dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền để phân loại một số loài sán lá đơn chủ (monogenea) thuộc họ diplectanidae ký sinh trên cá mú (epinephelus spp.) tại khánh hòa

LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian vừa qua, em đ ã nhận được nhiều sự giúp đỡ tận t ình từ quý
thầy cô, gia đình và bạn bè cả về vật chất và tinh thần, đã tạo điều kiện cho em ho àn
thành đợt thực tập tốt nghiệp.
Em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến cô Đặng Thúy B ình, thầy Phan Văn
Út đã trực tiếp hướng dẫn, chỉ bảo trong qua tr ình thực hiện đề tài này.
Xin được cảm ơn các quý thầy cô trong Khoa Nuôi trồng, đặc biệt l à bộ môn
Bệnh học thủy sản, tr ường Đại học Nha Trang đ ã truyền đạt cho em những kiến
thức trong suốt những năm học vừa qua.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cô, anh chị Viện Công nghệ sinh học
và môi trường, trường Đại học Nha Trang, tạo điều kiện cho em thực tập tại đây.
Cuối cùng, em xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới gia đ ình, bạn bè,
tập thể lớp 46BH đ ã luôn động viên giúp đỡ trong suốt quá tr ình học tập và thực
hiện đề tài.
Em xin chân thành c ảm ơn!
Sinh viên thực hiện
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Giải thích thuật ngữ, chữ viết tắt v à ký hiệu
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
MỞ ĐẦU 1
Phần 1. TỔNG QUAN 2
1. VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2
1.1. Họ cá mú (Seranidae) 2
1.1.1. Vị trí phân loại 2
1.1.2. Đặc điểm hình thái 2
1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố 2
1.2. Đặc điểm chung về sán lá đ ơn chủ (Monogenea) 3
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU BỆNH SÁN LÁ Đ ƠN CHỦ KÝ SINH TRÊN

CÁ MÚ (EPINEPHELUS SPP.) 5
2.1. Tình hình nghiên cứu bệnh sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú nói chung 5
2.1.1. Tình hình nghiên c ứu trên thế giới 5
2.1.2. Tình hình nghiên c ứu tại Việt Nam 7
2.2. Tình hình nghiên c ứu họ Diplectanidae (Monogenea,
Monopiscotylidae) ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) 9
2.2.1. Trên thế giới 9
2.2.2. Việt Nam 11
2.3. Tình hình nghiên c ứu đặc điểm di truyền các lo ài sán lá đơn chủ 11
Phần 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU 13
1. Thời gian, địa điểm, đối t ượng nghiên cứu 13
2. Phương pháp nghiên c ứu 14
2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu 14
2.2. Phương pháp nghiên c ứu hình thái sán lá đơn chủ ký sinh trên cá 14
2.3. Phương pháp nghiên c ứu di truyền sán lá đ ơn chủ 17
Phần 3. KẾT QUẢ NGHI ÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 22
1. Đặc điểm hình thái các loài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae
Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 22
1.1. Mô tả đặc điểm hình thái 22
1.1.1.Giống Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 23
1.1.2. Giống Diplectanum Diesing, 1858 33
1.2. Mức độ cảm nhiễm 37
2. Đặc điểm di truyền các lo ài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae
Bychowsky, 1957 ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 40
Phần 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 46
1. Kết luận 46
1.1. Đặc điểm hình thái và mức độ cảm nhiễm của cá c loài sán lá đơn ch ủ
thuộc họ Diplectanidae (Monticelli, 1903) Bychowsky, 1957 ký sinh trên
cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46
1.2. Đặc điểm di truyền của các lo ài sán lá đơn ch ủ thuộc họ Diplectanidae

ký sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa 46
2. Đề xuất ý kiến 47
2.1. Về nghiên cứu bệnh sán lá đ ơn chủ ký sinh trên cá mú 47
2.2. Về nghiên cứu di truyền 47
Tài liệu tham khảo 48
Phụ lục
GIẢI THÍCH THUẬT NGỮ,
CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÝ HIỆU
CĐCN : cường độ cảm nhiễm
TLCN : tỷ lệ cảm nhiễm
DNA : deoxyribonucleic acid
Bp : base pair - cặp bazơ
cs : cộng sự
ctv : cộng tác viên
dd : dung dịch
gel : thạch
ITS1 : đoạn chèn giữa gen 18S và 5,8S
KHV : kính hiển vi
KST : ký sinh trùng
MCO : male copulatory organ – cơ quan giao c ấu đực
n. subfam : new subfamily – họ phụ mới
V : thể tích
V
dd
: thể tích dung dịch
Vagina : cơ quan giao cấu cái
lsr : large subunit ribosomal – ribosome tiểu phần lớn
ssr : small subunit ribosomal – ribosome tiểu phần nhỏ
Mồi : là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với
một đầu của mạch khuôn v à DNA polymerase s ẽ nối dài mồi để

hình thành mạch mới [2].
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ các mẫu cá mú 13
Bảng 2.2. Thành phần và thể tích dd ly trích 18
Bảng 2.3. Thành phần và thể tích dd dùng cho phản ứng PCR 19
Bảng 3.1. Thành phần loài Monogenea thu ộc họ Diplectanidae Bychowsky, 1957
ký sinh trên mang cá mú ( Epinephelus spp.) 22
Bảng 3.2. Kích thước các loài ký sinh trùng thu ộc họ Diplectanidae ký sinh trên
cá mú (Epinephelus spp.) 35
Bảng 3.3. Tên tác giả, năm công bố và số serries trình tự gen của các loài sán lá
đơn chủ tại ngân hàng gen. 41
DANH MỤC CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Vòng đời của sán lá đơn chủ 4
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu 14
Hình 2.2. Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) 16
Hình 3.1. Loài P. coioidesis Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999.
A – toàn bộ cơ thể; B – cơ quan giao cấu đực;
C – cơ quan giao cấu cái; D – hình chụp cơ quan giao cấu 24
Hình 3.2. Cơ quan giao c ấu đực và cái của loài P. cupatus 24
Hình 3.3. Loài P. cupatus. A – giác bám và đĩa bám; B – cơ thể;
C – giác bám; D – cơ quan giao cấu đực; E – thanh nối bụng;
F – thanh nối lưng; G – móc bám bụng; H – móc bám lưng 25
Hình 3.4. Loài P. mellanesinensis . A – giác bám và đĩa bám;
B – giác bám; C – thanh nối bụng; D – thanh nối lưng;
E – móc bám bụng; F – móc bám lưng 26
Hình 3.5. Loài P. mellanesinensis . A – cơ quan giao cấu đực và cái;
B – cơ quan giao cấu cái; C – trứng; D – dạng ấu trùng; E – cơ thể 26
Hình 3.6. Loài P. summanoides, A – Cơ quan giao c ấu đực và cái;

