ảnh hưởng của ph nước rửa tới chất lượng tiêu bản nhuộm pas

1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cùng với sự phát triển vượt bậc của nền Y học Thế giới nói chung
và Y học Việt Nam nói riêng, hiện nay có rất nhiều phương pháp dùng để
hỗ trợ chẩn đoán bệnh với độ chính xác cao như: các phương pháp chẩn
đoán hình ảnh như CT-scan,PET/CT , chụp cộng hưởng từ MRI…hay các
xét nghiệm cận lâm sàng như Hóa sinh, Vi sinh, Huyết học, Sinh học phân
tử và Mô bệnh học…
Là một bộ phận quan trọng của khoa học những tổn thương, xét nghiệm
tế bào-mô bệnh học nghiên cứu những tính chất, đặc điểm của tổn thương,
thuộc phạm vi tổ chức và tế bào. Nó còn cho phép tìm hiểu những nguyên
nhân gây ra những tổn thương ấy, giải thích cho cơ chế sinh bệnh cũng như
những quy luật phát sinh, phát triển của tổn thương, phục vụ cho bệnh nhân
và công tác giảng dạy, nghiên cứu khoa học. Trong bệnh học, đây là xét
nghiệm có độ tin cậy cao, độ chính xác lớn, nếu như kỹ thuật tiến hành đúng
quy tắc và người đọc có kinh nghiệm nhất định.
Trong chẩn đoán mô bệnh học, việc đánh giá các tổn thương trên tiêu
bản nhuộm Hematoxylin-Eosin là nền tảng chẩn đoán. Bên cạnh đó, Bộ môn
Giải Phẫu Bệnh trường Đại học Y Hà Nội vẫn xem kỹ thuật nhuộm Periodic
Acid Shiff là một trong số những kỹ thuật nhuộm hàng ngày. Tuy nhiên kết
quả nhuộm vẫn bị âm tính giả,dương tính giả nên ảnh hưởng tới chẩn đoán và
chỉ định điều trị của bác sĩ.
Là một sinh viên cử nhân kỹ thuật y học, em chọn đề tài: “Ảnh hưởng
của pH nước rửa tới chất lượng tiêu bản nhuộm PAS” làm khóa luận với
mục tiêu sau:
2
1. Thực hiện thành thạo kỹ thuật nhuộm Periodic Acid Shiff và các
kỹ thuật nhuộm thường quy khác.
2. Bước đầu đánh giá được sự bắt màu của chất nhầy qua sự ảnh
hưởng của pH nước rửa và một số yếu tố ảnh hưởng.
3

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.1 ĐẠI CƯƠNG VỀ POLYSACCHARIDE [4]
Chất nhầy và glycogen được coi như là hai thành phần chính của
carbohydrate có trong mô, trong đó chất nhầy là thành phần lớn nhất, bao
gồm 'mucopolysaccharides', 'mucosubstances' và 'glyconjugates’. Thuật
ngữ đầu tiên là 'mucin' đã được nói đến trong cuốn sách của một công dân
người Mỹ tên là Carpenter từ năm 1846 ( Mercer 1978). Nhiều thuật ngữ
sau thay đổi thành 'mucins' phụ hợp với tính chất phức tạp của các chất này
bắt đầu xuất hiện.
Vai trò chuyển hóa trong cơ thể được thực hiện bởi glycogen với tiền
chất là glucose, nhưng các chức năng chính xác của chất nhầy vẫn chưa được
hiểu biết đầy đủ. Hầu hết các bề mặt tế bào được phủ một lớp chất nhày có
chức năng chính là bôi trơn, nhưng có ý kiến cho rằng lớp chất nhầy phủ này
cũng tạo ra một môi trường thuận lợi cho sự khuếch tán các phân tử ion. Bằng
chứng đã được chứng minh bởi sự tăng kết dính của tế bào với sự tham gia
của mucins đặc trưng được xác định trên bề mặt tế bào (Rambourg 1971). Các
báo cáo khác được công nhận (Parsons & Mulholland 1978) đã chỉ ra rằng lớp
màng chất nhầy biểu mô trong bàng quang có thể tác động chống dính trên vi
khuẩn làm cho chúng bị cuốn trôi bởi dòng nước tiểu.
Các chất bắt đầu được các tác giả tiến hành nghiên cứu từ giữa thế kỷ
XIX, nghiên cứu glycogen của Bernard, và mucin từ sụn (sau này được gọi là
"chondroitinsulphate ') được nghiên cứu bởi Fischer & Boedeker. Giữa thập
niên 1930 'lyoglycogen' và 'desmoglycogen’, các hình thức hòa tan và không
hòa tan tương ứng được mô tả đặc điểm bởi Willstatter & Raldenward, cũng
4
vào khoảng thời gian đó, axit hyaluronic được xác đinh bởi Palmer & Meyer.
Những năm 1930 Blix đã được phân tách được chất nhầy biểu mô quan trọng
là 'sialic' hoặc axit 'neuraminic' trong khi đó mặc dù cố gắng phân loại các
chất nhầy của mô liên kết nhưng không thể tìm ra mãi cho tới cuối những

