NGHIÊN cứu CHẾ tạo PANEL CHUẨN để ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG SINH PHẨM CHẨN đoán VIÊM GAN c

B Y Tế



Báo cáo
kết quả nghiên cứu đề tài cấp bộ


Tờn ti :
Nghiên cứu chế tạo panel chuẩn
để đánh giá chất lợng sinh phẩm
chẩn đoán viêm gan C
==================

Chủ nhiệm đề tài : TS. Nguyễn Thị Kim Hơng
Cơ quan chủ trì đề tài : Trung tâm Kiểm định Quốc gia
Sinh phẩm Y học
Cấp quản lý đề tài: Bộ Y tế

Thời gian thực hiện : từ tháng 8/2003 đến tháng 8/2005
Tổng kinh phí thực hiện đề tài : 250 triệu đồng
Trong đó kinh phí SNKH : 250 triệu đồng




6244
22/12/2006

Năm 2005
Comment [NT1]:
Comment [NT2R1]:
Comment [T3]:



CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN
Axít desoxyribonucleic
ARN
aa
Axít ribonucleic
Acid amin
Anti-HCV Antibody against Hepatitis C virus: Kháng thể kháng vi rút
viêm gan C
ELISA Enzyme-linked Immunsorbent assay: Thử nghiệm miễn dịch
gắn men
E1 Envelope glycoprotein: Glycoprotein vá 1
E2 Envelope glycoprotein: Glycoprotein vá 2
HCV Hepatitis C virus: Vi rút viêm gan C
IgM Immuno globulin M
NS1 Non-structure protein 1: Protein không cấu trúc 1
NS2 Non-structure protein 2: Protein không cấu trúc 2
NS3 Non-structure protein 3: Protein không cấu trúc 3
NS4 Non-structure protein 4: Protein không cấu trúc 4
NS5 Non-structure protein 5: Protein không cấu trúc 5
PCR Polymerase Chain Reaction: phản ứng chuỗi Polymerase

RIBA Recombinant immunoblot assay: Thử nghiệm miễn dịch thấm t¸i tæ
hîp
5’ UTR 5’ Untranslated Region: Vùng không phiên mã 5’
3’ UTR 3’ Untranslated Region: Vùng không phiên mã 3’
S/CO Signal per cut- off: Tỷ số giá trị OD mẫu trên giá trị ngưỡng
OD Optical density: Mật độ quang
TCYTTG Tổ chức y tế thế giới




MỤC LỤC

Trang
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1. NHỮNG HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT VIÊM GAN C (HCV)
1.1.1. Lịch sử phát hiện HCV
1.1.2. Đặc điểm vi rút học và cấu trúc gen của vi rút viêm gan C
1.1.3. Các genotype của HCV
1.1.4. Tình hình nhiễm HCV
1.2. CHẨN ĐOÁN NHIỄM VI RÚT VIÊM GAN C
1.2.1. Thử nghiệm phát hiện anti-HCV
1.2.2. Thử nghiệm phát hiện ARN của vi rút
1.2.3. Thử nghiệm phát hiện kháng nguyên lõi của vi rút
1.3.
MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ PANEL CHUẨN
1.3.1. Định nghĩa
1.3.2. Các loại panel
1.3.3. H−íng dÉn chung cña TCYTTG vÒ viÖc thiÕt lËp panel anti-HCV

3
3
5
5

7
9
10

10
10
12
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1. Địa điểm
2.1.2. Thời gian


14
14
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1. Mẫu huyế
t thanh người
2.2.2. Bộ sinh phẩm chẩn đoán

14
14

2.2.3. Panel chuẩn Quèc tÕ
14




2.2.4. Nguyên vật liệu và trang thiết bị cần dùng cho các kỹ thuật

14
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Thu thập mẫu máu
2.3.2. Thử nghiệm sàng lọc HBsAg bằng kỹ thuật ELISA
2.3.3. Thử nghiệm sàng lọc anti-HIV bằng kỹ thuật ELISA
2.3.4. Thử nghiệm sàng lọc anti-HCV bằng kỹ thuật ELISA
2.3.5. Xác định ARN của HCV bằng kỹ thuật PCR
2.3.6. Xác định genotype và phân týp củ
a HCV bằng cách xác định
trình tự vùng NS5b và Core-E1
2.3.7. Hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV cña c¸c mÉu huyÕt thanh ®Ó chÕ
t¹o panel
2.3.8. Thẩm định panel …………………………………………………


15
15
16
17
18

19

19
19

Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẾ TẠO PANEL…………………………
3.2. KẾT QUẢ CHẾ TẠO PANEL HCV CHUẨN
3.2.1. Kết quả lựa chọn các mẫu huyết thanh của panel
3.2.2. Kết quả hiệu chỉnh hµm l−
îng anti-HCV
3.2.3. Thiết lập panel chuẩn………………………………………………….
3.2.4. Thẩm định panel chuẩn PCE/02.2005…………………………………
3.2.5. Hoµn thiÖn chÊt l−îng cña panel thµnh phÈm

20

22
28
32
35
37
Chương 4: BÀN LUẬN
4.1. QUI TRÌNH CHẾ TẠO PANEL
4.2. CHẾ TẠo PANEL CHUẨN anti-HCV………… ……………………
4.2.1.Lựa chọn mẫu huyết thanh

41

42

4.2.2. Phân bố các genotype của HCV và việc lựa chọn các genotype và
phân týp để chế tạo panel
4.2.3. Hiệu chỉnh hàm lượng anti-HCV trong panel chuẩn…………………
4.2.4. Panel thành phẩm