B – Toàn bộ cơ thể; C – Đĩa bám 27
Hình 3.7. Loài P. summanae Young, 1969 28
Hình 3.8. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A, B – cơ thể; C – dạng ấu trùng 29
Hình 3.9. Loài P. epinepheli Yamaguti,1938. A – giác bám và đĩa bám;
B – trứng; C – cơ quan giao cấu cái 29
Hình 3.10. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981.
A – cơ quan giao cấu đực và cái; B - Các biến dị của cơ quan giao cấu cái 30
Hình 3.11. Loài P. lantauensis Beverley – Burton & Suriano, 1981 31
Hình 3.12. Loài P. sp 1 31
Hình 3.13. Loài P. sp 1. Giác bám và đ ĩa bám 32
Hình 3.14. Loài P. sp 2. A,C – cơ thể. B – giác bám và đĩa bám,
D – cơ quan giao cấu cái 33
Hình 3.15. Loài Diplectanum grouperi . A, C – toàn bộ cơ thể;
B – Cơ quan giao c ấu đực 34
Hình 3.16. Loài Diplectanum grouperi . A – đẻ trứng;
B – cơ quan giao cấu đực và trứng 34
Hình 3.17. Biểu đồ cường độ cảm nhiễm các lo ài Monogenea trên cá Mú Đen ( E.
coioides) nuôi và tự nhiên 37
Hình 3.18. Biểu đồ tỷ lệ cảm nhiễm các lo ài Monogenea
trên cá Mú Đen ( E. coioides) nuôi và tự nhiên 38
Hình 3.19. Biểu đồ mức độ cảm nhiễm của một số lo ài Monogenea
trên các loài ký ch ủ đặc hữu 39
Hình 3.20. Cây phát sinh loài 43
Hình 3.21. Cơ quan giao cấu đực của một số lo ài thuộc giống
Pseudorhabdosynochus và Diplectanum. 44
1
MỞ ĐẦU
Hiện nay, ngành nuôi trồng thủy sản ở nước ta đang dần chuyển đổi cơ cấu sang
một số đối tượng khác có tiềm năng v à giá trị kinh tế cao hơn. Sau thời kỳ hoàng kim của
con tôm sú là sự lên ngôi của cá biển, trong đó đáng quan tâm là cá mú (Epinephelus

spp.), cá Chẽm (Lates calcarifer), cá Giò (Rachycentron canadum ) và cá hồng (Lutjanus
spp.). Những loài cá này là thức ăn rất quan trọng và bổ dưỡng cho con người và được
nuôi chủ yếu trong lồng nổi ở nhiều nước. Nghề nuôi cá biển tại Đông Nam Á bắt đầu từ
những năm 1970 và phát triển nhanh chóng trong suốt thập ni ên 80 với những trại sản
xuất giống cá chẽm và một số đối tượng quan trọng khác như cá Mú Đen (Epinephelus
coioides), cá Mú Mè (E. malabaricus), cá Hồng Vân Bạc (Lutjanus
arhentinaculatus),…[36]. Hiện nay, phong trào nuôi cá biển phát triển rộng khắp tr ên thế
giới với sản lượng hàng năm tăng nhanh. Theo d ự báo đã được công bố, nghề nuôi cá
biển sẽ phát triển nhanh và đạt tới sản lượng từ 3,5 – 4 triệu tấn năm 2010 [52]. Nước ta
đã và đang mở rộng diện tích nuôi cũng nh ư các đối tượng nuôi cá biển tuy nhiên vẫn chỉ
tập trung ở một số tỉnh có lợi thế về biển nh ư Quảng Ninh, Hải Phòng, Phú Yên, Khánh
Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận [3]. Trong đó, Khánh Hòa là địa phương nuôi cá biển
phát triển mạnh trong cả nước, cá được nuôi tập trung ở huyện Cam Ranh, huyện Vạn
Ninh và Vũng Ngán [16]. Cùng với sự phát triển nhanh chóng đó th ì dịch bệnh bùng
phát đã làm tổn thất kinh tế ở nhiều nước trong khu vực và trên thế giới.
Bệnh KST là một trong những nguy ên nhân quan trọng gây ra nhiều lo ngại
cho nghề nuôi cá biển nói chung v à nghề nuôi cá mú nói riêng. Với điều kiện như
hiện nay, phòng chống dịch bệnh đang trở th ành nhu cầu bức bách. Muốn ph òng trị
bệnh có hiệu quả tốt thì cần phải hiểu biết r õ về đối tượng gây hại. Chính v ì thế, em
đã thực hiện đề tài: “Dựa vào đặc điểm hình thái và di truy ền để phân loại một
số loài sán lá đơn ch ủ (Monogenea) thuộc họ Diplectanidae ký sinh trên cá mú
(Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa” với các nội dung nh ư sau:
- Mô tả đặc điểm hình thái các loài sán lá đơn chủ thuộc họ Diplectanidae ký
sinh trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa.
- Lập cây phát sinh lo ài, so sánh đặc điểm di truyền của các lo ài sán lá đơn chủ
thuộc cây phát sinh loài.
2
Phần 1
TỔNG QUAN
1. VÀI NÉT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

1.1. Họ cá mú (Seranidae)
Cá mú là một trong những lo ài cá biển có giá trị kinh tế cao, sống ở v ùng
biển nhiệt đới và cận nhiêt đới. Hiện nay có nhiều loài đang trở thành những đối
tượng nuôi quan trọng nh ư cá Mú Mè (Epinephelus bleekeri), cá Mú Cọp (E.
fuscoguttatus), cá Mú Chấm Đỏ (E. akaara), cá Mú Chuột (Cromileptes altivelis )…
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo Fao, 2003 nh ững loài cá mú trong nghiên c ứu có vị trí phân loại nh ư sau:
Ngành Vertebrata
Lớp Osteichthys
Bộ Perciformes
Họ Serranidae
Giống Epinephelus
Loài Epinephelus spp.
1.1.2. Đặc điểm hình thái
Cá mú rất đa dạng về màu sắc, vân chấm, kích thước và hình dạng thân. Chúng
có thể thay đổi các đặc điểm này theo từng giai đoạn, trạng thái sinh lý hay môi tr ường.
Tuy nhiên, cá mú có những điểm chung như: thân hình thoi cân đối, miệng rộng, hàm
dưới nhô ra hướng lên trên, có nhiều răng nhỏ, sắc nhọn. Cá mú thường chỉ có một vây
lưng với từ 7-11 tia vây cứng và 10-21 tia vây mềm. Vây hậu môn có 3 gai cứng, con
đực hơi dài hơn so với con cái. Nắp mang có 3 gai cứng [10][14][30].
1.1.3. Đặc điểm sinh học và phân bố
Họ cá mú (Serranidae ) có 75 giống và trên 400 loài sống chủ yếu ở vùng
biển cận nhiệt đới, nhiệt đới Thái B ình Dương, Đại Tây Dương và Ấn Độ Dương.
Tại Việt Nam tìm thấy 48 loài thuộc 11 giống, trong đó có kho ảng 14 loài thuộc
3
giống Epinephelus với nhiều loài đang là đối tượng nuôi phổ biến . Điều này cho
thấy thành phần giống loài cá mú tại Việt Nam khá phong phú [10].
Cá mú là loài thích s ống đáy, nơi có rạn san hô và đá ngầm. Đa số các loài phân
bố ở độ sâu nhỏ hơn 100m. Chúng là loài rộng muối, có thể sống đ ược ở độ mặn từ 15-
45‰, tốt nhất ở 20-30‰, sinh sản và phát triển ở 15-35

