acid acetic

Sau khi tạo thành rượu tiếp tục thực hiện quá trình lên men giấm, là quá trình
oxy hóa tuần tự etanol → axetaldehyde → acid acetic. Đầu tiên từ ruợu etylic tạo
Ethanol
C
2
H
5
OH

O
2

CH
3
COOH

CH
3
COOH
Môi trường

Tế bào
Đư
ờng

Lên men

Đường hóa
Rư
ợu hóa

Rư
ợu hóa

10

thành axetaldehyde rồi được chuyển thành hydrat của axetaldehyde và sau cùng
hydrat axetaldehyde bị oxy hóa thành acid acetic

CH
3
CH
2
OH + 12 O
2
→CH
3
CHO + H
2
O
Rượu etylic axetaldehyde

CH
3
CHO + H
2
O → CH
3
CH(OH)
2
Hydrat axetaldehyde
Hai nguyên tử hydro trong phân tử hydrat – axetaldehyde đuợc hoạt hóa rồi
kết hợp với oxy là chất tiếp nhận hidro:
CH
3
CH(OH)
2
+ 12 O
2
→ CH
3
COOH + H
2
O
Hydrat axetaldehyde acid acetic
Quá trình lên men giấm sẽ kết thúc khi hàm lượng acid acetic đạt yêu cầu.
Điều lưu ý là, trong môi trường lên men hết rượu, vi khuẩn acetic sẽ tham gia
quá trình oxy hóa axit axetic thành CO
2
và H
2

O để nhận năng lượng dùng cho quá
trình sinh trưởng và phát triển của chúng.
CH
3
COOH + 2O
2
CO
2
+ H
2
O
Chính vì thế, sau khi lên men, bao giờ người ta cũng để lại một lượng etanol
khoảng 0,3 – 0,5 % để vi khuẩn có thể sử dụng cồn mà không sử dụng acid acetic
như một nguồn năng lượng.

1.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men giấm:
1.3.3.1. Chủng vi sinh vật
Chủng VSV có ảnh hưởng rất lớn tới quá trình lên men. Hoạt lực của VSV
trong quá trình lên men quyết định tới hiệu suất chuyển hóa các chất tạo ra sản
phẩm. Vì vậy, để quá trình lên men giấm đạt hiệu quả cao yêu cầu chủng VSV sử
dụng trong quá trình lên men đáp ứng một số yêu cầu:
1. Chủng có khả năng chuyển hóa ethylic tốt và tạo acid acetic với hiệu suất cao.
2. Chủng có khả năng chịu được độ cồn và acid cao.
Vi khu
ẩn

Vi khu
ẩn

11

3. Các tính chất ban đầu được giữ nguyên trong suốt quá trình lên men.
4. Các điều kiện phân lập, nuôi cấy, bảo quản giống đơn giản không tốn kém nhiều
phù hợp với điều kiện Việt Nam.

1.3.3.2. Ảnh hưởng của sự thoáng khí [4]
Sự chuyển hóa etanol thành axit axetic do phản ứng oxy hóa trong đó oxy khí
quyển là chất tiếp nhận hydro. Do vậy, trong sản xuất sự oxy hóa rượu chỉ xảy ra
trong trường hợp nếu vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với oxy không khí. Trong điều
kiện yếm khí thì vi khuẩn lên men giấm sẽ sử dụng cơ chất dinh dưỡng mà không
tạo thành axit axetic. Như vậy, chế độ cung cấp oxy là nhân tố điều chỉnh quá trình
lên men.
1.3.3.3. Ảnh hưởng nhiệt độ
Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp cho chúng là từ 25-32
o
C.
Nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm, nhiệt độ cao ức chế hoạt động và đến
mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất của vi khuẩn
và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acetic và etylic. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình sản xuất giấm 22-35
o
C, nhiệt độ tối ưu là 23-27
o
C.
1.3.3.4. Ảnh hưởng nồng độ etylic trong dịch lên men [4]
Etylic được sử dụng như là cơ chất chủ yếu của quá trình lên men giấm với
hàm lượng thích hợp là 5-12% thể tích.
Nồng độ rượu quá cao sẽ ức chế hoạt động của hệ vi khuẩn dẫn tới làm
giảm hiệu suất lên men.
Khi không có etylic để làm cơ chất vi khuẩn acetic lại sử dụng acid acetic

trong môi trường để tiếp tục oxy hóa tạo năng lượng cung cấp cho hoạt động của
chúng, vì vậy làm cho hàm lượng acetic giảm đi. Để tránh hiện tượng oxy hoá tiếp
tục acid acetic thành CO
2
và H
2
O thì cần có 1 lượng rượu còn lại trong sản phẩm
khoảng 0.3-0.5% so với yêu cầu.