44
45
46
4.2.5. Chất lượng của panel chuẩn
4.3. HIỆU QUẢ THỰC TIỄN
48
48

KẾT LUẬN 50
KIẾN NGHỊ 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO 52


- 1 -
T VN

Vi rỳt viờm gan C thuc h Flaviviridiae, l mt trong nhng nguyờn
nhõn quan trng gõy nờn bnh viờm gan do vi rỳt. ng lõy truyn vi rỳt
viờm gan C ch yu l qua truyn mỏu, quan h tỡnh dc v lõy truyn t m
sang con. Cng nh vi rỳt viờm gan B, ngi b nhim vi rỳt viờm gan C tựy
theo mc cú th b viờm gan cp tớnh hoc mn tớnh v dn dn cỏc thng

tn gan nh x gan, ung th gan tiờn phỏt.
Hin nay, phng phỏp chn oỏn trong phũng thớ nghim i vi cỏc
trng hp nhim vi rỳt viờm gan C ch
yu vn l da vo vic phỏt hin
khỏng th c hiu (anti- HCV) lu hnh trong mỏu. T nm 1990, nh vic
sng lc anti- HCV nhng ngi hin mỏu ti mt s nc phỏt trin, ó
lm gim ỏng k t l nhim vi rỳt viờm gan C.
Theo thụng bỏo ca T chc Y t th gii hng nm cú khong 3-4
triu ngi nhim mi, a con s b nhim vi rỳt viờm gan C lờn khong 170
triu ngi, chim t l 3% dõn s trờn th gii. Vit Nam cng l mt trong
nhng nc cú t l nhim vi rỳt viờm gan C khỏ cao.
Hin nay, trờn th gii cú nhiu loi sinh phm chn oỏn anti-HCV,
chủ yếu là kít ELISA và kít chẩn đoán nhanh của các hãng nh Abbott,
Organon, Biorad, Span, Standard, Ortho, J, Mitra &Co Ltd Tất cả các kớt
này trớc khi xuất xởng phải đợc phòng kiểm định của nc s ti đánh giá
chất lợng bằng cách sử dụng panel chuẩn của cơ sở. D nhiờn do quỏ trình
vận chuyển và bảo quản có thể ảnh hởng đến chất lợng của các sinh phẩm,
vỡ th bảo đảm chất lợng cho các sinh phẩm nhập khẩu, cơ quan kiểm
định nớc nhập khẩu cần phải tiến hành đánh giá li chất lợng trớc khi cho
phộp phõn ph
i sử dụng.

- 2 -
Ở Việt nam, Bộ Y tế giao trách nhiệm này cho Trung tâm Kiểm định
Quốc gia Sinh phẩm Y học. Tuy nhiên, việc mua panel chuẩn quốc tế hiện
nay gặp nhiều khó khăn, do sản phẩm có giá thành cao, phải mua bằng ngoại
tệ, hãng lại không bán với số lượng ít, nên không thể chủ động trong công tác
kiểm định. Đó là lý do mà lâu nay việc đánh giá chất lượng các bộ sinh phẩm
chẩn đoán tại Trung tâm Kiểm định Quốc gia Sinh phẩm Y h
ọc chỉ mới dừng

ở mức so sánh độ nhạy và độ đặc hiệu của sinh phẩm giữa các hãng với nhau.
Vì thế độ chính xác của kết quả bị hạn chế.
Xuất phát từ nhu cầu thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên
cứu chế tạo panel chuẩn ®Ó đánh giá chất lượng sinh phẩm chẩn đoán
viêm gan C” nhằm 2 mục tiêu sau:
1. Xây dựng quy trình chế tạo panel chuẩ
n anti-HCV.
2. Chế tạo được panel chuẩn để đánh giá chất lượng các bộ sinh phẩm
chẩn đoán viêm gan C b»ng kü thuËt ELISA.

- 3 -
Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. MỘT SỐ HIỂU BIẾT VỀ VI RÚT VIÊM GAN C (HCV)
1.1.1. Lịch sử phát hiện HCV
Viêm gan vi rút là một bệnh nhiễm trùng nguy hiểm, rất phổ biến trên
thế giới do bị nhiễm một hoặc phối hợp vài loại vi rút viêm gan ví dụ như: vi
rút viêm gan A, B, C, D và E, gây nên tổn thương chủ yếu ở gan, dẫn đến xơ
gan hoặc ung thư gan tiên phát.
Năm 1975, lần đầu tiên người ta nhận thấy, trong 80-90 % c¸c trường
h
ợp có viêm gan liên quan ®Õn truyền máu hoÆc c¸c s¶n phÈm m¸u, nhưng
nguyên nhân của nó không phải là do vi rút viêm gan A hay viêm gan B. Vì
vậy bệnh mới được gọi là viêm gan không A, không B và tác nhân gây ra nó
được cho là vi rút viêm gan không A, không B.
Năm 1989, một nhóm các nhà khoa học ở Chiron (California, Mỹ) hợp
tác với nhóm các nhà khoa học ở CDC (Trung tâm kiểm soát bệnh hoa Kỳ) sử
dụng kỹ thuật PCR đã phát hiện và xác định được chuỗi ARN của vi rút gây
bệnh viêm gan không A, không B và họ đã đặt tên cho nó là vi rút viêm gan C

(HCV).