o
C, thích hợp nhất là 24-30
o
C.
Cá mú là cá dữ, trong tự nhiên thức ăn chủ yếu của chúng l à các loài giáp xác, cá, và
động vật không xương sống, tập tính bắt mồi đặc tr ưng là rình ở các khe đá, bụi rong
và bụi san hô. Cá mú có tốc độ sinh tr ưởng khá nhanh, cá giống 30 -50 g nuôi sau 6-8
tháng đạt 500 g - 1 kg. Nhưng tốc độ này lại khác nhau giữa các lo ài: ví dụ cá Mú Nghệ
(Epinephelus laceolatus ) đạt 3-4 kg/năm, trong khi đó cá Mú Son ( Cephalopholis
miniata) chỉ 0,3-0,4 kg/năm. Cá mú còn có đặc điểm chuyển đổi giới tính, lúc nhỏ l à
con cái, sau một thời gian chuyển thành con đực. Thời điểm và kích thước chuyển đổi
không giống nhau giữa các loài khác nhau [1][15][31].
1.2. Đặc điểm chung về sán lá đ ơn chủ (Monogenea)
Trên thế giới, có khoảng 1500 loài sán lá đơn chủ khác nhau [34], chúng là ký
sinh trùng ngo ại ký sinh được tìm thấy trên bề mặt cơ thể (như: mang, da, vây, niêm
mạc miệng, mũi và mắt cá). Sán lá đơn chủ có chu kỳ phát triển trực tiếp, không
qua giai đoạn ký chủ trung gian, không xen kẽ thế hệ v à cũng không thay đổi ký
chủ. Sán lá đơn chủ hút chất nhầy, biểu mô hoặc máu của ký chủ [ 7][8].
Nhìn chung, cơ thể sán lá đơn chủ có kích thước nhỏ, kích thước chiều dài
khoảng 0.5- vài mm. Chẳng hạn như sán lá ký sinh ở mang (Pseudorhabdosynochus
spp., Diplectanum spp.,…) kích thước nhỏ hơn 1mm; một số giống loài sán lá ký
sinh ở da (như Benedenia spp., Neobenedenia spp.…) kích thước từ 2-6mm có thể
nhìn thấy bằng mắt th ường. Tuy nhiên, có những loài kích thước rất lớn thuộc họ
Capsalidae (Capsala martinieri 27 × 23 mm, Yamaguti 1963, p. 116; E. hippoglossi
24 × 11 mm, Yamaguti 1963, p. 126; N. sturionis 13–14 × 5–6 mm, Yamaguti
1963, p. 133) [45][34].
Các giống loài sán lá đơn chủ ký sinh trên cá nước ngọt hình dạng ít thay đổi,
thường là hình phiến lá, hình sợi mảnh hay bầu dục [1]. Cơ thể sán lá đơn chủ
4
không có gai, bên ngoài bao b ọc bởi lớp nguy ên sinh chất hợp bào mỏng, trong suốt

do tế bào thượng bì phân tiết tạo thành đó là các tầng cơ để bảo vệ cơ thể và giúp cơ
thể vận động được. Phía trước cơ thể có miệng, cơ quan đầu có tác dụng hút thức ăn
và vận động. Cơ quan tiêu hóa, sau mi ệng là hầu, thực quản, ruột h ình ống thẳng
hoặc phân làm hai nhánh [8].
Phía sau cơ thể sán lá đơn chủ có đĩa bám (haptor), cấu tạo gồm các móc lớn ở
giữa (anthor) và các móc rìa (marginal) ở xung quanh, bám sâu và phá ho ại tổ chức
cơ thể của ký chủ mở đ ường cho vi khuẩn, nấm và các vi sinh vật xâm nhập vào gây
viêm loét tổ chức, hút máu v à niêm dịch kích thích cơ thể ký chủ phân tiết ra các
sản vật, phá hoại c ơ năng hoạt động sinh lí bình thường của vật chủ. Đĩa bám sau có
cấu tạo phức tạp và là căn cứ chủ yếu để phân loạ i các giống loài của sán lá đơn
chủ. Thông thường đĩa bám sau có 3 dạng : đĩa bám do chất kitin hình thành nhiều móc
lớn và móc nhỏ (Diplectanidae, Dactylogyridae; Gyrodactylidae); đĩa bám phân th ành
nhiều ngăn, sắp xếp đối xứng, mỗi ngăn có tác dụng hút t hức ăn (Capsalidae…) v à đĩa
bám sau do chất kitin tạo thành đồng thời giữ lại các móc câu thời k ì hậu ấu trùng
(Diclyleothriodae; Mazocraeidae; Discocotylidae; Diplozonidae…) [7].
Ngoài ra, một số loài có tuyến ở phía sau tiết ra ni êm mạc dịch. Hệ thần kinh
và hệ bài tiết đơn giản. Cơ quan sinh dục của sán lá đ ơn chủ đực và cái trên cùng
một cơ thể. Cơ quan sinh dục đực có từ 1 đến nhiều tinh ho àn, thường nằm ở sau
buồng trứng và giữa hai nhánh ruột, ống dẫn tinh liền với cơ quan giao cấu thông
đến xoang sinh dục ở phía tr ước cơ thể. Cấu tạo của cơ quan giao cấu cũng là tiêu
chuẩn quan trọng để phân loại đến lo ài. Lỗ sinh dục ở giữa hoặc một b ên phía sau
đoạn ruột bắt đầu phân nhánh. C ơ quan sinh dục cái có buồng trứng, ống dẫn trứng,
tử cung đến xoang sinh dục, tuyến no ãn hoàng cũng phát triển [7][8].
Chu kỳ phát triển của hầu hết giống lo ài sán lá đơn chủ là đẻ trứng, số ít đẻ
con (Gyrodactylus). Trứng trong cơ thể sau khi thụ tinh theo lỗ sinh dục ra ngo ài,
nhờ cấu tạo có cuống n ên nổi lên mặt nước, bám lên mang cá hay các v ật bám trong
nước. Sau một thời gian trứng nở ra ấu ra tr ùng, cơ thể ấu trùng dài có 4 điểm mắt,
4-5 nhóm lông tơ. Nhờ lông tơ, ấu trùng có thể vận động trong n ước, tìm gặp và
5
bám vào mang, xoang mi ệng, da ký chủ. Ở nhiệt độ 14 -15

o
C cứ 33 phút đẻ một
trứng nhưng nếu nhiệt độ nâng l ên 20 -24
o
C chỉ cần 15 phút. Khi nhiệt độ 30
o
C trở
lên, quá trình đẻ trứng bị ức chế. Thời gian nở của trứng cũng phụ thuộc rất lớn v ào
nhiệt độ của nước [8][16].
Sán lá đơn chủ xuất hiện nhiều tr ên cá thường là chỉ thị của hệ thống nuôi
nghèo nàn và ch ất lượng nước kém. Sán lá đ ơn chủ sinh sản rất nhanh trong điều
kiện nuôi cá với mật độ cao, hàm lượng ammonia hay nitrite cao, ô nhiễm hữu c ơ
hoặc hàm lượng oxy thấp, số l ượng của các loài sán lá đơn ch ủ đẻ con sẽ tăng l ên
gấp đôi trong khoảng 24h. Tỷ lệ sinh sản cũng có thể điều khiển đ ược bằng nhiệt
độ, mặc dù không khác nhau ở vùng nước nhiệt đới (giới hạn hẹp về nhiệt độ) [ 25].
2. TÌNH HÌNH NGHIÊN C ỨU BỆNH SÁN LÁ ĐƠN CH Ủ KÝ SINH TRÊN
CÁ MÚ (EPINEPHELUS SPP.)
2.1. Tình hình nghiên c ứu bệnh sán lá đ ơn chủ ký sinh trên cá mú nói chung
2.1.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Cá mú là một trong những đối t ượng cá biển nuôi quan trọng tại các nước
như Thái Lan, Trung Quốc, Malaysia, Philippine, Singapore, Indonesia, Đài loan và
mang
a. Sán lá trưởng
thành ký sinh
trên da, mang cá
b. Trứng sán
c. Ấu trùng sống tự
do trong nước
d. Hậu ấu trùng tìm
ký ch ủ

