Đề tài sản xuất kháng sinh penicillin

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Đề tài sản xuất
kháng sinh penicillin
GVHD : PHẠM THỊ HƯƠNG
SVTT : TRẦN DUY SƠN
NGUYỀN ĐÌNH TẤN
NGUYỄN BÁ THẠCH
TRƯƠNG THỊ HOÀI THU
NGUYỄN THỊ THU THỦY
HỒ THỊ TRANG
Mục lục
Nhóm 7 Page 1
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Nhóm 7 Page 2
2
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Chương I: Tổng quan tài liệu.
1.1. Tổng quan về chất kháng sinh.
1.1.1. Khái niệm chất kháng sinh:
Kháng sinh là những sản phẩm nhận được từ VSV hay các nguồn tự nhiên khác
có hoạt tính sinh học cao, có tác dụng kìm hãm, tiêu diệt một cách chọn lọc lên một
nhóm VSV xác định hay tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
1.1.2. Cơ chế tác dụng chung của kháng sinh.
Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh của mỗi chất kháng sinh thường mang
đặc điểm riêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó.
Những kiểu tác động:làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điều
tiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả quá
trình sinh tổng họp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặc tương tác đặc hiệu với
những giai đoạn nhất định trong chuyển hóa trao đổi chất
Hình 1.1 :Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh
Nhóm 7 Page 3

3
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
1.1.3. Phân loại kháng sinh
Có nhiều cách phân loại kháng sinh như theo phổ tác dụng, theo nguồn gốc … Dựa
vào cấu trúc hóa học, kháng sinh được chia thành các nhóm như:
-Nhóm β-Lactam: penicillin, cephalosporin,
-Nhóm aminoglycosid: streptomycin, gentamicin,
-Nhóm polypeptid: bacitracin, polymycin,
- Nhóm macrolide: erythromycin, spiramycin,
- Các kháng sinh có cấu trúc 4 vòng: tetracillin …
- ….
1.2. Kháng sinh Penicillin.
1.2.1. Lịch sử phát hiện và sản xuất Penicillin .
Năm 1928 A. Fleming là người đầu tiên phát hiện ra kháng sinh.
Đến năm 1938, Howard Florey, Ernst Chain, Norman Heatley mới đưa Penicillin
vào sản xuất thử.
Vào năm 1940, Dorothy Hodkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillin.
1942: Mary Hunt đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Peniciỉlium
chrysogenum là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp đang sử dụng hiện nay
trên toàn thế giới
Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra được trên 500 chế phẩm penicillin (trong đó
chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm là penicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai
để sản xuất các chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác
1.2.2. Tình hình sản xuất penicillin hiện nay trên thế giới.
Penicillin vẫn là chất kháng sinh được sử dụng nhiều nhất thế giới
Thuốc kháng sinh chiếm khoảng 30% thị phần dược phẩm thế giới.
Các tập đoàn dược phẩm của Mỹ, Anh, Nhật Bản , Italia, Hà Lan, Ấn Độ chiếm
các vị trí hàng đầu trong lĩnh vực này.
1.2.3. Tính chất hóa lý của penicillin.
Tính chất vật lí:

Các penicillin dưới dạng muối hoặc dạng acid là những bột trắng không mùi khi
Nhóm 7 Page 4
4
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
tinh khiết.
Đa số các nhóm R acyl hóa trên 6-APA đều là vòng thơm
Bình thường penicillin có trọng lượng phân tử:313 đến 334 g / mol ( penicillin G).
Penicillin với các nhóm phân tử đính kèm thêm có thế có một khối lượng phân tử
khoảng 500 g / mol
Tính chất hóa học:
Các penicillin có khả năng tạo muối natri và kali tan trong nước.
Các penicillin cũng có khả năng tạo muối với các amin tạo penicillin thủy giải
chậm
Các penicillin cũng có khả năng tạo ra các este
Tính không bền của vòng beta lactam:phân hủy trong môi trường kiềm
Sự alcol phân và amino phân: vòng beta lactam nhạy với một số tác nhân ái nhân
khác với xúc tác của các ion kim loại nặng: Cu
2+
, Zn
2+
, Sn
2+
Sự phân huỷ trong môi trường acid
1.2.4. Vi sinh vật tổng hợp Penicillin.
1.2.4.1. Cơ sở công nghệ sinh tổng hợp penicillin nhờ nấm mốc P. chrysogenum.
1.2.4.1.1 Lịch sử tuyển chọn chủng công nghiệp P. chrysogenum.
Vào những năm đầu, việc nghiên cứu sản xuất penicillin thường sử dụng các chủng
có hoạt lực cao thuộc loài P. notatum và P. baculatum. Nhưng từ khi trường đại học
Wisconsin (Mỹ) phân lập được chủng P.chrysogenum có hoạt tính cao hơn thì chủng
này dần dần đã thay thế và từ khoảng sau những năm 50 của thế kỷ XX đến nay tất cả