năm 1950. Hầu hết các kỹ thuật trước đó sử dụng iode hoặc nhuộm lạc sắc
phức tạp nhưng ngày nay các kỹ thuật đó đã dần được cải tiến thành những kỹ
thuật chuẩn, chẳng hạn như Carmine của Best năm 1906, periodic acid Schiff
(PAS) của McManus (1946), Alcian blue bởi Steedman và aldehyde fuchsin
của Gomori đều vào năm 1950…
Trong bệnh lý cũng vậy, những bất thường đặc biệt của quá trình
chuyển hóa carbohydrate đã được nghiên cứu và phân loại; các
mucopolysaccharidoses 'đầu tiên được mô tả bởi Hunter vào năm 1917 và
"glycogenoses' bởi von Gierke trong năm 1929. Vào thời điểm đó, có nhiều
kỹ thuật sử dụng gọi là "hóa mô” đã được so sánh với các phương pháp “kinh
nghiệm”, mặc dù có tương đối ít thông tin về những gì sẽ xảy ra khi thuốc thử
Schiff kết hợp với nhóm aldehyde. Sự kết hợp kỹ thuật xanh alcian-PAS bởi
Mowry trong năm 1956, phân biệt các chất nhầy axit và trung tính đã được
kiểm nghiệm và thể hiện như một kỹ thuật hữu ích để phát hiện dị sản ruột.
Trong chẩn đoán u, kỹ thuật hóa mô và hóa mô miễn dịch có thể được sử
dụng song song để xác định chính xác hơn loại khối u hay nguồn gốc của u, ví
dụ như trong ung thư biểu mô tuyến.
Gần đây, nhờ sự phát triển kỹ thuật nhân bản cDNA, đã cho kết quả
phân lập được mười loại gen khác nhau, nâng cao được sự hiểu biết của
chúng ta về một nửa số peptide của mucins. Những gen MUC nằm trên ít nhất
là năm nhiễm sắc thể khác nhau, với một cụm trên nhiễm sắc thể 11, và mã
hóa chủ yếu cho mucins tiết trong các lớp chất nhầy để bảo vệ biểu mô của
đường hô hấp, vùng dạ dày - ruột và cơ quan sinh sản. Phương pháp hóa mô
5
miễn dịch và lai tại chỗ là hai kỹ thuật hữu ích mà có thể được sử dụng để cung
cấp các dấu hiệu mới có giá trị trong chẩn đoán và tiên lượng.
Các gen MUC quy định cho một số lượng lớn các glycoprotein liên
quan tới sự bảo vệ và chức năng của mỗi một loại niêm mạc. MUC1 là mã
hóa gen 'episialin', một chất nhầy màng thấy rõ trong tuyến vú, tuyến tụy và
buồng trứng. MUC2 được bộc lộ mạnh trong ruột già, ruột non và MUC3

được thấy ở hỗng tràng. MUC4 được phân lập từ niêm mạc phế quản cũng
như là các gen MUC5AC và MUC5B. MUC6 được phân lập từ niêm mạc dạ
dày và MUC7 là một gen nhỏ được phân lập từ tuyến dưới hàm.
Các nghiên cứu gần đây còn cho thấy, các chất nhầy rất quan trọng
trong việc chẩn đoán nguồn gốc từ vị trí ung thư biểu mô và trình tự của các
glycoprotein phức tạp giúp hé lộ thông tin mới nhằm giải thích các vai trò
khác nhau của các chất nhầy trong các khối u xâm nhập. Vai trò bảo vệ của
chất nhầy trong một loạt các bệnh nhiễm trùng mới đây cũng đã được nghiên
cứu bao gồm các vị trí của niêm mạc dạ dày có Helicobacter pylori.
2.1.2 ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT NHẦY:
Chất nhầy (hay là mucins) là thành phần chủ yếu của carbonhydrat
trong mô.
Chất nhầy còn được gọi với những tên “Mucopolysaccharides”,
“Glycosaminoglycans”(Jeanbz 1960) và “Mucosubstances”(Spicer 1965). Gần
đây, tên “Glycoconjugat”(Glyco kết hợp) đã được gợi ý như một tên chung để
thay thế những tên gọi trước(Reid & Clamp). Việc định nghĩa lại theo gợi ý của
họ bởi glycoconjgat gồm proteoglycan và glycoprotein. Proteoglycan là những
cấu trúc polypeptide cùng các nhánh bên carbohydrate không chia
nhánh(glycosaminoglycan) bao gồm acid hexuronic xen kẽ với hexsoamin.
6
Glycoprotein là những cấu trúc polypeptide cùng nhánh bên
carbohydrate chia nhánh, thường chứa acid sialic hoặc các gốc sulfate ở vị trí
tận cùng. Các chất nhầy khác nhau có thể hiện diện một loại đơn giản trong
một mô hoặc hay gặp hơn là hỗn hợp nhiều loại khác nhau.
Đã có bằng chứng chỉ ra rằng chất nhầy được tổng hợp trong lưới nội
bào có hạt và hoàn thành trong bộ Golgi. Sự sulfat các phân tử hexosamin
cũng diễn ra ở bộ Golgi.
Chất nhầy có thể phát hiện được dưới kính hiển vi điện tử và các
phương pháp kỹ thuật kết hợp với các kim loại đậm điện tử hoặc ở dạng tự do
hoặc một phần của các thuốc nhuộm được sử dụng như blue alcian, đỏ