Hình 1.1. Vòng đời của sán lá đơn chủ (theo Yani Lestari N. và cs, 2008)
6
Việt Nam từ đầu những năm 1970 [26] . Đến sau những năm 80, công nghiệp nuôi
cá biển ở khu vực này đã gặp phải những vấn đề về bệnh dịch nghiêm trọng, đặc
biệt ảnh hưởng tới cá mú (Epinephelus spp. ) và cá chẽm (Lates calcarifer ). Quy mô
lớn về hợp tác quốc tế sản xuất con giống cũng nh ư sự mở rộng các trại cá l à
nguyên nhân chính gây ra m ột số bệnh KST. Gây hại cá nước mặn chủ yếu l à sán lá
đơn chủ, đặc biệt là các giống loài thuộc họ Capsalidae và Diplectanidae [36].
Ngoài ra, có nhi ều giống loài Monogenea thư ờng xuyên ký sinh trên cá mú nuôi ở
Đông Nam Á thuộc họ Diplectanidae ( Pseudorhabdosynochus epinepheli, P.
coioideis, P. lantauensis , Diplectanum spp.) ; Capsalidae (Allobenedenia spp.,
Benedenia spp., Neobenedenia spp.) ; Dactylogyridae (Dactylogyrus spp.,
Haliotrema spp.) [31][34].
Cuối thập kỷ 80, đầu thập kỷ 90, nghề nuôi cá mú trong lồng nổi ở Đông
Nam Á bị ảnh hưởng bởi một bệnh g ọi là bệnh “cá mú ngủ”. Cá bị bệnh không có
dấu hiệu gì đặc biệt trừ thân cá chuyển m àu tối hơn và chết, chủ yếu vào ban đêm.
Kiểm tra những con cá m àu tối này phát hiện thấy bị cảm nhiễm rất nặng bởi sán lá
đơn chủ thuộc Capsalidae [ 35] và do đó đã mở đường cho tác nhân c ơ hội như virus
và vi khuẩn [36].
Ogawa và cộng sự, 1994 đã đưa ra bảng tổng kết về sự cảm nhiễm B.
epinepheli trên một số loài cá biển Nhật Bản, trong đó có các lo ài cá mú như
Epinephelus akaara, E. moara, E. suillus, E. septemfasciatus [32]. Tại Malaysia, 2
loài sán lá đơn ch ủ A. epinepheli và Benedenia sp là nguyên nhân gây ch ết cá mú
nuôi được báo cáo bởi Leong, 1994 [34], năm 1995, ông và c ộng sự đưa ra thêm
một kết luận là hầu hết cá mú đều cảm nhiễm bởi P. epinepheli [38] .
Cá bị nhiễm nặng sán lá đ ơn chủ có thể bị mù mắt, xuất huyết, tổn th ương tơ
mang ảnh hưởng tới hô hấp hoặc gây lở loét tr ên da mở đường cho các tác nhân c ơ
hội khác xâm nhập gây bệnh. Bệnh này có thể gây chết hàng loạt cá con cỡ 10 -
15cm, cũng có thể gây chết cá lớn nếu c ường độ cảm nhiễm cao [ 36]. Theo Y.
Danayadol, 1994 cá mú nuôi lồng ở giai đoạn nhỏ th ường bị thiệt hại do sán lá đ ơn

chủ, đặc biệt là khi chất lượng nước kém. Bệnh phổ biến v ào mùa khô khi đ ộ mặn
7
của nước lên cao (33-35 ppt). Ở giai đoạn đầu khi bị bệnh, da cá chuyển màu đen
sạm và tới giai đoạn cuối thì bên ngoài bị tổn thương, tuy nhiên tỉ lệ chết thấp hơn
30%. Những con cá bị thương tổn tìm thấy chủ yếu là loài Dactylogyrus spp. [49].
2.1.2. Tình hình nghiên c ứu tại Việt Nam
Năm 2001, ở vịnh Hạ Long, Bùi Quang Tề tìm thấy 4 giống ký sinh trùng,
trong đó 1 giống thuộc họ Diplectanida e là Pseudorhabdosynochus ; 3 giống khác là
Ancyrocephalus , Benedenia và Haliotrema ký sinh trên cá mú nuôi l ồng [8].
Nguyễn Thị Muội 1980, Đỗ Thị H òa 2002, Phan V ăn Út 2006, đã phát hiện
loài B. epinepheli ký sinh trên cá mú nuôi ở Khánh Hòa gây ra bệnh mè cá. Ngoài
ra, trên da của cá biển tự nhi ên cũng bắt gặp loại ký sinh tr ùng này ký sinh với các
thành phần giống loài khác nhau [8][16]. Tại vịnh Hạ Long, Quảng Ninh v à Cát Bà,
Hải Phòng, Benedenia spp. cũng đã được Bùi Quang Tề phát hiện là tác nhân gây
chết hàng loạt cho cá mú nuôi b è [8].
Kết quả nghiên cứu về KST ký sinh ở cá mú (Epinephelus spp.) nuôi lồng tại
vịnh Hạ Long của B ùi Quang Tề và ctv cho thấy loài sán lá đơn ch ủ P. epinepheli
và Ancyrocephalus sp ký sinh ở mang của 3 loài cá (Mú Mỡ (Epinephelus tauvina ),
Mú Chuối (E. resfaxciatus), Mú Sáu Sọc (E. moara) với tỉ lệ cảm nhiễm cao 71,4 %
– 93,8% [7]. Phan Văn Út, 2006 cho bi ết các bệnh do Monogenea ký sinh ở cá mú
nuôi tại Khánh Hòa có tần số bắt gặp cao: 71,4% hộ phỏng vấn gặp bệnh m è cá (do
Benedenia và Neobenedenia ký sinh trên da) và 60,3% g ặp bệnh sưng mang [16].
Bệnh do sán lá đ ơn chủ ký sinh trên cá mú là một bệnh khá nguy hiểm n ên đã
có rất nhiều thử nghiệm phòng trị bệnh này, tham khảo một số phương pháp sau:
Biện pháp phòng bệnh: Sán lá đơn chủ là tác nhân gây b ệnh ký sinh trùng rất
phổ biến trên cá mú (và cá giò) ở hầu hết các giai đoạn khác nhau từ cá giống đến
cá nuôi thương ph ẩm. Việc điều trị nhóm tác nhân gây bệnh sán lá đ ơn chủ gặp
nhiều khó khăn do các loại hoá chất chỉ có khả năng ti êu diệt được sán lá đơn chủ ở
giai đoạn đang phát triển m à không có tác d ụng ở giai đoạn ấu tr ùng. Thêm vào đó,
khi sử dụng hoá chất hoặc tắm cá bằng n ước ngọt, sán lá đơn chủ tách khỏi vật chủ