các công ty sản xuất penicillin trên thế giới đều sử dụng các biến chủng
P.chrysogenum công nghiệp.
Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinh
cũng thường trải qua sáu giai đoạn cơ bản là:
- Phân lập từ thiên nhiên.
- Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao.
- Tuyển chọn sơ bộ.
- Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm.
Nhóm 7 Page 5
5
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
- Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot.
- Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn
công nghiệp.
Trong các giai đoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mô phòng thí nghiệm là công đoạn
tuyển chọn toàn diện và kỹ lưỡng nhất;
Mục tiêu của quá trình tuyển chọn tạo biến củng công nghiệp không chỉ dừng lại ở
năng lực siêu tổng hợp kháng sinh của chủng, mà còn định hướng đồng thời vào các
mục tiêu khác như: tạo ra các biến chủng tích tụ ít các sản phẩm không mong muốn,
các biến chủng tổng hợp ra các sản phẩm hoàn toàn mới (nhất là các sản phẩm có cấu
trúc và đặc tính mong muốn theo "thiết kế" của con người), các biến chủng rất nhạy
cảm với chất kháng sinh hay các chủng có sức đề kháng cao với những chất kháng sinh
nào đó Việc tuyển chọn và tạo chủng công nghiệp là công việc lâu dài và tiêu tốn
rất nhiều nhân lực, đòi hỏi phải được tiến hành nghiêm túc, liên tục và thường xuyên.
Việc tuyển chọn chủng công nghiệp để lên men sản xuất penicillin trên nguyên tắc
cũng trải qua sáu giai đoạn cơ bản trên, trong đó giải pháp kỹ thuật đã được áp dụng
hiệu quả để thu nhận biến chủng "siêu tổng hợp" penicillin lại chính là các kỹ thuật gây
đột biến thường như: xử lý tia Rơn - ghen, xử lý tia cực tím và tạo đột biến bằng hoá
chất, thí dụ như Metylbis - amin (metyl -2-β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo-
etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat, 1,2,3,4 - diepoxybutan.

1.2.4.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc P. chrysogenum.
Theo quan điểm phổ biến hiện nay, quá trình sinh tổng hợp penicillin ở nấm mốc
P.chrysogenum có thể tóm tắt như sau: từ ba tiền chất ban đầu là α-aminoadipic,
cystein và valin sẽ ngưng tụ lại thành tripeptit δ -(α- aminoadipyl) - cysteinyl - valin ;
tiếp theo là quá trình khép mạch tạo vòng β-lactam và vòng thiazolidin để tạo thành
izopenicillin-N; rồi trao đổi nhóm α-aminoadipyl với phenylacetic (hay
phenooxyacetic) tạo thành sản phẩm penicillin G (hay penicillin V, xem sơ đồ tổng hợp
penicillin G trong hình 1.2.
Nhóm 7 Page 6
6
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Hình 1.2: Cơ chế sinh tổng hợp penicillin G
Trong 3 axit amin tiền chất trên thì cystein có thể được tổng hợp bằng một trong ba
con đường là được tổng hợp từ xerin (hình 1.3), từ homoxerin với việc tuần hoàn
chuyển hóa α-cetobutyrat qua oxaloacetat (hình 1.4), hay từ homoxerin với sự chuyển
hóa α- cetobutyrat qua izolecin. Đồng thời α- aminoadipic được giải phóng ra trong sơ
đồ hình 4 có thể được tuần hoàn để tham gia quá trình ngưng tụ ban đầu.
Nhóm 7 Page 7
7
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Hình 1.3: Tổng hợp cystein từ xerin
Hình 1.4: Tổng hợp cystein từ homoxerin với việc chuyển hóa α-cetobutyrat thành
oxaloacetat
Nhóm 7 Page 8
8
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Tuy nhiên, cũng có thể nó được giải phóng ra và tích tụ trong môi trường (vì trong
quá trình lên men sản xuất penicillin V bao giờ cũng phát hiện thấy trong dịch lên men
lượng lớn α- aminoadipic dạng vòng). Như vậy, quá trình sinh tổng hợp penicillin, phụ
thuộc vào điều kiện lên men cụ thể nhất định, có thể xảy ra theo sáu đường hướng khác