ruthenium và dialyzediron.
Chức năng của chất nhầy còn chưa được tìm hiểu hết. Hầu hết bề mặt
bên trong của cơ thể được phủ chất nhầy với chức năng bôi trơn, hình thành
một môi trường thích hợp cho sự khuếch tán các phân tử và ion.
Phân loại chất nhầy:
Chất nhầy được phân thành hai nhóm chính: chất nhầy acid và chất
nhầy trung tính
- Chất nhầy acid:
Gồm: Chất nhầy sulfated mạnh, chất nhầy sulfated yếu, carboxylated
sialomucin, sulfated sialomucin.
+ Chất nhầy sulfated mạnh của mô liên kết(proteoglycans):
Chất nhầy này phản ứng tại giá trị pH thấp với các thuốc nhuộm cation
thích hợp và luôn luôn âm tính với PAS. Có nhiều tế bào sản xuất ra những
chất nhầy sulfated này, là các nguyên bào sợi, tế bào nội mô, tế bào xương, tế
bào sụn và các dưỡng bào, tế bào hình chén của đường ruột.
+ Chất nhầy biểu mô sulfated mạnh:
7
Loại này được phân biệt bởi nguồn gốc biểu mô. Chất nhày biểu mô
sulfat mạnh được tìm thấy trong những tuyến thanh dịch của phế quản( Lamb
& Reid 1970) và có thể có một phần nhỏ trong tế bào hình chén của đường
ruột. Về mặt hóa mô, nó phản ứng ở nồng độ pH thấp với những thuốc nhuộm
cation tương tự như những chất nhày sulfat của mô liên kết.
+ Chất nhầy biểu mô sulfated yếu:
Chất nhầy này thuộc loại biểu mô, gồm các este sulfated
polysaccharide, trong đó các gốc tự do sulfated được liên kết với những
hexosamines khác nhau như glucosamine. Chúng được phân bố rộng trong
mô, thường xuất hiện trong những tế bào hình chén của đại tràng. Chất nhầy
sulfated yếu khác chất nhầy sulfated mạnh vì nó phản ứng với các thuốc
nhuộm cation tại độ pH cao hơn một chút.
+ Chất nhày sulfat không điển hình về hóa mô.

Là một chất nhày sulfat nhuộm dương tính với alcian blue nhưng âm
tính với những kỹ thuật thông thường để phát hiện chất nhày sulfat. Chất nhày
này có thể tìm thấy trong các tuyến chế nhày khí quản.
+ Chất nhày carboxylate (Sialomucin):
Enzyme-labile: đây là một chất nhày có nguồn gốc biểu mô. Tên gọi
‘Enzyme-labile’ bởi thực tế N-acetyl sialomucins bị tiêu hóa bởi enzyme
sialidase. Chúng được phân bố rộng trong cơ thể (như các tuyến dưới niêm
mạc phế quản, tuyến nước bọt dưới hàm, các tế bào hình chén của ruột non) ở
dạng đơn hoặc ở dạng hỗn hợp với các dạng chất nhầy khác ( bao gồm cả chất
nhầy acid và trung tính).
Emzym-resistant: enzyme này không bị tiêu hóa bởi enzyme sialidase
và âm tính với PAS. Chúng được tìm thấy trong niêm mạc của ruột già, dạ
dày và phế quản.
8
+ Hyaluronic acid: đây là chất nhày gặp nhiều trong mô liên kết, được
sản xuất bởi các nguyên bào sợi, chứa N-acetyl-D-glucosamine và acid D-
glucuronic, không giống với các glycosaminoglycan được cho là không gắn
với protein. Các gốc sulfate vắng mặt và những phản ứng kết hợp qua nhóm
carboxyl trên acid glucuronic. Bởi vì acid hyaluronic và acid sialic nhuộm với
các thuốc nhuộm cation ở độ pH tương tự nhau, nên phân biệt giữa chúng dựa
vào phản ứng với enzyme hyaluronidase và enzyme sialidase.
- Chất nhầy trung tính:
Không có các nhóm phản ứng acid hiện diện trong chất nhầy trung tính.
Nó gồm các hexosamin khác nhau liên kết cùng các nhóm hexo tự do.
Đây là chất nhầy có nguồn gốc biểu mô và có nhiều nhất trong các
tuyến Brunner và các biểu mô phủ của dạ dày. Ngoài ra nó cũng có mặt ở các
tế bào hình chén của hệ hô hấp, tiêu hóa và tuyến tiền liệt.
2.1.3 ĐẠI CƯƠNG VỀ GLYCOGEN
Glycogen là một polysaccharide đơn giản bao gồm các chuỗi phân
nhánh hoặc chuỗi thẳng mà các đơn vị D-glucose, và có thể được nhìn thấy