và bám vào thành l ồng nuôi. Khi có điều kiện thuận lợi chúng lại tấn công vật chủ.
8
Vì vậy, việc phòng nhóm tác nhân gây b ệnh này có ý nghĩa quan trọng. Các ph ương
pháp phòng bệnh chủ yếu đối với nhóm tác nhân gây bệnh sán lá đ ơn chủ là kiểm
tra con giống trước khi mua về. Cá giống n ên được tắm bằng nước ngọt trong thời
gian 10-20 phút trước khi thả. Trong quá tr ình nuôi thường xuyên vệ sinh lồng lưới,
cũng như vớt bỏ thức ăn thừa h àng ngày, hoặc thay lồng nuôi khi cần thiết.
Biện pháp trị bệnh: k ết quả thực nghiệm cho thấy tắm cá bằng n ước ngọt là
một trong những biện pháp có hiệu quả cao trong điều trị bệnh sán lá đ ơn chủ. Tuy
nhiên, việc tắm cá bằng n ước ngọt trong 10 -25 phút chỉ có tác dụng làm cho sán lá
đơn chủ rời khỏi vật chủ. V ì vậy, nước chứa sán lá đ ơn chủ sau khi tắm cần đ ược xử
lý bằng 20-30ml chlorin/m
3
hoặc 300ml formalin/m
3
.
Việc điều trị bệnh sán lá đ ơn chủ bằng nước ngọt nên được lặp lại 2-3 lần
vào các ngày ti ếp theo nhằm đạt hiệu quả trị bệnh cao. Đây l à biện pháp trị bệnh cá
biển nuôi lồng rất phổ biến hiện nay, tuy nhi ên sau nhiều lần xử lý bằng n ước ngọt
một số loài sán lá đơn chủ có thể thích ứng với n ước ngọt. Vì vậy, việc tắm cá bằng
nước ngọt trong thời gian 10 -15 phút, sau đó s ử dụng thêm một trong các loại hoá
chất sau nhằm tăng hiệu quả trị bệnh nh ư tắm formalin với nồ ng độ 150-250ml/m
3
nước hoặc oxy già với nồng độ 150 ml/m
3
nước trong 10-15 phút tuỳ theo điều kiện
sức khoẻ cá.
Việc điều trị bệnh cá bằng ph ương pháp tắm thường làm cá bị trầy xước tạo
điều kiện cho các tác nhân gây bệnh thứ cấp nh ư vi khuẩn và nấm tấn công. Vì vậy,
việc kết hợp sử dụng một v ài loại thuốc kháng sinh đ ược phép sử dụng trong nuôi

trồng thủy sản nh ư Oxytetrecyclin, Erythromycin, S treptomycin tắm cho cá trong
thời gian cuối có ý nghĩa quan trọng trong việc ph òng ngừa tác nhân gây bệnh thứ
cấp tấn công [17].
Biện pháp tắm Oxy gi à (H
2
O
2
) 100 ppm hay formalin (100 ppm) trong 10 - 15
phút có hiệu quả khi điều trị bệnh n ày theo Cruz-Lacierda và ctv, 2004 [7].
Các biện pháp dùng hóa chất để trị bệnh sán lá đ ơn chủ cho cá ít nhiều cũng sẽ
ảnh hưởng đến sức khỏe cá, đặc bi ệt khi cá đang bị bệnh . Do vậy để phòng bệnh sán
lá đơn chủ cho cá nuôi, các trang trại nuôi cá cần có kỹ thuật quản lý tốt để l àm hạn
9
chế sự phát triển của ký sinh tr ùng, ví dụ cắt đứt vòng đời phát triển của chúng, hay
di chuyển cá nuôi ra khỏi v ùng có ấu trùng của sán lá đơn chủ [26][19].
2.2. Tình hình nghiên cứu họ Diplectanidae (Monogenea, Monopiscotylidae) ký
sinh trên cá mú ( Epinephelus spp.)
2.2.1. Trên thế giới
Họ Diplectanidae Monticelli, 1903 ký sinh trên mang cá x ương thuộc họ cá
vược và có thể gây hại trên toàn thế giới [23], đã có rất nhiều nghiên cứu về khả
năng gây bệnh của một số lo ài thuộc Diplectanidae [23][37][27] và chúng được coi
là mối đe dọa tới sức khỏe vật nuôi. Nguy ên nhân của bệnh là kết quả của sự xuất
hiện quá nhiều sán lá đ ơn chủ, sự sinh sản phụ thuộc v ào nhiệt độ, và khi vật chủ
phải sống một thời gian d ài trong môi trường khắc nghiệt. Những nghi ên cứu xa
hơn về sự xuất hiện của họ Diplectanidae trên cá xương, phân biệt nguyên nhân gây
bệnh ký sinh trùng là cần thiết nếu muốn mở rộng quy mô nuôi cá và ngăn chặn
những dạng ký sinh đặc hữu [ 23] [21].
Trước kia, Diplectanidae Monticelli, 1903 bao g ồm 5 họ phụ Diplectaninae
Monticelli, 1903, Lamellodiscinae, Oliver, 1969, Murraytrematoidinae Oliver, 1982,
Rhabdosynochinae Oliver, 1987 and Rhamnocercinae Monaco, Wood & Mizelle, 1954

(Oliver, 1897). Tuy nhiên, theo nghiên cứu mới nhất (Domingues & Boeger, 2008) 2 họ
phụ Diplectaninae Monticelli, 1903 và Lamellodiscinae được cộng nhận và 2 họ phụ
Nasobranchitrematinae n. subfam và Pseudomurraytrematoidinae n. subfam được đề nghị.
Họ Diplectanidae, họ phụ Diplectaninae có các gi ống
Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958; Diplectanum Diesing, 1858; Lobotrema
Tripathi, 1959, Lepidotrema Johnston & Tiegs, 1922 , Spinomatrix Boeger, Fehlauer
& Marques, 2006. Theo cách truy ền thống, sự phân loại họ Diplectanidae đ ã có căn
cứ, xét ở phạm vi rộng, đó l à dựa vào hình thái các ph ần cứng của đĩa bám (haptor)
[18]. Có 2 giống của họ này (thuộc họ phụ Diplectaninae Monticelli, 1903) là hạt
nhân quan trọng bởi vì có nhiều tranh luận về vị trí phân loại v à vị trí phát sinh của
vài loài trong chúng, t ập trung vào một số nghiên cứu (ví dụ Oliver, 1968; Kritsky
& Beverley-Burton, 1986) [45]. Giống thứ nhất, Diplectanum Diesing, 1858 có đ ặc
10
điểm là đĩa bám bắt đầu ở chỗ thắt lại của c ơ thể, với hai cặp móc bám (hamuli), 3
thanh nối (transverse bars), giác bám l ưng (dorsal squamodiscs) và b ụng (ventral
squamodiscs) đư ợc tạo thành từ các hàng gai cứng [48]. Thứ hai, giống
Pseudorhabdosynochus Yamaguti, 1958 đư ợc mô tả bởi sự có mặt của một c ơ quan
giao cấu đực, có liên kết cứng, được chia ngăn, hình bầu (bulb-sharp). Chúng đã
được báo cáo ký sinh tr ên nhiều loài cá, chủ yếu là cá mú (Serranidae) ở khắp các
vùng nước ấm của các đại d ương trên thế giới [33].
Các loài P. sulamericanus (Santos, 2000), P. beverleyburtonae (Oliver,
1984) thu thập trên cá mú ở Rio de Janeiro, Bra zil - nơi có tiềm năng phát triển nuôi
mặn - đã được mô tả và mô tả lại chi tiết bởi Santos và cs, 2000. Đồng thời, trong
báo cáo này ông c ũng đã thiết lập danh sách 17 loài Pseudorhabdosynochus spp.
cảm nhiễm trên các loài cá mú ( Epinephelus spp.) với vị trí địa lý và đặc điểm chính
của giác bám [23].
Justine, 2005 đã bổ sung vào danh sách các loài thu ộc giống
Pseudorhabdosynochus (do Santos, 2000 đ ã nêu) hai loài, đó là P. coioidesis Bu,
Leong, Wong, Woo & Foo, 1999 (từ cá Mú Đen E. coioides và E. areolatus ở
Malaysia, Hong Kong và Indonesia) và P. chinensis Zhang, Yang & Liu, 2001 (t ừ