12

1.3.3.5. Ảnh hưởng của nồng độ acetic và pH [4]
Trong sản xuất giấm người ta thường cho vào cơ chất ban đầu 1 lượng acid
acetic nhất định để axit hóa môi trường nhằm:
 Ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật các loại
 Đưa về pH thích hợp cho vi khuẩn hoạt động.
Môi trường pH= 3 là thích hợp nhất cho vi khuẩn acetic. Khi nồng độ acetic
tăng dần làm cho pH giảm sẽ hạn chế hoạt động của vi khuẩn.
Nồng độ acid ban đầu khoảng 2-6%. Hàm lượng cao hạn chế sự sinh trưởng
của vi khuẩn và giảm khả năng lên men. Nồng độ acid acetic 8% ức chế hoạt động
của vi khuẩn rất lớn. Nồng độ 12-14% thì vi khuẩn ngừng hoạt động.

1.3.3.6. Các chất C, N, P và nguyên tố vi lượng [8]
Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh trong dịch lên men cần bổ sung 1 số muối
khoáng (NH
4
)
2
SO

4
, KH
2
PO4, CaHPO
4
, FeCl
3
… tùy theo nhu cầu cụ thể từng loài.
Các chất này cung cấp năng lượng cho sự phát triển của tế bào và giữ vai trò
như những khối xây dựng nên tế bào VSV.
Ngoài ra trong môi trường dinh dưỡng còn được bổ sung vitamin, chất kích
thích sinh trưởng như pepton, cao nấm men…

1.3.4. Các phương pháp lên men tạo axit axetic [3]
Bản chất của quá trình lên men là hiếu khí,vì thế phải tạo điều kiện tối đa để
vi khuẩn tiếp xúc với oxy và cơ chất.
Để giải quyết tối đa vấn đề này, người ta đã đưa ra 4 phương pháp khác nhau:
Phương pháp lên men chậm
Phương pháp lên men nhanh
Phương pháp lên men chìm
Phương pháp lên men kết hợp


13

1.3.4.1. Phương pháp lên men chậm
Phương pháp này được người Pháp thực hiện từ rất lâu và được coi như là
phương pháp truyền thống của người Pháp.
Nguyên liệu dùng để sản xuất acid acetic là nước nho. Giống vi khuẩn axetic
được sử dụng cho quá trình sản xuất là Acetobacter orleaneuse.

Người ta thường cho vào thùng lên men bằng gỗ có dung tích 250-300 lít
bằng gỗ sồi hình tank trống 1/5 thể tích lượng acid acetic và sau đó cho vào thùng
dung dịch nước ép nho sao cho toàn bộ khối lượng đạt ½ thể tích thùng lên men (
hoặc 2/3 thể tích thùng lên men). Sở dĩ người ta cho acid acetic trước để tạo điều
kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển,
tránh bị nhiễm.
Tiến hành quá trình lên men ở nhiệt độ thường. Sau một thời gian, trên bề mặt
sẽ tạo thành váng chứa nhiều vi khuẩn acetic và có sự tích lũy acid acetic trong
dịch lên men. Vì thế mà quá trình oxy hóa xảy ra chậm và kéo dài rồi kết thúc sau
vài tuần sau đó. Sau khi họ kiểm tra hàm lượng acit đạt tiêu chuẩn, chỉ tiêu cảm
quan rồi kết thúc quá trình lên men giấm, họ lấy giấm ra, cho dịch dinh dưỡng mới
vào. Nếu để lâu, chất lượng giấm bị giảm nhanh do quá trình oxy hóa giấm xảy ra
tiếp tục. Giấm thu đuợc thường có hàm lượng axit 5-6%. Muốn để lâu phải đem
thanh trùng Pasteur.
1.3.4.2. Phương pháp lên men nhanh
Phương pháp này do người Đức thực hiện theo qui mô công nghiệp đã khắc
phục được những nhược điểm của phương pháp lên men chậm của người Pháp.
Thiết bị lên men là một thùng gỗ cao 2,5-6m, có đường kính 1,2 - 3m. Tỷ lệ
đường kính đáy so với chiều cao khoảng ½ là thích hợp nhất. Trong thùng được
chất đầy phoi bào hay lõi bắp. Phoi bào hay lõi bắp được xem như chất mang, giữ
vi sinh vật trong quá trình lên men, nhờ đó mà vi sinh vật không đi theo vào sản
phẩm cuối cùng. Ngoài ra, ở đáy thiết bị, người ta cho lắp một hệ thống phân phối,
không khí đưa từ dưới lên. Môi trường được đưa vào từ trên xuống.
14