bằng kính hiển vi điện tử dưới hai hình thức chủ yếu:
- Alpha: nhìn thấy như hình hoa thị hoặc cụm hạt beta đường kính khoảng
60-250nm.
- Beta: nhìn thấy những hạt tự do hoặc là một phần của một hình hoa thị và
có đường kính 20-40nm.
Ngoài ra còn có loại thứ ba, hay gamma, hình thức đã được mô tả trong
gan chuột (De Bruijn, 1973) và là một glycogen không hạt được tìm thấy giữa
hạt beta trong hoa hồng alpha. Glycogen gamma chỉ nhìn thấy khi kali ferixianua
được kết hợp vào một tetroxide cố định osmium, người ta cho rằng một hợp chất
được hình thành là giảm phản ứng với các nhóm hydroxyl của glycogen.
9
Trong điều kiện bình thường, glycogen trong tế bào tìm thấy với số lượng
lớn, nhất là trong gan, cơ tim và xương, trong nang lông (có số lượng đáng kể),
các tuyến nội mạc tử cung, âm đạo và biểu mô vẩy cổ tử cung (số lượng thay đổi
theo ảnh hưởng phụ thuộc hormon). Dây rốn, tế bào trung biểu mô, bạch cầu và
bạch cầu trung tính, nguyên mẫu tiểu cầu cũng chứa glycogen. Đây được coi là
glycogen tồn tại trong mô trong một môi trường protein, chứ không phải là liên
kết hóa học với protein (Meyer & Jeanloz, 1943).
2.1.4 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM PERIODIC ACID SCHIFF:
Periodic acid Schiff là một phương pháp nhuộm được sử dụng khá phổ
biến trong mô bệnh học để phát hiện polysaccharides như glycogen,
mucosubstances, như glycoprotein, glycolipid và chất nhày trung tính, nấm
trong mô.
1.4.1. Quy trình lấy, cố định,pha, chuyển, đúc bloc, cắt và dán mảnh cắt:
- Lấy bệnh phẩm: hai yêu cầu cơ bản, trước tiên của việc lấy bệnh
phẩm là lấy trúng và lấy đủ.
+ Lấy được bệnh phẩm trúng vùng tổn thương cần xét nghiệm là vấn đề
không đơn giản và không phải bao giờ cũng thực hiện được. Vì vậy xác định
được vùng tổn thương cần phải cân nhắc và ít nhiều đòi hỏi kinh nghiệm của
bác sĩ lâm sàng. Nên lấy bệnh phẩm ở nhiều vị trí khác nhau và lặp lại xét