1.1.2 Đặc điểm vi rút học và cấu trúc gen của vi rút viêm gan C
HCV thuộc giống Hepacivirus trong họ Flaviviridae, có hình cầu,
đường kính 50 -60 nm, là vi rút có cấu trúc ARN một sợi dương.
Bộ gen của vi rút viêm gan C chứa khoảng 9033 nucleotit với một
khung đọc mở (ORF) lớn, mã hóa cho một chuỗi polyprotein tiền thân của
khoảng 3011 axit amin (aa). Polyprotein này được gắn enzyme signalase của
tế bào vật chủ và enzyme proteases của vi rút tạo thành 10 protein vi rút theo
một trình tự nhất định NH2-Core E1-E2p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-
NS5b-COOH. Vùng không mã hóa nằm ở đầu 5’ và đầu 3’ củ
a sợi ARN.
Vùng không mã hóa ở đầu 5’ đóng vai trò then chốt trong quá trình phiên mã,
còn vùng không mã hóa ở đầu 3’ có khoảng 200-235 nucleotit là vùng đặc
Comment [C4]:
Comment [C5]:

- 4 -
hiu týp cú tớnh n nh cao. Do cu trỳc ca HCV l ARN nờn b gen ca nú
rt d b bin i.



Hỡnh 1.1 : Cu trỳc gen ca HCV

Tựy theo vai trũ ca cỏc protein c mó húa m b gen ca HCV to
ra vựng cu trỳc v vựng khụng cu trỳc (Hình 1.1). Vựng cu trỳc bao gm:
vựng lừi, E1 v E2, mã hoá cho protein lõi, protein vỏ E 1 và E 2 tơng ứng.
Vùng không cấu trúc của bộ gen của HCV mã hoá cho các protein không cấu
trúc là NS2, NS3, NS4 và NS5. Các protein không cấu trúc có chức năng

khác nhau trong quá trình tái tạo hạt virut
Phõn tớch v trt t gen ARN ca HCV, ngi ta phỏt hin chui
nucleotit ca E1 v E2 khụng n nh, d thay i. Nguyờn nhõn vi rỳt thoỏt
khi s kim soỏt ca ỏp ng min dch vt ch l nh cú s khỏc nhau ca
protein v. Hai vựng bin
i cao ca chui aa ngn trong protein E2 c
gi l vựng siờu bin 1 (HVR1) v vựng siờu bin 2 (HVR2). Mt vi nghiờn
cu ó gi ý rng HVR1 cú kh nng trung ho khỏng th khỏng HCV. Tuy
nhiờn, do vựng ny rt hay bin i, vỡ th rt khú khn cú th ch to ra 1
loi vacxin cú kh nng phũng chng c HCV.

- 5 -
1.1.3 Các genotype của HCV
Bộ gen của HCV có các vùng ổn định gọi là vùng bảo thủ cao và các
vùng thay đổi rất mạnh gọi là vùng siêu biến đổi (HVR1) nằm ở đầu 5’ của
E2/NS1. Những đột biến ở vùng siêu biến đổi này khiến HCV có cấu trúc gen
không ổn định và được phân chia thành nhiều genotype và phân týp khác
nhau. Trong sợi ARN của HCV có khoảng 68-91,8% nucleotit xếp theo trình
tự chung cho tất cả các genotype. Việc xác định genotype của vi rút dựa vào
sự khác biệt về trình tự nucleotit trên các vùng thay đổ
i của toàn bộ sợi ARN
hoặc trên một vùng giới hạn hoặc trên sự khác nhau của oligonucleotit mồi
trong quá trình khuếch đại của PCR (polymerase chain reaction). Nếu sự khác
biệt lớn hơn 20%, chúng được xếp thành 2 genotype khác nhau. Ngược lại,
nếu sự khác biệt dưới 20% chúng được cho là cùng một genotype nhưng khác
nhau phân týp .
Dựa trên tính không đồng nhất của bộ gen, người ta đã chia HCV thành
11 genotype (ký hiệu từ 1 -11), với nhiều phân týp (ký hiệu là a,b,c ) với
khoảng 100 chủng khác nhau do sự phân b
ố khác nhau của bộ gen. Các

nghiên cứu ở nước ngoài đã xác định được sự phân bố của genotype của HCV
trên nhiều vùng dân cư và các nhóm có nguy cơ cao. Genotype 1 và 3 có mặt
trên toàn cầu trong đó phân typ 1a và 1b rất hay gặp chiếm tới 60%, chủ yếu
tập trung ở Bắc Âu, Bắc Mỹ, Nam và Đông Âu , Nhật Bản; Genotype 2 ít
hơn genotype 1 và 3 và chỉ có ở khu vực bắc M ỹ, tây Âu và phân bố khác
nhau giữa các nước; Genotype 4 có ở Trung Đông, Ai Cập, châu Phi;
Genotype 5 ở Nam Phi; Riêng genotype 6 -11 chỉ có
ở Châu Á.
1.1.4 Tình hình nhiễm HCV
1.1.4.1 Tình hình nhiễm HCV trên thế giới
Theo số liệu của Tổ chức Y tế thế giới, trên toàn cầu có khoảng 170
triệu người nhiễm HCV chiếm tỷ lệ khoảng 3% dân số thế giới. HCV có mặt
ở hầu hết các châu lục. Tỷ lệ nhiễm HCV ở cộng đồng dao động trong khoảng
0,3-6%. Nhìn chung tỷ lệ nhiễm HCV ở Châu Âu thấp hơn Châu Á và Châu

- 6 -
Phi, tỷ lệ nhiễm HCV cũng khác nhau theo từng vùng, khu vực và từng quốc
gia (Bảng 1.1)
Trong tất cả các trường hợp mắc, chỉ 25% trường hợp có biểu hiện triệu
chứng và 60-80% trường hợp có thể tiến triển thành viêm gan mạn tính, 20%
tiến triển thành ung thư và khoảng 7-10% có thể gây tử vong .