Đầu tiên, người ta dùng acid acetic có nồng độ 3-5% chảy qua lớp phoi bào
hay lõi bắp để vừa có mục đích thanh trùng vừa có tác dụng acit hóa vật liệu chất
mang để vi sinh vật giống dễ thích nghi trong quá trình lên men. Sau đó, dùng nước
vô trùng rửa qua và nạp giống vi khuẩn acetic vào. Vi khuẩn acetic sẽ bám vào
phoi bào hay lõi bắp. Tiếp đó người ta cho dòng môi trường từ trên xuống qua hệ

thống phân phối như một vòi hoa sen trong buồng tắm. Môi trường sẽ được phân
phối đều khắp vật liệu phoi bào hay lõi bắp. Cùng lúc, người ta thổi khí từ dưới lên.
Môi trường được đưa từ trên xuống, chảy qua lớp chất mang có chứa các tế
bào vi khuẩn. Cồn sẽ thẩm thấu vào tế bào vi khuẩn, không khí được đưa từ dưới
đáy thiết bị lên trên, thẩm thấu vào trong tế bào vi khuẩn. Vi khuẩn tiến hành quá
trình oxy hóa rượu thành CH
3
COOH sẽ thẩm thấu qua màng tế bào ra ngoài và
theo dung dịch xuống đáy thiết bị lên men. Người ta thu nhận từ đáy thiết bị lên
men.
Quá trình lên men được thực hiện ở nhiệt độ 24-37
o
C. Trong trường hợp dịch
lên men cuối cùng chứa lượng acid acetic thấp, người ta tiến hành tái lên men bằng
cách bơm chúng ngược lại từ trên xuống.
Ưu điểm: Thời gian lên men nhanh
Thiết bị đơn giản và không cần nhiều thiết bị cho quá trình lên men.
Hàm lượng axit axetic cao (8 – 10%).
Nhược điểm: vì quá trình thổi không khí từ dưới lên nên xảy ra quá trình
bay hơi C
2
H
5
OH hoặc CH
3
COOH.
Ngoài ra còn có những phương pháp lên men nhanh khác:
+ Phương pháp nhúng: người ta thiết kế thùng lên men hình trụ, bên trong lắp
nhiều giỏ chứa đầy chất mang( mạt cưa, lõi bắp, than củi hay các vật liệu cellulose
có khả năng giữ vi sinh vật trên đó). Các giỏ này có thể nâng lên hoặc hạ xuống

được.
Người ta chuẩn bị môi trường và đổ môi trường váo thùng lên men. Vi sinh
vật sẽ được làm bám dính vào các vật liệu đựng trong giỏ. Giỏ chứa vật liệu có vi
sinh vật sẽ được nhúng xuống dung dịch lên men rồi lại nhấc chúng lên khỏi dung
15