nghiệm khi kết quả âm tính.
+ Lấy đủ chủ yếu là lấy đủ thành phần, đủ lượng mô tối thiểu cần cho
việc chuẩn đoán. Vừa lấy được mô bình thường (hay tương đối bình thường)
lẫn mô bệnh trên cùng một sinh thiết. Ngoài ra, đối vơi smootj số tổn thương
có tình chất chuyển tiếp hoặc có những giai đoạn phát triển khác nhau, phải
lấy bệnh phẩm vừa ở nhiều vị trí, vừa ở những thời điểm khác nhau.
10
- Cố định: là làm bất động những cấu trúc của mô cũng như tế bào
nhưng vẫn tôn trọng tới mức tối đa hình thái của chúng. Nói khác đi, cố định
một mô là làm giết chết những thành phần của mô đó nhưng vẫn bảo quản
chúng trong một tình trạng gần với lúc sống nhất. Trừ một số trường hợp cần
nhuộm tươi hay cần nghiên cứu về enzym, nuôi cấy tế bào thì nói chung, mọi bệnh
phẩm cần cố định ngay sau khi lấy ra khỏi cơ thể.Cố định không tốt làm giảm
hẳn chất lượng xét nghiệm và sự cố định hỏng là không thể sửa chữa được.
- Pha bệnh phẩm:
Không được làm giập nát bệnh phẩm: khi pha không được dùng kẹp
có mấu, lưỡi dao pha phải sắc, mỏng và dài, cắt một chiều không được ray đi
ray lại trên một vị trí của bệnh phẩm và bệnh phẩm khi pha phải được đặt trên
một miếng lie, gỗ hoặc plastic.
Các mẫu bệnh phẩm dùng trong kỹ thuật mô học thường được cắt dày
từ 3 - 5 mm. Với bệnh phẩm mềm (não,…) có thể cố định vài giờ cho cứng
sau đó mới pha lại. Trong trường hợp chuyển đúc bằng máy, bệnh phẩm
không được cắt dày hơn chiều cao của lòng khuôn nhựa.
- Chuyển bệnh phẩm: Cố định bệnh phẩm mới chỉ giết chết tế bào và
giữ cho nó những thành phần bất động trong trạng thái tĩnh. Nhưng nếu đưa
bệnh phẩm này cắt mỏng ngay thì mối liên quan giữa tế bào và tổ chức cũng
như cấu trúc tế bào bị thay đổi do tác động của lưỡi dao vào bệnh phẩm. Để
giải quyêt vấn đề này, người ta đưa ra một chất nền cho bệnh phẩm, chất đó
vừa làm khuôn giữ bệnh phẩm vừa xâm nhập vảo trong tế bào giữ cho thành
phần cũng như tổ chức được giữ nguyên vị trí khi cắt mảnh, đó là sự vùi.

- Đúc block: có hai yêu cầu cơ bản là: bệnh phẩm định hướng mô học đúng
và thao tác phải nhanh để bệnh phẩm, paraffin và cassette gắn kết vững chắc.
11
- Cắt và dán mảnh: Để quan sát được hình dạng, cấu trúc của mô hoặc
tế bào dưới kính hiển vi thì sau khi trải qua các quy trình cố định, chuyển, đúc
còn phải cắt thành những mảnh có độ dày một vài μm để ánh sáng có thể đi
qua được. Một mảnh cắt được coi là đạt yêu cầu nếu mảnh cắt mỏng đều;
không gấp, xước hoặc rách; còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm;
kích thước của bệnh phẩm to gần bằng thật. trước khi nhuộm cần tãi mảnh cắt
và dán mảnh cắt trên một nền trong suốt như phiến kính, phiến nhựa. muốn
mảnh cắt dính vào nền có thể dùng một chất dính hoặc nước lã. Mảnh cắt
được đặt ở 2/3 của lam kính từ dưới lên (1/3 của lam kính từ trên xuống dùng
để ghi mã số bệnh nhân. Phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm và lúc này
bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính.
1.1.4.1 Nguyên tắc của phương pháp nhuộm PAS:
Dùng một tác nhân oxy hóa là acid periodic (HIO4) để phá vỡ mối liên
kết của hai nguyên tử cacbon trong một số nhóm hóa học (các nhóm glycol 1-
2, hydro-1, amino-2, hydroxy-1, alkylamino-2, hydroxyl-1, ceto-2,…) làm
xuất hiện các nhóm aldehyde (-CHO). Các nhóm aldehyde này được nhìn
thấy nhờ phản ứng với thuốc thử Schiff (fuchsin basic không màu bởi acid
sulfureux) tạo thành hợp chất có màu đỏ.[1][4]
- Sơ đồ phản ứng
+ HIO
4
=
Một mắt xích Dialdehyde
12
α _ D _glucose
+ HIO
4

=
1-amino-2-hydroxy Dialdehyde
Hình 1: Sơ đồ biểu diễn sự oxi hóa của acid periodic với một mắt xích α-D-
glucose và một mắt xích 1-amino-2-hydroxy để tạo thành dialdehyde.
Các aldehyde này được phát hiện bởi thuốc thử Schiff do Dialdehyde
không bền vững, không màu được hình thành màu của sản phẩm cuối cùng
bằng cách phục hồi các nhóm quinoid chromophoric và tạo thành màu đỏ tươi
của sản phẩm cuối cùng [1] [4]
13
Hình 2: Cơ chế phản ứng của thuốc thử Schiff với các gốc dialdehyde tạo
thành hợp chất có màu đỏ
1.1.4.2 Phương pháp nhuộm PAS và chẩn đoán lâm sàng:
Phương pháp nhuộm PAS được sử dụng giúp cho việc chẩn đoán một
số bệnh:
- Bệnh dự trữ glycogen.
- Ung thư tuyến thường tiết chất nhày trung tính.
- Bênh Paget của vú.
- Sarcoma phần mềm dạng nang.
- Nhuộm các đại thực bào trong bệnh Whipple.
- Nó có thể được sử dụng để chẩn đoán thiếu hụt α1-antitrypsin nếu
xung quanh tĩnh mạch cửa của gan dương tính với phương pháp nhuộm này.
- Tập hợp các lymphocytes có PAS dương tính với sự có mặt của
Mycosis fungoidesand trong lớp biểu bì hội chứng Sezary còn được gọi là vi
áp xe Pautrier ( tập hợp nhiều bạch cầu đơn nhân trong lớp biểu bì đặc trung u
lympho ác tình ở da đặc biệt bệnh mycosis fungoides.)
- Erythroleukemia, bệnh bạch cầu non trong máu ngoại vi. Những tế
bào này khi nhuộm fuchsia bắt màu sáng.
- Phế nang phổi có protein ( tích tụ protein thừa).
- Nhiễm nấm, thành tế bào của nấm có màu đỏ tươi, nó chỉ bắt màu
những bào tử nấm còn sống. Ngược lại, phương pháp nhuộm ngấm bạc