Bảng 1.1: Sự lưu hành và nhiễm HCV trên các châu lục,vùng.
(số liệu thống kê của TCYTTG)
Các vùng
Dân sô
(Triệu người)
Tỷ lệ lưu
hành HCV
Số người

nhiễm
(triệu)
Số lượng nước
không được đề
cập
Châu Phi (Africa) 602 5.3 31.9 12
Châu Mỹ (Americas) 785 1.7 13.1 7
Trung đông (Eastern
Mediterranean)

466
4.6 21.3 7
Châu Âu (Europe) 858 1.03 8.9 19
Đông Nam Á (South-
East Asia)
1 500 2.15 32.3 3
Tây Thái bình Dương
(Western Pacific)
1 600 3.9 62.2 11
Tổng số (Total) 5 811 2.92 169.7 57
1.1.4.2 Tình hình nhiễm HCV ở Việt Nam
Ở Việt Nam đã có nhiều công trình nghiên cứu về nhiễm HCV đặc biệt
ở nhóm đối tượng có nguy cơ cao và khác nhau giữa các vùng địa lý. Theo
Nguyễn Thu Vân và cộng sự tỷ lệ nhiễm HCV trong cộng đồng là 0,4-1,35,
nhóm người cho máu tại Hà Nội là 0,8%. Tỷ lệ mang anti-HCV (+) ở người
nghiện chích ma tuý lên tới 80-90%.

- 7 -
Nghiờn cu ca Bựi Trng Chin nhúm ngi bỡnh thng ti cỏc
tnh min Trung cho thy Bỡnh Thun nhim HCV chim t l 1,5%, Ninh

Thun chim t l 2,4%, Bỡnh nh chim t l 2,3% .
Cũn tỏc gi Trng Xuõn Liờn khi nghiờn cu v t l mang du n
anti- HCV thnh ph H Chớ Minh của nhúm ngi bỡnh thng là 2,53%.
Mt nghiờn cu khỏc ti Bnh vin Ch R
y cho thy t l nhim HCV
trong s cỏc trng hp viờm gan vi rỳt cp l 10,95%
1.2. Chẩn đoán nhiễm virut viêm gan C
1.2.1 Th nghim phỏt hin kháng thể anti-HCV
Thụng thng kháng thể anti-HCV xut hin trong vũng t 2-8 tun
sau khi b nhim. Tuy nhiờn cng cú mt s bnh nhõn sau khi bnh khi phỏt
6-9 thỏng kt qu th nghim vn õm tớnh. K thut th nghim ny cho phộp
phỏt hin khỏng th anti-HCV trong huyt thanh ngi nhim vi rỳt, nhng
khụng xỏc nh c giai on nhi
m cp tớnh v giai on món tớnh.
1.2.1.1 Th nghim ELISA (th nghim min dch gn men)
Kể từ năm 1989 khi lần đầu tiên đợc áp dụng để phát hiện kháng thể
anti-HCV cho đến nay th nghim ELISA đã trải qua 3 thế hệ dựa trên mức
độ hoàn thiện về độ nhạy và độ đặc hiệu.
- Th h u tiờn cha khỏng nguyờn tỏi t hp NS4 (C100-3) nhng
vi nhy kộm v khụng giỳp ớch cho chn oỏn gian on ca s 4-6
thỏng k t khi nhim HCV.
- Th h th 2 c b xung thờm khỏng nguyờn lừi v NS3 do ú m
cú nhy v c hi
u cú tng lờn.
- Th h th 3 ngoi vic gn khỏng nguyờn ging nh th h 2, cũn
c b xung thờm khỏng nguyờn tỏi t hp NS5. Nh th h th nghim th
3 ny có độ nhạy rất cao.

- 8 -
Nguyờn lý ca th nghim ELISA: khỏng nguyờn HCV ó c ph

sn trong phin s to thnh phc hp min dch: (HCV)- (anti-HCV) nu
trong mu xột nghim cú anti- HCV. Phức hợp này phản ứng với cộng hợp
(conjugate) là khỏng th n dũng khỏng IgG ngi gắn với enzyme
peroxidase (HRPO) và khi tác động với cơ chất thích hợp sẽ xuất hiện màu, tỷ
lệ theo hàm lợng của kháng thể anti-HCV có trong huyết thanh thử nghiệm.
1.2.1.2 Th nghim RIBA (Recombinant immunoblot assay) - Th nghim
min dch thm tái tổ hợp
Theo qui nh ca hip hi an ton trong truyn mỏu v TCYTTG, th
nghiờm RIBA l th nghim b sung c dựng trong chn oỏn anti-HCV.
Nguyờn lý: dựng mng nitrocelluloza ó c thm min dch bng
khỏng nguyờn HCV riờng r. Anti-HCV nu cú trong mu huyt thanh s gn
vo cỏc khỏng nguyờn ó c tỏch v c nh trờn cỏc vch bng. Th
nghim RIBA c coi dng tớnh nu xut hin ớt nht 2 vch.
õy l th nghim phỏt hin anti-HCV vi c hiu cao, c thc
hin trờn mu th nghim sng lc dng tớnh. Kt qu ca th nghim RIBA
lm sỏng t thờm nhng mu cú kt qu dng tớnh, õm tớnh hoc khụng rừ.
Th nghim RIBA ch khng nh huyt thanh ca bnh nhõn cú anti-
HCV nhng khụng th phõn bit c ó tng b nhim hay ang nhim.
Mun ỏnh giỏ tỡnh trng nhim HCV phi lm th nghim axớt nucleic
(NAT- Nucleic Acide Test). Nu kt qu th nghim RIBA õm tớnh thỡ khng
nh huyt thanh anti-HCV õm tớnh. Nu kt qu th nghim RIBA khụng rừ
thỡ mu huyt thanh th
nghim c ly xột nghim li ớt nht 1 thỏng.
1.2.1.3 Th nghim RIA (Radio immuno assay)
Nguyờn lý ca th nghim ny tng t nh th nghim min dch gn
men. Nhng cỏc khỏng nguyờn trong sinh phm chn oỏn c ỏnh du
bng cht ng v phúng x.