dịch. Khi chiếc giỏ chứa chất mang có vi sinh vật thấm đầy môi trường và được
nhấc lên không khí, quá trình oxy hóa rượu được xảy ra. Thao tác này được lặp đi
lặp lại nhiều lần sẽ có tác dụng oxy hóa hết lượng cồn có trong dung dịch.
Ưu điểm: Dễ thực hiện,thiết bị đơn giản, lên men nhanh.
Nhược điểm: Năng suất thấp, dễ bị nhiễm vi sinh vật lạ.
+ Phương pháp hình trống quay: người ta thiết kế thiết bị lên men có hình trụ
nằm ngang bên trong một thùng chứa dung dịch lên men hở nắp. Thiết bị hình trụ
này được bọc một lớp vật liệu có khả năng thấm nước và có khả năng giữ vi sinh
vật. Một nửa thiết bị này nằm trong lòng dung dịch lên men, một nửa nằm trên
dung dịch lên men và được tiếp xúc với không khí. Khi vận hành, một nửa thiết bị
luôn luôn được tiếp xúc với không khí. Người ta thiết kế hệ thống quay này với vận
tốc rất chậm để đủ thời gian cho quá trình oxy hóa cồn thành acid acetic.
Ưu điểm: Đơn giản, dễ vận hành.
Nhược điểm lớn nhất là thời gian lên men kéo dài và hiệu suất oxy hóa không
cao.
1.3.4.3. Phương pháp lên men chìm
Người ta thiết kế hệ thống lên men acetic được gọi là acetator. Người ta cho
dung dịch lên men vào thiết bị và tiến hành thổi khí rất mạnh. Khi đó trong dung
dịch lên men sẽ tạo ra thể huyền phù và dung dịch lên men. Hai thể này luôn luôn
được trộn lẫn nhau và như vậy, quá trình oxy hóa xảy ra rất mãnh liệt.
1.3.4.4. Phương pháp kết hợp
Người ta thiết kế hệ thống lên men bao gồm hai phần: phần trên là lớp đệm
hay lớp chất mang chứa vi sinh vật ( giống phương pháp nhanh), lớp giữa chỉ là
một thùng chứa dung dịch sau khi lên men ở phần trên chảy xuống. Dưới cùng là

hệ thống thổi khí mạnh, khí sẽ được thổi qua phần dung dịch này rồi chuyển ngược
lên phần trên( giống thiết bị lên men chìm).
Ưu điểm: hiệu suất lên men cao, nồng độ acid acetic thu được trong khoảng 10
– 13%.
1.3.5. Phương pháp nâng cao nồng độ acid acetic trong dịch lên men [3]
16

Hàm lượng acid acetic có trong dịch lên men thường không cao, trong
khoảng 5-10%. Acid acetic có trong dịch lên men thường lẫn với các chất khác, do
đó, dịch sau lên men chỉ có thể sử dụng để chế biến thực phẩm. Trong nhiều
nghành cần sử dụng acid acetic, người ta yêu cầu hàm lượng acid acetic trong dung
dịch phải cao và có độ tinh khiết. Chính vì thế việc nâng cao hàm lượng acid acetic
trong dung dịch lên men và làm sạch acid acetic là việc làm rất cần thiết.
Những phương pháp để nâng cao hàm lượng và tinh chế acid acetic
1.3.5.1. Phương pháp chưng cất
Mục đích sử dụng phương pháp này để nhận acid acetic có hàm lượng cao
hơn. Phương pháp này rất đơn giản và dễ thực hiện. Tuy nhiên, phương pháp này
thường tiêu hao nhiều năng lượng và hàm lượng acid acetic thường không cao.
1.3.5.2. Phương pháp chưng cất bằng muối:
Người ta sử dụng một cấu tử có khả năng phân ly mạnh làm thay đổi trạng
thái cân bằng lỏng-hơi. Trong chưng cất có sự tham gia của muối CaCl
2
hoặc
CH
3
COONa, hiệu suất thu nhận acid acetic thường rất cao.
Phương pháp này có ưu điểm:
 Tốn ít năng lượng.
 Sản phẩm đạt độ tinh khiết cao.
Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những nhược điểm:

 Phải hoàn nguyên cấu tử phân ly nên tốn thiết bị và năng lượng cho quá
trình này.
 Gây ăn mòn thiết bị.
1.3.5.3. Phương pháp chưng cất- trích ly:
Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở những cấu tử phân ly có độ bay
hơi nhỏ hơn cấu tử đã có trong hỗn hợp. Cấu tử phân ly này sẽ kết hợp với một cấu
tử có trong dung dịch tạo ra một hỗn hợp khó bay hơi và thoát ra ở dưới đáy tháp
chưng cất. Cấu tử phân ly cần có tính chất hòa tan chọn lọc và không được hòa tan
cấu tử cần tách. Đặc điểm của phương pháp này như sau:
17