(methenamine silver) của Grocott nhuộm được cả nấm sống và nấm đã chết.
- Còn được sử dụng để xác định glycogen trong mẫu sinh thiết phổi của
trẻ sơ sinh trong bệnh glycogenosis phổi kẽ (PIG).[5]
14
15
CHƯƠNG 2
PHƯƠNG PHÁP VÀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:
Đối tượng nghiên cứu: bao gồm các bệnh phẩm sau phẫu thuật của mô
gan và mô dạ dày. Trong quá trình nghiên cứu , chúng tôi thu thập 35 mẫu
bệnh phẩm, trong đó có 9 mẫu mô gan và 26 mẫu sinh thiết dạ dày.
Tiêu chuẩn chọn mẫu: Các mô có chế nhày hoặc glycogen (sau khi đã
nhuộm HE để kiểm tra).
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Giải Phẫu Bệnh, trường Đại Học Y Hà Nội
2.1.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:
2.1.2.1 Thiết kế nghiên cứu:
Phương pháp mô tả cắt ngang
2.1.2.2 Tiến hành:
 Cố định: bệnh phẩm cắt dày không quá 5mm và được cố định tối đa
24h ở nhiệt độ phòng trong dung dịch formaldehyde 10% được pha như sau:
Formaldehyde 37-40% ……………………………….100ml
Nước cất 2 lần……………………………………… 900ml
 Bệnh phẩm sau khi cố định được chuyển bằng máy chuyển STP 120
 Đúc block bằng máy đúc Microm AP280-2
 Cắt tiêu bản bằng máy cắt Microm HM315
Mỗi block bệnh phẩm cắt làm 6 mảnh cắt, mỗi mảnh dày 3 µm và được
dán lên 6 lam kính sạch, 3 tiêu bản được nhuộm với thuốc thử Schiff pha theo
hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”, 3 tiêu bản được
nhuộm với thuốc thử Schiff của hãng Sigma.
Sau đó được mang nhuộm PAS với nước rửa sau bước phản ứng với

thuốc thử Schiff có pH lần lượt là
16
pH
1
= 4, pH
2
= 7, pH
3
= 10
 Chuẩn bị thuốc nhuộm:
+ Pha thuốc thử Schiff theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển vi
học thông thường”:
Hòa tan 1g fuchsin basic trong 200ml nước cất đun sôi( nước phải được
đựng trong bình nón đun sôi trước khi cho thêm fuchsin vào), lắc mạnh cho
tan hết.
Để nguội tới 50
0
C đem lọc.
Thêm vào đó 2ml acid chlohydric nguyên chất.
Tiếp tục để nguội đến 25
0
C cho thêm 2g potassium metabisulfated và
trộn đều.
Để dung dịch 24 giờ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch chuyển màu vàng rơm hoặc không màu thì sử dụng.
Bảo quản trong lọ tối màu, kín khí ở 4
0
C
Cách kiểm tra thuốc thử Schiff mua của hãng cung như thuốc thử
Schiff tự pha:

Cho 10ml dung dịch formaldehyde trong ống đong, cho thêm vài giọt
Schiff, nó sẽ chuyển sang màu đỏ tím ngay lập tức. bỏ thuốc thử Schiff nếu
nó chuyển sang màu hồng khi bảo quản trong tủ lạnh. Kết tủa trắng ở dưới
đáy của dung dịch Schiff có thể tan được bằng cách làm ấm nhẹ và khuấy đều
dung dịch.
Sử dụng thuốc thử Schiff phải hết sức cẩn trọng vì basic fuchsin được
biết là một chất dễ gây ung thư.
+ Pha dung dịch acid periodic
Acid periodic 1g
Nước cất 200ml
Hòa tan hoàn toàn thành dung dịch đồng nhất. Dán nhãn, viết tên dung dịch
và ngày pha.
17
+ Đo pH dung dịch nước rửa tiêu bản bằng máy đo pH HI 2211
 Tiến hành kỹ thuật:
+ Tẩy parafill bằng xylen: 3 lần x 2 phút/lần.
+ Chuyển vào bể cồn 100
0
, 95
0
, 85
0
mổi bể 2 phút
+ Rửa nước chảy 5 phút. (*)
+ Oxy hóa carbonhydrat trong dung dịch acid periodic 1% trong 10
phút làm xuất hiện các nhóm aldehyd.
+ Rửa nước chảy 5 phút.
+ Cho phản ứng với thuốc thử Schiff từ 2-5 phút.
+ Biệt hóa trong nước rửa có pH
1