- 9 -
RIA cng c phỏt trin qua cỏc th h vi cỏc phn ng mi cú

nhy v c hiu ngy cng cao. Phn ng ny khụng c dựng rng rói
vỡ ũi hi trang thit b phc tp, hn dựng ca sinh phm ngn v phi c
bo qun c bit.
1.2.1.4. Thử nghiệm sắc ký miễn dịch màng (Immuno chromatographic
membrane test) hay còn đợc gọi là thử nghiệm nhanh
õy l th nghim sc ký min dch mng Nitrocellulose c ph
khỏng nguyờn C, NS3, NS4, NS5 tỏi t hp trờn v
ch th v Immunoglobulin
G cú trờn vch chng. Mu th l huyt thanh hoc huyt tng hoc mỏu
ton phn ngi thm qua mng mu cựng vi protein A cú gn cỏc ht vng
di chuyn n vựng th nghim (vựng T). Nu mu th cú anti- HCV thỡ liờn
kt ht vng-khỏng nguyờn HCV s kt hp vi khỏng th to thnh phc hp
protein A gn ht vng-khỏng nguyờn- khỏng th trờn vựng T v to thnh
vch mu. Kt qu c ỏnh giỏ l dng tớnh khi trờn que th nghi
m xut
hin ng thi c 2 vch vựng T v C. Nu ch cú mt vch trờn vựng chứng
v khụng cú vch no trờn vựng T thỡ kt qu th nghim l õm tớnh. Th
nghim nhanh, trong vòng 15 phút, giá rẻ, rt tin li cho nhng ngi thc
hin, tuy nhiờn nhy v c hiu cũn hn ch.

1.2.2 Th nghim phỏt hin ARN ca vi rỳt
K thut PCR cho phộp phỏt hin vi rỳt bng cỏch khuch i chn lc
m
t on acid nucleotit (ARN hoc DNA) rt nh m bng cỏc k thut thụng
thng khỏc khụng phỏt hin c. Cỏc k thut chn oỏn huyt thanh v
min dch hc thụng thng khụng th phỏt hin c khỏng nguyờn ca vi
rỳt nu nng vi rỳt rt thp trong mỏu. Phng phỏp phỏt hin trc tip
HCV l do xỏc nh s hin din ARN ca HCV bng k thut PCR. Th
nghim ny cú kh nng phỏt hin sm quỏ trỡnh nhi
m bnh trc khi cú s

chuyn i huyt thanh hc (s xut hin anti- HCV). Th nghim nh
genotype v nh tớnh ARN ca HCV bng phng phỏp PCR c khuyn
cỏo s dng trc khi iu tr.

- 10 -
Xỏc nh ARN ca HCV bng phng phỏp PCR giỳp vic nhn bit
c i vi nhng bnh nhõn b nhim HCV th hot ng.
1.2.3 Th nghim phỏt hin khỏng nguyờn lừi ca vi rỳt
Hin nay th nghim phỏt hin khỏng nguyờn lừi ca vi rỳt cũn ang
trong giai on nghiờn cu nhm phỏt hin s cú mt hoc khụng cú mt ca
vi rỳt c bit l giai don ca s. Trong một nghiên cứu 2586 huyết thanh
của những ngời cho máu đã có kết quả anti-HCV (-) thì phát hiện 16 trờng
hợp có ARN của HCV và 15 trong số mẫu đó có kháng nguyên lõi. Th

nghim này phỏt hin c HCV trong vũng t 1-3 tun sau khi nhim v
dùng để giỏm sỏt iu tr khỏng vi rỳt. Phng phỏp ny khỏ phự hp dựng
cho vic sng lc vi s lng ln mu mỏu ca ngi tỡnh nguyn, s cũn li
c s dng trong vic giỏm sỏt lõm sng.
1.3. MT S HIU BIT V PANEL CHUN
1.3.1. nh ngha
Panel HCV l mt tp hp cỏc mu huyt thanh cú cha hm lng
anti-HCV khỏc nhau c s d
ng trong ỏnh giỏ cht lng sinh phm chn
oỏn anti-HCV v k thut xột nghim
Trong sn xut sinh phm chn oỏn nh sn xut phi ch to panel
chun c s ỏnh giỏ cht lng sinh phm chn oỏn do chớnh hóng sn
xut. Panel chun c s ny phi c hiu chnh t panel chun quc t.
Panel chun quc t do hóng Boston Biomedical Inc- M sn xut theo
n
t hng ca TCYTTG.

1.3.2. Cỏc loi panel
1.3.2.1. Panel chuyn i huyt thanh (seroconversion panels)
L mt tp hp cỏc mu huyt thanh c thu thp trong mt khong
thi gian t mt cỏ nhõn trong quỏ trỡnh tin trin ca nhim trựng v giai
on ỏp ng min dch sau ú, c dựng ỏnh giỏ cht lng b sinh
phm chn oỏn tng ng.