cá Mú Mỡ E. tauvina ở Trung Quốc) [29].
Trên thế giới, có 159 lo ài cá mú thuộc họ phụ Epinephelinae đ ã biết, bao
gồm 98 loài thuộc giống Epinephelus Bloch [28]. Tuy nhiên, các loài Epinephelus
có thể là á huyết thống (paraphyletic) [24] và họ Diplectanidae thường là những loài
đặc hữu nên có thể dự đoán rằng còn rất nhiều loài thuộc họ Diplectanidae nói
chung cũng như thuộc giống Pseudorhabdosynochus nói riêng chưa đư ợc biết đến
[29]. Hệ thống các loài sán lá này đã thực sự được quan tâm, thêm vào đó, để hiểu
hơn về tính đa dạng sinh vật biển [ 29].
New Caledonia - một phá rộng nhất tr ên thế giới - có ít nhất 44 loài cá mú
thuộc giống Epinephelus và hầu hết chúng là nơi ẩn náu của các loài thuộc họ
Diplectanidae [29].
11
2.2.2. Việt Nam
Đỗ Thị Hòa, 2003 cho biết tại khu bảo tồn H òn Mun, cá mú con nuôi lồng cỡ
10-15cm đã bị chết hàng loạt do cảm nhiễm bởi P. epinepheli với mật độ rất cao [8].
Phạm Thị Sinh, 2004 t ìm thấy P. epinepheli ở cá Mú Đen E. coioides [16] và
Phan Văn Út, 2006 xác đ ịnh 2 loài thuộc giống Pseudorhabdosynochus là P.
epinepheli và P. sp, 2 loài thuộc giống Diplectanum ký sinh trên mang m ột số loài
cá mú nuôi (Epinepheli spp.) tại Khánh Hòa [16].
Từ năm 2005 – 2007, Võ Thế Dũng và cs đã có 3 nghiên cứu về ký sinh
trùng trên cá mú (Epinephelus spp.) tại Khánh Hòa: báo cáo thứ nhất năm 2005,
phát hiện 4 loài Monogenea thuộc họ Diplectanidae là P. epinepheli, P. coioides, P.
sp, D. grouperi ở một số loài cá mú tự nhiên, nuôi lồng, nuôi ao [4]; báo cáo thứ 2
năm 2007, tìm thấy 7 loài đó là D. grouperi, P. epinepheli, P. coioides, P.
lantauensis, P. summanae, P. summanoides, P. serrani ký sinh trên cá mú nuôi l ồng
và nuôi ao [5]; báo cáo thứ 3 cùng năm 2007, phát hiện 3 loài D. grouperi, P.
epinepheli, P. lantauensis trên cá mú tự nhiên [6].
2.3. Tình hình nghiên cứu đặc điểm di truyền các lo ài sán lá đơn chủ
Người ta đã ứng dụng di truyền t rong các nghiên cứu về sán lá đơn chủ bởi
có rất nhiều tranh luận về vị trí phát sinh của các lo ài của chúng. Người ta khó nhận

biết được rằng những sai khác về đặc điểm h ình thái của một số loài là biến dị trong
loài (do khác biệt về ký chủ, vùng địa lý) hay là hai loài hoàn toàn khác nhau? Ví dụ,
Bu & cs, 1999 thông báo sự khác nhau về hình dạng của thanh nối lưng (dorsal bar) và
cơ quan giao cấu cái (vargina) của P. lantauensis (từ cá E. coioides ở Malaysia và
Indonesia, cá E. aerolatus ở Hong Kong) với P. lantauensis trong mô tả gốc của
Beverley – Burton & Suriano, 1981 ( ở cá E. bruneus và E. fario tại Hong Kong) [47].
Di truyền học sẽ trả lời đ ược điều đó bởi bộ gen trong c ùng một loài thì khác
nhau rất ít cho dù hình dạng có thay đổi. Có thể sử dụng các chỉ thị di truyền để
nghiên cứu đặc điểm di truyền ở mức độ kiểu gen.
12
* Chỉ thị di truyền (genetic marker) :
Một số chỉ thị đ ược sử dụng phổ biến l à: biểu diễn trình tự DNA (DNA
sequence), ribosomal DNA, protein (allozymes), DNA ti th ể (mt DNA marker), đa
hình chiều dài các đoạn DNA được cắt bởi các enzyme giới hạn ( Restriction
frangment length polymorphir m - RFLP marker), đa h ình các đoạn DNA được
khuếch đại ngẫu nhi ên (Random amplified polymorphism DNAs - RAPD marker),
đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại ( Amplified frangment length
Polomorphism - AFLP marker), khu ếch đại các đoạn lặp đ ơn giản (SSR – Simple
Sequence Repeats) hay còn g ọi là tiểu vệ tinh (microsatellites marker), đa h ình
nucleotide đơn (SNP marker). Mỗi loại chỉ thị có nguyên tắc và phạm vi ứng dụng
khác nhau [39].
Ribosomal DNA là 1 gen bao gồm 3 đoạn gen: 18S, 5.8S, 28S và 2 đo ạn
chèn giữa gen đó là ITS1 (chèn gi ữa 18S và 5.8S), ITS2 (chèn gi ữa 5.8S và 28S)
[40]. 28S là đoạn gen lớn nhất của ribosomal DNA, có khả năng đặc tr ưng cho loài
nghiên cứu và được sử dụng trong các nghi ên cứu về di truyền. Trong thực tế người
ta thường sử dụng 1 đoạn gen và/hoặc 1 đoạn chèn giữa gen để làm chỉ thị trong
nghiên cứu, ví dụ X. Y. Wu, 2004, 2005; I.D.Whittington, 2004; …[45][45][47].
Năm 2004, Whittington và cs dùng đoạn gen 28S để nghiên cứu mối quan hệ
phát sinh loài của 17 loài thuộc họ Capsalidae (Monocotylidae và Udonellidae được
sử dụng làm nhóm ngoại). Kết quả cho thấy Capsalinae, Encotyllabinae,