=4, pH
2
=7, pH
3
=10 trong 15 phút.
+ Nhuộm nhân trong hematoxylin từ 30s- vài phút.
+ Rửa nước chảy 5 phút.
+ Tẩy trong cồn acid vài giây.
+ Rửa nước chảy 10 phút.
+ Loại nước bằng cồn 95
0
,100
0
+ Làm trong qua 3 bể toluene.
+ Gắn bôm Canada.
(Nếu muốn phát hiện glycogen thì sau bước (*) cần một tiêu bản làm
chứng bằng cách cho tiêu bản chứng thủy phân 1h trong Diastase 1% ở 37
0
C
hoặc enzym amylase, còn tiêu bản kia làm song song với tiêu bản chứng,
nhưng ngâm 1h trong nước cất ở 37
0
C. sau đó nhuộm các bước tiếp theo của
(*) bình thường.
Kết quả: Nếu tiêu bản chứng (-) còn tiêu bản kia (+) thì chất cần tìm là
glycogen. Nếu tiên bản chứng (+), tiêu bản kia (+) thì chất cần tìm không phải
là glycogen.)
2.1.2.3 Đánh giá kết quả nhuộm PAS:
Kết quả nhuộm:
18

Glycogen, màng đáy: màu đỏ tươi.
Nhân tế bào: màu xanh xanh đen.
Nấm,chất nhầy: màu hồng, đỏ thẫm.
Chất nền: màu ve.
Tiêu chuẩn đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm PAS như sau:
- Dương tính: sản phẩm cuối cùng có màu đỏ tươi.
- Dương tính yếu: Sản phẩm cuối cùng có màu đỏ yếu.
- Âm tính: Sản phẩm cuối cùng không có màu.
- Dương tính giả: Sản phẩm cuối cùng bào tương và những vùng xung
quanh chất nhày, glycogen cũng bắt màu đỏ tươi.
- Âm tính giả: Sản phẩm cuối cùng không bắt màu kể cả vùng chứa
chất nhày trung tính hoặc glycogen.
2.1.4. Đánh giá chất lượng tiêu bản: theo ba mức độ.
−Tiêu bản tốt:
Tiêu bản có sự bắt màu tương phản rõ ràng.
Tiêu bản quan sát rõ chất nhày trung tính, màng đáy, các hạt glycogen.
Tiêu bản cắt mỏng, không gấp, xước, rách, tiêu bản sạch, trong, không
có bọt khí,…
−Tiêu bản đạt yêu cầu:
Có thể quan sát được chấy nhày, màng đáy, hạt glycogen trên tiêu bản nhuộm.
Tiêu bản chưa có tương phản màu sắc rõ ràng, còn có lỗi kỹ thuật như
gấp, cước, rách, mất mô, tiêu bản bẩn, có bọt khí,…
−Tiêu bản không đạt yêu cầu:
Không hoặc khó quan sát thấy chất nhày, màng đáy và hạt glycogen.
Không có sự tương phản màu sắc.
−Tiêu bản gặp nhiều lỗi kỹ thuật: gấp, cước, rách, mất mô, tiêu bản
bẩn, có bọt khí,… gây khó khăn cho việc đọc tiêu bản.
19
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước
nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH
1
= 4, pH
2
= 7, pH
3
= 10.
Bảng 3.1. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau bước
nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH
1
= 4, pH
2
= 7, pH
3
= 10.
pH
1
= 4 pH
2
= 7 pH
3
= 10
N % N % N %
Dương tính 33 94.29% 33 94.29% 33 94.29%
Dương tính yếu 0 0% 0 0% 0 0%
Dương tính giả 2 5.71% 2 5.71% 2 5.71%
Âm tính 0 0% 0 0% 0 0%
Âm tính giả 0 0% 0 0% 0 0%
Tổng số 35 100% 35 100% 35 100%