- 11 -
Cú 4 panel chuyn i huyt thanh chun ca hóng Boston sn xut
c TCYTTG phờ chun l PHV 907, PHV 908, PHV 911, PHV 913. Trong
ú panel PHV907 bao gm 7 mẫu huyết thanh t PHV907-01 n PHV907-
07, panel PHV908 bao gm 13 mẫu HT t PHV908-01 n PHV908-13,
panel PHV911 bao gm 5 mẫu HT t PHV911-01 n PHV911-01 n
PHV911-05 v panel PHV913 bao gm 4 mẫu HT t PHV913-01 n
PHV913-04.
1.3.2.2. Panel thc hin (performance panels)
Bao gm cỏc mu huyt thanh ca nhiu ngi vi mc dng tớnh
khỏc nhau dựng đỏnh giỏ nhy v c hi
u ca b sinh phm chn
oỏn tng ng
B panel anti-HCV thc hin cú nng thp ký hiu l PHV104 gm
15 mẫu huýet thanh t PHV104-01 n PHV104-15.
1.3.2.3. Panel nhy (sensitivity panels)
L panel pha loóng c hiu chnh theo mu chun quc t bao gm mt
dy nhiu mu có các hàm lợng anti-HCV khác nhau dựng :
- ỏnh giỏ nhy ca b sinh phm chn oỏn anti- HCV
- Thm nh
nh k ca phng phỏp mi
- So sỏnh cỏc phng phỏp trong chn oỏn
Hin nay hóng BBI cú panel nhy ký hiu l PHV205 gồm 25 mẫu

huyết thanh (trong đó có 2 mẫu anti-HV (-) và 23 mẫu anti-HCV (+)
1.3.2.4. Panel c hiu (multi-marker negative panels) cũn gi l panel a
õm tớnh
Bao gm nhiu mu huyt thanh khụng pha loóng õm tớnh vi anti-HCV,
HBsAg, anti-HIV, Syphilys, anti-HTLV c dựng ỏnh giỏ c
hiu ca các b sinh phm chn oỏn tơng ứng.
BBI có panel để đánh giá độ đặc hiệu ký hiệu là Accurun 1 gồm 12 mẫu
huyết thanh, đợc dùng để đánh gía độ đặc hiệu của các bộ sinh phẩm chẩn
đoán tơng ứng.

- 12 -
1.3.3. Hớng dẫn chung của Tổ chức Y tế thế giới về việc thiết lập panel
chuẩn anti-HCV
Năm 1996, Uỷ ban tiêu chuẩn hoá sinh phẩm của Tổ chúc Y tế thế giới
thành lập Hội đồng Quốc tế về penal chuẩn cho thử nghiệm các sinh phẩm
chẩn đoán HBsAg, anti-HCV và anti-HIV trong sàng lọc máu.
Năm 1998, Hội đồng đã thiết lập đợc panel anti-HCV chuẩn để phân loại
chất lợng của các sinh phẩm chẩn đoán anti-HCV thơng mại. Cỏc mẫu
huyt thanh ca WHO ch to panel đợc thu thp t cỏc chõu lc.

Năm 2000, Hội đồng Quóc tế về Panel chuẩn đã đa ra một số hớng dẫn
chung cho việc thiết lập panel anti-HCV:
1. Các mẫu huyết thanh không nên bất hoạt bằng nhiệt độ (56
0
C)
2. Dùng huyết thanh anti-HCV (-) làm dung môi để pha loãng các mẫu
anti-HCV (+).
3. Sơ đồ tiến hành chọn lọc các mẫu huyết thanh anti-HCV (-) và anti-
HCV(+):

- 13 -

Hình 1.2:Sơ đồ lựa chọn các mẫu huyết thanh của panel quốc tế
(theo WHO)
ELISA 1: Ortho HCV 3.0/Enhanced SAVe
ELISA 2: Monolissa anti-HCV PLUS
ELISA 1: +
ELISA 2: +
ELISA 1: + ELISA 2: -
ELISA 1: - ELISA 2: +
ELISA 1: -
ELISA 2: -
Dương tính
Không rõ Âm tính
Anti-HCV (+) Không rõ
Dương tính PCR Âm tính
Xác định
genotyp
Anti-HCV (-)
CHIRON RIBA HCV 3.0

- 14 -
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG - VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
2.1.1 Địa điểm: Quá trình nghiên cứu được thực hiện tại 2 cơ sở :
- Khoa Sinh phẩm Miễn dịch-Trung tâm Kiểm định Quốc gia Sinh phẩm
Y học- Bộ Y tế.
- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

2.1.2 Thời gian:
Từ tháng 09/2004 đến 08/2005
2.2. VẬT LIỆU
2.2.1 Mẫu huyết thanh người
Bao gồm 100 mẫu huyết thanh dự tuy
ển trong đó 50 mẫu âm tính và 50
mẫu dương tính với anti-HCV
2.2.2 Bộ sinh phẩm chẩn đoán
- Bộ sinh phẩm chẩn đoán HCV của Ortho: Ortho HCV 3.0 ELISA
- Bộ sinh phẩm chẩn đoán HCV của Biorad: Monolisa anti-HCV PLUS
- Bộ sinh phẩm chẩn đoán HBsAg: Monolisa HBsAg của Biorad
- Bộ sinh phẩm chẩn đoán anti- HIV1/2 : Genscreen HIV1/2 Version 2.0
của Biorad
2.2.3 Panel chuẩn của hãng Boston Biomedia Inc.
- Panel độ nhạy: ký hiệu PHV 205
- Panel độ đặc hiệu: ký hiệu A001-1008 N
2.2.4 Trang thiế
t bị cần thiết dùng cho các kỹ thuật
- Buồng vô trùng
- Máy ủ nhiệt chu kỳ Gene Amp PCR System 9700
- Bộ chạy điện di