nhau. Do đó, hiệu suất chuyển hoá cơ chất - sản phẩm cũng biến đổi và phụ thuộc vào
đường hướng sinh tổng hợp tương ứng. Theo lý thuyết thì hiệu suất lên men sẽ trong
khoảng 683 - 1544 UI penicillin/g glucoza; song, trong thực tế, với những chủng có
hoạt tính sinh tổng hợp cao nhất cũng mới chỉ đạt khoảng 200 UI/g glucoza.
Hình1.5: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp α-aminoadipic
Nhóm 7 Page 9
9
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Hình 1.6: Sơ đồ cơ chế sinh tổng hợp valin
1.2.4.2. Cải tiến trên vi sinh vật nhằm tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp
siêu tổng hợp penicillin.
Nhìn chung, quá trình tuyển chọn tạo chủng công nghiệp siêu tổng hợp kháng sinh
thường trải qua sáu giai đoạn cơ bản: 1) Phân lập từ thiên nhiên. 2) Nghiên cứu xử lý
tạo các biến chủng " Siêu tổng hợp" có hoạt lực cao. 3) Tuyển chọn sơ bộ. 4) Tuyển
chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm. 5) Thử nghiệm và
tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot. 6) Thử nghiệm và chọn lọc lại
các chủng phù hợp với điều kiện lên men sản xuất lớn công nghiệp. Trong các giai
đoạn trên, bước tuyển chọn lại quy mô phòng thí nghiệm là quan trọng nhất.[1]
15 năm sau khi Alexander Fleming phát hiện ra chủng P.chrysogenum (có tài liệu
cho rằng chủng này là P.notatum [5, 17] hoặc P.ruben [10]) có khả năng sinh
penicillin (1928), chủng P.chrysogenum NRRL 1951 có năng suất cao hơn được phân
lập tại Phòng nghiên cứu phía Bắc của Sở Nông nghiệp Mỹ (NRRL) ở Peoria, Illinois
từ quả dưa đỏ mốc. Tất cả các chủng P.chrysogenum trên thế giới hiện nay đều là dẫn
Nhóm 7 Page 10
1
0
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
xuất của chủng gốc NRRL1951 này, nhờ khuếch đại gen mã hóa cho sinh tổng hợp
penicillin. [11, 17] Cho tới nay, giải pháp kỹ thuật được áp dụng hiệu quả để thu nhận
biến chủng siêu tổng hợp penicillin là các kỹ thuật gây đột biến thường như: xử lý tia