Entobdellinae và T rochopodinae có cùng tổ tiên còn Benedeniinae là không cùng tổ
tiên, trong đó giống Neobenedenia hiện tại thuộc họ phụ Benedeniinae nên tách
riêng sang 1 họ phụ khác [45]. Wu và cs (2004) dựa vào đoạn chèn giữa gen ITS1
và trình tự DNA ribosome ti ểu phần lớn - 28S (lsr DNA) đã phân tách được 2 loài
cận giống, mà trước đây bị coi là cùng loài P. latauensis thu trên cá E. coioides và
E. bruneus tại Quảng Đông, Trung Quốc [ 47]. Ngoài ra, loài Diplectanum grouperi
Bu, Leong, Wong, Woo & Foo, 1999 tìm th ấy trên cá Mú Đen E. coioides được đề
nghị chuyển sang giống Pseudorhabdosynochus do gần gũi về mặt di truyền với
giống này [45].
13
Phần 2
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C ỨU
1. Thời gian, địa điểm, đối tượng nghiên cứu
*Thời gian: thực hiện đề tài từ 27/08/2008 đến 08/11/2008.
Thu mẫu từ tháng 01/2008
*Địa điểm thực hiện:
- Thu mẫu cá mú nuôi và tự nhiên tại một số địa điểm: Cam Ranh, Nha Trang
(Bình Tân, Cầu Đá, Bãi Trụ) thuộc Khánh H òa (xem phụ lục 1).
- Tìm, phân loại KST tại Viện Công nghệ sinh học v à môi trường–ĐH Nha Trang.
*Đối tượng nghiên cứu: sán lá đơn chủ ký sinh trên cá mú (Epinephelus spp.)
tại Khánh Hòa như: cá Mú Đen (E. coioides), Cá Mú Mè ( E. bleckeri), Mú Sọc
Ngang (E. fasciatus), Mú Vạch E. bruneus, Mú Chấm Tổ Ong (E. merra), Mú Đen
(E. coioides) (xem phụ lục 2).
Bảng 2.1. Số lượng và kích cỡ các mẫu cá mú
Kích cỡ
Tên loài ký chủ
Số lượng
(con)
khối lượng (g)
chiều dài (cm)

tự nhiên
31
57,37±11,23
10,05±1,3
Cá Mú Đen
(Epinephelus coioides )
nuôi
38
603,13±289,2
32,45±4,5
tự nhiên
11
236±45,12
25,5±1,6
Cá Mú Mè
(E. bleckeri)
nuôi
7
247,5±67,24
22,8±4,17
Cá Mú Chấm Tổ Ong
(E. merra)
tự nhiên
27
50,1±9,6
15,6±2,49
Cá Mú Sọc Ngang
(E. fasciatus)
tự nhiên
19

83,48±12,35
18,35±1,32
Cá Mú Vạch
(E. bruneus)
tự nhiên
23
54,8±7,86
14,9±2,5
(Số liệu trong bảng đ ược trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± SD)
14
2. Phương pháp nghiên c ứu
2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu
2.2. Phương pháp nghiên c ứu hình thái sán lá đơn chủ ký sinh trên cá
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng một số ph ương pháp nghiên c ứu
ký sinh trùng ở cá của Dogiel (1929) và của Hà Ký (1992), Berland (2005).
2.2.1. Thu mẫu
- Thu mẫu cá mú (Epinephelus spp.) ngẫu nhiên ở giai đoạn cá th ương phẩm
tại Khánh Hòa.
- Thu cá nuôi và cá tự nhiên khi còn sống.
Thu mẫu cá
Kiểm tra, thu thập KST
Quan sát mẫu tươi dưới
KHV quang học
Cố định, làm tiêu bản
KST
Đo, đếm, vẽ, chụp hình
KST
Định danh KST
Giữ KST trong nước cất
hoặc cồn 70-100

o
Tách chiết DNA
Chạy PCR
Chạy điện di
Giải trình tự gen
Lập cây tiến hóa
Tổng hợp, so sánh các lo ài KST
Kết luận và đề xuất ý kiến
Hình 2.1. Sơ đồ khối nội dung nghi ên cứu
15
2.2.2. Xử lý và phân tích mẫu
- Đựng cá trong thùng xốp, vận chuyển về ph òng thí nghiệm và sục khí liên
tục cho tới khi tiến h ành kiểm tra, giải phẫu cá. Thao tác cân, đo cá nhanh đ ể cá
không bị khô nhớt. Ghi lại t ình trạng cá, địa điểm thu, số liệu cân, đo, v à ngày tháng
một cách chính xác.
- Tiến hành kiểm tra sán lá đơn chủ: đây là những KST ngoại ký sinh, chúng
thường có mặt trên mang, da, vây, m ắt, hốc mũi của cá nên cơ quan được kiểm tra
là mang, da, vây cá.
* Kiểm tra da, vây cá: quan sát bằng mắt th ường để phát hiện những KST có
kích thước lớn. Cạo nhớt da, chú ý cạo ở gốc vây, mắt và hốc mũi, dàn đều lên lam,
nhỏ nước biển sạch rồi đậy lamel quan sát trên kính soi n ổi (KSN) (hiệu Olympus
SZX9, số serial SZX9 – 3122) trước rồi sau đó quan sát ở kính hiển vi (KHV) (hiệu
Olympus BX41, số serial 2K07583) độ phóng đại tăng dần (từ 4X đ ến 40X). Nếu mẫu
cá to thì cạo nhớt vào hộp lồng đựng nước muối biển, đem quan sát dưới KSN. Khi
phát hiện sán lá đơn chủ thì thu mẫu làm tiêu bản để xác định cường độ cảm nhiễm.
* Kiểm tra mang: d ùng kéo cắt rời xương nắp mang cá, quan sát v à ghi lại
những dấu hiệu bất th ường ở mang. Sau đó, cắt rời từng cung mang bỏ v ào hộp lồng
đựng nước biển sạch, quan sát d ưới KSN. Lấy kẹp và kim giải phẫu vạch từng t ơ
mang để quan sát. Nếu phát hiện thấy KST, tách ri êng tơ mang có trùng đưa lên lam
kính và tách trùn g để quan sát dưới KHV. Định lượng trùng trên toàn bộ mang.

(Nếu không đủ thời gian l àm hết mẫu thì bảo quản mẫu trong cồn 70
o
hoặc Formol
4%, sau đó định lượng tiếp).
2.2.3. Cố định và làm tiêu bản KST
Khi phát hiện thấy KST thuộc họ Diplectanidae th ì giữ lại làm tiêu bản.
- Cố định: dùng cồn 70º hoặc Ammonidium picrate nhỏ lên trùng. Nếu số
lượng trùng nhiều có thể giữ tr ùng trong tube c ồn 70º hoặc cồn tuyệt đối nếu mẫu
dùng cho nghiên c ứu DNA.
- Làm tiêu bản: Nếu mẫu giữ trong cồn, cầ n phải làm trong lại bằng lactophenol,
cố định lại trong cồn. Dùng vaseline chấm vào 4 góc của lamel, đậy lên lam đã có trùng
được cố định, gắn tiêu bản bằng Bom Canada hoặc dán keo, ghi etyket.
16
2.2.4. Đo, đếm và lưu giữ hình ảnh KST
- Phương pháp đo: đo KST b ằng thước đo thị kính của KHV. Cần đo một số
chỉ tiêu như sau: chiều dài, rộng (tại vị trí rộng nhất) của cơ thể trùng; kích thước
của cơ quan giao cấu đực, cái; kích th ước các móc bám (đo theo h ình 2.3). Đo hết
toàn bộ trùng được làm tiêu bản.
* Thước đo của trắc vi thị kính: 4X: 40 vạch = 1 mm; 10X: 1 vạch = 0,01 mm;
40X: 20 vạch = 0,05 mm; 100X: 50 vạch = 0,05 mm
- Phương pháp đ ếm: vì đối tượng KST trong nghi ên cứu thuộc họ
Diplectanidae nên yêu c ầu phải xác định đ ược giống/loài (như vậy có thể đếm sau
khi soi tươi và đ ịnh danh).
+ KST trên da: m ỗi con cá lấy 3 lam nhớt da để đếm v à đếm toàn bộ trùng
trên từng lam, sau đó tính c ường độ cảm nhiễm trung b ình trên 1 lam.
+ KST trên mang: n ếu số lượng ít, đếm to àn bộ trùng trên mang. N ếu số
lượng nhiều, đếm tất cả sán lá đ ơn chủ ký sinh trên một cung mang, mỗi con cá đếm
3 cung mang và tính cường độ cảm nhiễm tru ng bình trên 1 cung mang.
Số cá có trùng
TLCN =