- 15 -
- Bộ sinh phẩm tách triết ADN (QIA amp DNA) của hãng QIAGEN
- Máy đọc tiêu bản bằng ánh sáng cực tím
- Máy đọc bản ELISA PR 2100
- Máy rửa bản
- Máy bơm chân không
- Máy lắc phiến
- Máy trộn mẫu

- Máy ly tâm tube 1,5ml
- Tủ ấm
- Máy và các dụng cụ chuyên dụng khác.
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Thu thập mẫu máu
- 50 mẫu anti-HCV (-) đã sàng lọc sơ bộ đạt tiêu chu
ẩn sau:
• Không có HBsAg
• Không có anti- HIV
• Không có anti- HCV
- 50 mẫu anti-HCV (+) đã sàng lọc sơ bộ đạt các tiêu chuẩn sau:
• Có chứa anti- HCV
• Không có HBsAg
• Không có anti- HIV
2.3.2. Thử nghiệm sàng lọc HBsAg bằng kỹ thuật ELISA - Sử dụng sinh
phẩm Monolisa HBsAg của Biorad đã được cấp giấy phép tại Việt Nam

Nguyên tắc thử nghiệm:

Dựa trên nguyên tắc “sandwich” một bước (kháng thể- kháng nguyên-
kháng thể). Khi anti- HBs gắn trên phiến và anti- HBs gắn với enzyme HRPO
(cộng hợp) được ủ với mẫu huyết thanh thử nghiệm, phức hợp kháng thể-
kháng nguyên được hình thành trong giếng. Họat tính của enzyme trong mỗi
giếng thể hiện sự có mặt của HBsAg trong các mẫu huyết thanh và biểu hiện
thông qua giá trị của đậm độ quang học (OD)

- 16 -
Các bước tóm tắt như sau:

I-Ab + Ag(mẫu) + AB*E + Sub → Đọc kết quả ở bước sóng 450/620nm

↑
Rửa
Trong đó

- Ag= Kháng nguyên
- Ab= kháng thể
- AB= Kháng thể từ một loại động vật khác so với Ab
- AB*E= Cộng hợp
- Sub= Cơ chất
- I= Pha rắn để gắn kháng thể
Nhận định kết quả

- Nếu đậm độ quang học nhỏ hơn giá trị ngưỡng thì được coi là âm tính
với HBsAg
- Nếu đậm độ quang học lớn hơn hoÆc b»ng giá trị ngưỡng thì ®−îc coi
lµ dương tính với HbsAg
* C¸c b−íc cña thö nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë phô lôc sè 1

2.3.3 Thử nghiệm sàng lọc anti- HIV bằng kỹ thuật ELISA - Sử dụng sinh
phẩm Genscreen HIV1/2 của Biorad đã được cấp giấy phép tại Việt Nam
Nguyên t
ắc thử nghiệm
Dựa trên nguyên tắc “sandwich” 2 bước (kháng nguyên-kháng thể-
kháng nguyên) khi kháng nguyên gắn trên phiến và kháng nguyên gắn với
enzyme HRPO (cộng hợp) được ủ với mẫu huyết thanh thử nghiệm phức hợp
kháng nguyên kháng thể được hình thành trong giếng. Hoạt tính enzyme trong
mỗi giếng thể hiện sự có mặt của anti- HIV trong các mẫu huyết thanh và biểu
hiện thông qua giá trị đậm độ quang học (OD)
Các bước thực hiện ELISA được tóm tắt như sau

I-Ag + Ab (mẫu)+ Ag
*
E + Sub → Đọc kết quả ở bước sóng 450/620nm

Rửa Rửa

- 17 -
Trong đó:

- Ag= kháng nguyên
- Ab= Kháng thể
- Ag
*
E= Cộng hợp
- Sub= Cơ chất
- I= Pha rắn để gắn kháng nguyên
Nhận định kết quả

- Nếu đậm độ quang học nhỏ hơn giá trị ngưỡng thì được coi là âm tính
với anti-HIV (S/CO<1)
- Nếu đậm độ quang học lớn hơn hoặc bằng giá trị ngưỡng thì được coi
là dương tính với anti-HIV(S/CO ≥ 1)
* C¸c b−íc cña thö nghiÖm ®−îc tr×nh bµy ë phô lôc sè 2

2.3.4 Thử nghiệm sàng lọc anti- HCV bằng kỹ thuật ELISA - Sử dụng
sinh phẩm Ortho HCV 3.0 ELISA của Ortho và Bộ sinh phẩm chẩn đoán
HCV của Biorad Monolisa anti-HCV PLUS đ
ã được cấp giấy phép tại Việt
Nam)
Nguyên tắc thử nghiệm

(chung cho cả 2 bộ sinh phẩm chẩn đo¸n): khi cho
mẫu huyết thanh thử nghiệm vào giếng của phiến, kh¸ng nguyªn gắn trªn
phiến và kh¸ng thể kh¸ng IgG ng−ời gắn enzym sẽ kết hîp với kh¸ng thÓ
anti-HCV cã trong mẫu để tạo thành phức hợp đặc hiệu. Hoạt tÝnh enzyme
trong mỗi giếng thể hiện sự cã mặt của anti- HCV trong c¸c mẫu huyết thanh
và biểu hiện th«ng qua gi¸ trị đậm độ quang học (OD) sau khi t¸c đ ộng với
cơ
chất.
Các bước thực hiện ELISA được tóm tắt như sau