- Sử dụng một cấu tử trung gian để làm thay đổi độ bay hơi tương đối của các cấu
tử trong hỗn hợp.
- Người ta thường thu hồi cấu tử phân ly để sử dụng lại.
- Các cấu tử phân ly có tính chọn lọc cao, nên trong quá trình chưng cất cần chọn
đúng chất phân ly.
1.3.5.4. Phương pháp chưng cất chân không:
Phương pháp này rất phức tạp. Tuy nhiên, phương pháp này có ưu điểm là thu
nhận được sản phẩm có chất lượng.

1.3.6. Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong quá trình lên men
1.3.6.1. Sự sinh trưởng và phát triển của VSV trong điều kiện nuôi cấy tĩnh [8]
Sự phát triển của quần thể VSV xảy ra theo các giai đoạn tách biệt gọi là
đường cong phát triển quần thể. Trong hệ thống nuôi cấy tĩnh, đường cong phát
triển chia làm 4 phase: phase lag, phase mũ (phase log), phase ổn định và pha tử
vong.

Hình 1.2. Đường cong sinh trưởng trong điều kiện nuôi cấy tĩnh
a. Pha tiềm phát (Pha Lag)
Đây là thời gian tính từ khi VK được cấy vào môi trường cho đến khi chúng
bắt đầu sinh trưởng. Trong pha này VK phải thích ứng với môi trường mới, chúng
18

tổng hợp mạnh mẽ các enzim trong điều kiện mới và chuẩn bị cho sự phân bào.
Trong giai đoạn này không có sự gia tăng số lượng tế bào.
Chiều dài phase lag tùy thuộc vào trang thái sinh lý của hệ VSV với thành
phần dinh dưỡng của môi trường. Thành phần dinh dưỡng càng khác xa so với môi
trường nhân giống thì phase lag càng kéo dài.
b. Pha lũy thừa (Pha Log)
Trong pha này, vi khuẩn bắt đầu phân chia, số lượng TB tăng theo lũy thừa,
thời gian thế hệ đạt tới hằng số, quá trình trao đổi chất diễn ra mạnh mẽ nhất đồng
thời sản phẩm chính của quá trình lên men tạo ra lớn nhất (acid acetic). Trên đường
cong sinh trưởng phase mũ có dạng là đường thẳng đi lên. Phase mũ không thể tiếp
tục vô tận vì như thế số lượng tế bào VSV quá lớn sẽ phá vỡ thế cân bằng của quần
thể VSV.
c. Pha ổn định
Trong pha này tốc độ sinh trưởng cũng như trao đổi chất của quần thể VSV
giảm so với pha log. Sản phẩm sinh ra ở trạng thái ổn định đồng thời số lượng TB
chết cân bằng với số TB sinh ra. Một số nguyên nhân khiến quần thể VSV chuyển
sang pha cân bằng như: chất dinh dưỡng cạn kiệt, nồng độ oxi giảm (đối với vi
khuẩn hiếu khí), các chất độc tích lũy, pH giảm do hàm lượng acid tăng làm ảnh
hưởng tới hoạt động của tế bào VSV

d. Pha tử vong
Trong giai đoạn này, số TB chết đi nhiều hơn số TB sinh ra và có một
sự giảm thực sự về số lượng TB sống. Một số VSV chứa các enzim tự phân giải
TB. Số khác có hình dạng TB thay đổi do thành TB bị hư hại. Trong lên men acetic
thì acid sinh ra không tăng lên mà còn bị giảm đi do VSV sử dụng tạo năng lượng
duy trì hoạt động sống. Đường cong phát triển trực tiếp ảnh hưởng bởi các điều
kiện môi trường và thành phần môi trường. Sự phát triển của VSV bị giới hạn bởi
sự cung cấp dinh dưỡng bị hạn chế và sự tích lũy các sản phẩm độc.