Nhận xét:
Kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt mô chế nhày hoặc chứa glycogen
bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff mua của hãng Sigma với pH =
4. pH= 7, pH= 10 đều có kết quả giống nhau với 94.29% (33/35) tiêu bản
dương tính, 5.71% (2/35) tiêu bản dương tính giả, không có tiêu bản dương
tính giả, âm tính và âm tính giả.
20
3.2. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau
bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật
hiển vi học thông thường” trong vòng 1 tuần sau khi pha với pH
1
= 4,
pH
2
= 7, pH
3
= 10.
Bảng 3.2. Đánh giá kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt bằng nước rửa sau
bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của tài liệu “ Kỹ thuật hiển
vi học thông thường” trong vòng 1 tuần sau khi pha với
pH
1
= 4, pH
2
= 7, pH
3
= 10.
pH
1

= 4 pH
2
= 7 pH
3
= 10
N % N % N %
Dương tính 30 85.71% 27 77.15% 27 77.15%
Dương tính yếu 4 11.43% 6 17.14% 6 17.14%
Dương tính giả 0 0% 0 0% 0 0%
Âm tính 0 0% 0 0% 0 0%
Âm tính giả 1 2.86% 2 5.71% 2 5.71%
Tổng số 35 100% 35 100% 35 100%
Nhận xét:
Kết quả quá trình biệt hóa mảnh cắt mô chế nhày hoặc chứa glycogen
bằng nước rửa sau bước nhỏ thuốc thử Schiff pha theo hướng dẫn của cuốn
“Kỹ thuật hiển vi học thông thường” với pH = 4 có 85.71% (30/35) tiêu bản
dương tính, 11.43% (4/35) tiêu bản dương tính yếu, 2.86% (1/35) tiêu bản âm
tính; pH = 7 có 77.15% (27/35) tiêu bản dương tính, 17.14% (6/35) tiêu bản
dương tính yếu, 5.71% (2/35) tiêu bản âm tính; pH = 10 có 77.15% (27/35)
tiêu bản dương tính, 17.14% (6/35) tiêu bản dương tính yếu, 5.71% (2/35)
tiêu bản âm tính. Ở cả 3 độ pH của nước rửa đều không có tiêu bản dương
tính giả và âm tính.
3.3 Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm:
Bảng 3.3. Đánh giá chất lượng tiêu bản nhuộm
21
Tiêu bản sử dụng thuốc thử
Schiff của hãng Sigma
Tiêu bản sử dụng thuốc thử
Schiff pha
N % N %

Tốt 56 53.33% 59 56.19%
Đạt yêu cầu 39 37.14% 41 39.05%
Không đạt 10 9.53% 5 4.76%
Tổng 105 100% 105 100%
Nhận xét:
Số tiêu bản tốt: 53.3% (56/105) tiêu bản nhuộm bằng thuốc thử Schiff
của hãng Sigma. 56.19% (59/105) tiêu bản nhuộm bằng thuốc thử Schiff pha
theo hướng dẫn của cuồn “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”.
Số tiêu bản đạt yêu cầu: 37.14% (39/105) tiêu bản nhuộm bằng thuốc
thử Schiff của hãng Sigma. 39.05% (41/105) tiêu bản nhuộm bằng thuốc thử
Schiff pha theo hướng dẫn của cuồn “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”.
Số tiêu bản không đạt yêu cầu: 9.53% (10/105) tiêu bản nhuộm bằng
thuốc thử Schiff của hãng Sigma. 4.76% (5/105) tiêu bản nhuộm bằng thuốc thử
Schiff pha theo hướng dẫn của cuốn “ Kỹ thuật hiển vi học thông thường”.
22
3.4 Một số hình ảnh minh họa kết quả nhuộm PAS trên mô chế nhày
hoặc glycogen ở ba pH nước rửa khác nhau:
Hình 3.3:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x100 bằng thuốc thử Schiff Sigma,
pH=4. Các hạt glycogen bắt màu rõ ràng.
Hình 3.4:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x100 bằng thuốc thử Schiff Sigma,
pH=7.Các hạt glycogen bắt màu rõ ràng.
23
Hình 3.5:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x50 bằng thuốc thử Schiff Sigma,
pH=10.Các hạt glycogen bắt màu rõ ràng.
Hình 3.6:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x400 bằng thuốc thử Schiff pha,
pH=4.Các hạt glycogen bắt màu rõ ràng.
24
Hình 3.7:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x400 bằng thuốc thử Schiff pha,
pH=7. Có quan sát được các hạt glycogen, màu sắc chưa rõ ràng.
Hình 3.8:Tiêu bản mô gan nhuộm PAS x400 bằng thuốc thử Schiff pha,

pH=10. Có quan sát được các hạt glycogen, màu sắc chưa rõ ràng.
25
Hình 3.9:Tiêu bản sinh thiết dạ dày nhuộm PAS x400 bằng thuốc thử Schiff
Sigma, pH=4. Các tế bào chế nhầy bắt màu rõ ràng.
Hình 3.10:Tiêu bản sinh thiết dạ dày nhuộm PAS x400 bằng thuốc thử Schiff
Sigma, pH=7. các tế bào chế nhầy bắt màu rõ ràng.