I-Ag + Ab (mẫu)+ Anti-Ab
*
E + Sub → Đọc kết quả ở bước sóng 450/620nm


Rửa Rửa
Trong đó:

- Ag= kháng nguyên
- Ab= Kháng thể

- 18 -
- Anti-Ab
*
E= Cng hp (khỏng th khỏng loi c hiu g n enzym)
- Sub= C cht
- I= Pha rn gn khỏng nguyờn
Nhn nh kt qu

- Nu m quang hc nh hn giỏ tr ngng thỡ c coi l õm tớnh vi

anti-HCV (S/CO<1)
- Nu m quang hc ln hn hoc bng giỏ tr ngng thỡ c coi l
dng tớnh vi anti-HCV (S/CO1)
* Các bớc của thử nghiệm đợc trình bày ở phụ lục số 3

2.3.5 Xỏc nh ARN ca HCV bng phng phỏp PCR: Thử nghiệm này
đợc thự hiện tại Labo Sinh học phân tử của Công ty vacxin và Sinh phẩm số
1, Viện Vệ sinh dịch tễ TW
2.3.5.1. Nguyờn lý
K thut PCR cho phộp khuch i chn lc mt on axit nucleic
(ARN hoc AND) r
t nh m bng cỏc k thut thụng thng khụng phỏt
hin c. Khi nng vi rỳt thng rt thp trong mỏu, khụng tỡm c
khỏng nguyờn vi rỳt bng cỏc k thut min dch huyt thanh hc thụng
thng. Phng phỏp duy nht cú th phỏt hin vi rỳt trc tip l xỏc nh s
hin din ca cỏc ARN vi rỳt bng k thut PCR. phỏt hin HCV, k thut
PCR cn mt giai on chuyn ARN thnh ADN nh cỏc enzyme phiờn mó
ngc RT (Reverse trancriptase).
ARN c
a HCV c phỏt hin bng phn ng chui polymeraza nh 2
cp mi ngoi v trong khuch i on gen mó hoỏ vựng quyt nh
khỏng nguyờn ca HCV. Quy trỡnh gm 2 giai on chớnh:
- Tỏch chit ARN ca HCV
- Khuch i ARN HCV bng phng phỏp PCR
* Các bớc của thử nghiệm đợc trình bày ở phụ lục số 4

- 19 -
2.3.6 Xỏc nh genotype v phõn týp ca HCV bng cỏch xỏc nh trỡnh
t vựng NS5b v Core-E1 trờn mỏy ca hóng ABI: Đợc thực hiện tại
Trung tâm kiểm soát bệnh của Hoa Kỳ (CDC)

Để thực hiện thử nghiệm này cần phải có các nguyên liệu và máy móc
sau:
- Mỏy xỏc nh trỡnh t ABI 3100, mỏy gm 16 mao qun t ng xỏc
nh trỡnh t ADN v phõn tớch mnh ADN. Mỏy t ng xỏc nh
trỡnh t cho 192 mu trờn 2 phin 96 ging cho mi ln chy. Mỏy tớnh
s dng h iu hnh Windows NT v phn mm Sequencing Analysis
v GeneMapper ca hóng Applied Biosystem Inc-ABI- M.
- Mỏy nhit chu k- Perkin-Elmer 9700- M.
- Sn ph
m ADN tinh khit vựng NS5b v core-E1 ca vi rỳt viờm gan C
- Mi xuụi v ngc c s dng chn PCR vũng 2 cho vựng NS5b v
Core-E1- CDC M.
- dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) ó gn thuc nhum- ABI- M
- Cỏc mỏy v dng c chuyờn dng cn thit khỏc.
* Các bớc thực hiện đợc trình bày ở phụ lục số 5
2.3.7 Hiu chnh hàm lợng anti-HCV trong mu huyt thanh ch to
panel nghiờn cu
Việc hiệu chỉnh các mẫu huyết thanh anti-HCV(+) đợc thực hiện bằng
huyết thanh không chứa anti-HCV.
Hàm lợng anti-HCV cuối cùng trong panel nghiờn cu c xỏc nh
qua 3 ln th nghi
m riờng bit trên b sinh phm Monolisa anti-HCV Plus,
cú so sỏnh vi b panel chun quc t PHV 205.
Xỏc nh s chớnh xỏc ca kt qu cỏc th nghim bng phng phỏp
x lý thng kờ

2.3.8. Thm nh b panel nghiờn cu:
B panel ch to c tin hnh thm nh ti B mụn Vi sinh vt -Hc
vin Quõn Y bng phng phỏp so sỏnh vi panel chun quc t ca BBI trờn
b sinh phm chn

oỏn HCV Monolisa anti-HCV Plus ca Hóng Biorad.

- 20 -
Chơng 3
Kết quả nghiên cứu

3.1. xây dựng qui trình chế tạo panel chuẩn anti-HCV
Trờn c s tham kho cỏc ti liu liờn quan n sn xut panel chun,
chỳng tụi xõy dng qui trỡnh sn xut panel nh sau:


Sàng lọc HBsAg, anti-HIV1/2
Kh
ẳ
n
g

đị
nh
a
n
t
i-H
CV

(
+
)

và

(
-
)

t
r
ê
n ELI
S
A 1
,
ELI
S
A 2
ELISA 1: (-)
ELISA 2: (-)
PCR
Xỏc nh genotype
Lc vụ trựng
úng ng
(0,25ml/ng)
Bo qun
(
<-35
0
C
)
ELISA 1: (+)
ELISA 2: (+)

Hiu chnh vi
panel chun
Thu thập huyết thanh dự tuyển anti-HCV (+) và (-)