Số cá kiểm tra
* 100
Số trùng
CĐCN =
Cơ quan (hoặc bộ phận cơ quan)
a
b
Hình 2.2. Mô tả cách đo Monogenea (theo Justin, 2007) . A – cơ quan giao cấu đực
(a-chiều dài, b-chiều rộng), B – cơ quan giao cấu cái, C – móc bám lưng,
D – móc bám bụng, E – thanh nối lưng, F – thanh nối bụng.
IL – chiều dài phía trong, OL – chiều dài phía ngoài.
17
- Chụp hình và vẽ KST: trong quá trình soi t ươi hoặc quan sát tiêu bản có
thể kết hợp chụp h ình trùng bằng máy tính kết nối KHV (số serial: US00203669)
hoặc máy ảnh kỹ thuật số. Sau đó vẽ tr ùng (tốt nhất vẽ khi quan sát tr ên KHV vì có
thể nháy vi cấp để xem những nét khuất của hình ảnh).
2.2.5. Định danh
Các KST được định danh dựa v ào một số chỉ tiêu như sau: hình dạng, kích
thước cơ thể trùng, cơ quan giao c ấu đực, cái, các móc bám; kiểu đĩa bám; h ình
dạng, số lượng hàng gai, vị trí của giác bám (Theo một số bài báo liên qu an đăng
trên các tạp chí quốc tế nh ư Journal of Fish Disease, Systematic Parasitology) .
2.3. Phương pháp nghiên c ứu di truyền sán lá đ ơn chủ
2.3.1. Chuẩn bị mẫu
Sau khi thu thập, soi tươi, quan sát và phân lo ại sơ bộ KST dựa trên đặc điểm
hình thái, dùng pipet te thủy tinh hút riêng từng cá thể trùng vào tube Eppendorf 1.5
mL đã vô trùng có chứa 5 µl nước cất hoặc cồn tuyệt đối. Ghi etyket, giữ trong tủ
đông (-20 đến -70
o
C) đối với mẫu giữ trong n ước cất.
2.3.2. Phương pháp tách chi ết DNA

* Nguyên tắc: mọi nghi ên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu
bằng việc thu nhận một l ượng nucleic acid đủ lớn v à đủ tinh sạch để tiến h ành
các thí nghiệm tiếp theo. Cần tách chiết nucleic acid trong điều kiện nhiệt độ
thấp để ức chế hoạt động của các enzyme nội b ào (deoxyribonuclease -Dnase,
ribonuclease -Rnase) [2].
* Tiến hành: Áp dụng quy trình tách chiết DNA của h ãng Promega
[ (M ột số chi tiết trong quy tr ình được điều chỉnh để
phù hợp với mẫu thực).
- Chuẩn bị mẫu:
Bước 1: Giải đông tube chứa tr ùng, soi dưới kính giải phẫu để biết chắc chắn có
trùng. Đối với mẫu giữ tro ng cồn tuyệt đối, cho riêng từng cá thể vào tube ependorf,
để tự nhiên cho cồn bay hơi hết trước khi tiến hành tách chiết.
Bước 2: Thêm 27,5 µL dung d ịch (dd) ly trích (Digestion Solution Master Mix) vào
mỗi tube mẫu đã ghi nhãn đầy đủ. Thành phần và thể tích dd ly trích (xem bảng 2.1.)
18
Bảng 2.2. Thành phần và thể tích dd ly trích
Thành phần
Thể tích/mẫu (µL)
Nuclei Lysis Solution
0,5M EDTA (pH 8,0)
Proteinase K, 20 mg/mL
Rnase A Solution, 4 mg/mL
20
5
2
0,5
Tổng thể tích
27,5
Tính thể tích cần pha theo công thức:
V

dd
= V/mẫu x (số mẫu + 1)
Bước 3: Ủ các tube mẫu ở 55 -56
o
từ 4-5 giờ hoặc qua đêm bằng máy ổn nhiệt
(heating block).
Bước 4: Lấy mẫu đã ủ ra, thêm vào mỗi mẫu 250 µL dung dịch (dd) đệm phân giải
(Lysis Buffer) Wizard
®
SV. Trộn đều dd trong tube bằng máy Vortex.
Bước 5: Quá trình phân gi ải diễn ra nhanh chóng sau khi th êm dd đệm phân giải.
- Tách chiết DNA từ dịch ta n (sử dụng máy ly tâm - Microcentrifuge)
Bước 6: Lắp tube hình trụ có màng lọc vào tube thu nhận sản phẩm thừa sau ly tâm.
Bước 7: Ly tâm phức tube 13000 v òng/phút trong 3 phút.
Bước 8: Nhấc ống hình trụ nhỏ ở bên trên ra, loại bỏ dung dịch trong ống thu ở
dưới. Đặt ống hình trụ nhỏ trở lại như cũ.
Bước 9: Thêm 650 µL dd r ửa (Wash Solution) Wizard
®
SV (đã pha với 95% cồn
theo hướng dẫn cuả nhà sản xuất) vào mỗi phức tube. Ly tâm 13000 v òng/phút
trong 1 phút. Loại bỏ dd ở ống thu. Lặp lại b ước này 2-3 lần.
Bước 10: Loại bỏ dd trong ống thu. Ly tâm 13000 v òng/phút trong 2 phút để làm
khô chất gắn trên màng lọc (binding matrix).
Bước 11: Chuyển ống hình trụ nhỏ sang tube Eppendorf 1,5 mL mới. Th êm 30 µL
dd Nuclease – Free Water ở nhiệt độ phòng. Ủ 2 phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 12: Ly tâm phức tube (minicolumn/elution assembly) vừa tạo 13000
vòng/phút trong 1 phút. Không lo ại bỏ dung dịch trong tube rửa trôi (elution tube).
Bước 13: Thêm một lần nữa 30 µL dd Nuclease – Free Water. Ủ 2 phút ở nhiệt độ
phòng. Ly tâm phức tube (minicolumn / elution tube) 13000 v òng/phút trong 2 phút.
Bước 14: Loại bỏ ống hình trụ nhỏ và lưu giữ tube chứa DNA tinh sạch trong tủ

đông -20
o
C cho các thí nghi ệm tiếp theo.