Rơnghen, xử lý tia cực tím, tạo đột biến bằng hóa chất như Metylbis - amin (metyl -2-
β-clo- etylamin), N-mustar (tris - β-clo- etylamin), Sarcrolyzin, HNO2, Dimetylsulfat,
1,2,3,4 - diepoxybutan.[18]
Nhờ kết hợp đột biến theo nhiều bậc đã đem lại thành công trong việc tạo ra chủng
P.chrysogenum E15-1 có sản lượng là 7000 mg/l [4] cao gấp nhiều lần so với chủng
NRL1951 ban đầu (hình 1.2). Trong đó các ký hiệu S - chọn lọc thường, X - xử lý tia
Rơnghen, U (UV) - xử lý tia tử ngoại, NM, NG - xử lý với metylbis amin, DEB – xử lý
với 1,2,3,4-dieboxybutal. [1, 5] Bảng 1.1 cũng liệt kê ra một số loài có khả năng sinh
penicillin và sản lượng tương ứng, chủng siêu tổng hợp penicillin công nghiệp với sản
lượng lên tới 30-55 g/l cũng được tạo ra nhờ đột biến [12]. Trong năm 2013 này, B M
Onyegeme-Okerenta và cộng sự cũng đã tạo được chủng P. chrysogenum UVP1 và
UVP2 có sản lượng cao gấp 70% so với dòng mẹ P. chrysogenum (PCL 501) bằng
cách chiếu tia UV trong 20, 25 phút tương ứng; nghiên cứu này chỉ ra đột biến là một
hướng tốt để cải thiện các chủng P.chrysogenum. [9]
Bảng 1.1: Một số loài có khả năng sinh Penicillin và sản lượng tương ứng. [12]
Nhóm 7 Page 11
1
1
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Nhóm 7 Page 12
1
2
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Hình 1.7: Qúa trình đột biến và tuyển chọn chủng P.chrysogenum E15-1.[5]
Nhóm 7 Page 13
1
3
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
1.2.4.3. Tối ưu hóa thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành
quá trình lên men tạo điều kiện cho vi sinh vật tổng hợp Penicillin nhiều nhất.

Thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện của quá trình lên men ảnh
hưởng trực tiếp đến năng suất sản lượng penicillin trong sản xuất công nghiệp.
Về cơ chất hay môi trường lên men, thay vì sử dụng glucose và lactose, các nghiên cứu
hiện nay đang hướng tới những loại cơ chất rẻ tiền và thân thiện với môi trường như
các chất thải công nông nghiệp. Đặc biệt, nghiên cứu được thực hiện bởi B M
Onyegeme-Okerenta và cộng sự chỉ ra: việc bổ sung bã mía vào môi trường lên men
cho sản lượng penicillin cao, sắn bào và hạt bắp cũng cho sản lượng penicillin cao hơn
so với glucose và lactose, mùn cưa cũng được nghiên cứu tuy nhiên cho sản lượng
penicillin thấp hơn so với sử dụng glucose hay lactose. Các chất thải đô thị có nguồn
gốc thực vật cũng được xem như nguồn cacbon giá rẻ cho sản xuất penicillin. [9, 16]
“Corn steep liquor (CSL)” – nguồn Nito cho P.chrysogenum [13]- chất thải của
công nghiệp sản xuất tinh bột ngô được sử dụng làm cơ chất trong công nghiệp để sản
xuất penicillin cho thấy năng suất cao đối với các chủng sản xuất P.chrysogenum . [13,
14, 16] Theo báo cáo của R. P. Elander, bộ đậu nành và hạt bông cũng được sử dụng
như là nguồn Nito cho P.chrysogenum [13]. Bên cạnh việc tìm ra nhũng nguồn cơ chất
rẻ tiền, cho năng suất sản xuất penicillin cao thì thay đổi trong công nghệ sản xuất
penicillin cũng không kém phần quan trọng. Bảng 1.2 nêu ra một số thay đổi trong
công nghệ sản xuất penicillin sau từ năm 1950 đến năm 2000.
Nhóm 7 Page 14
1
4
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
Bảng 1.2: Một số thay đổi trong công nghệ sản xuất penicillin (1950-2000). [13]
1.2.5. Các phương pháp sản xuất kháng sinh penicillin.
Hiện nay penicillin được sản xuất theo 2 phương pháp là lên men bề mặt và lên men
chìm. [8]
- Phương pháp lên men bề mặt: Trong những năm 30 đến 50 của thế kỷ XX,
phương pháp lên men bề mặt được áp dụng rộng rãi để sản xuất penicillin từ nấm
Penicillium chrysogenum, tuy nhiên hiện nay phương pháp này không còn được triển
khai trong sản xuất lớn nữa. Lên men bề mặt gồm 2 phương pháp là lên men trên

nguyên liệu rắn là các loại hạt hoặc cám có bổ sung đường lactose và lên men trên môi
trường lỏng tĩnh chủ yếu là nước chiết ngô.[3][5][8]
Nhóm 7 Page 15
1
5
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
• Quá trình nhân giống:
Quá trình nhân giống bắt đầu từ giống có trong ống nghiệm.Trong các nhà máy,
người ta cấy làm 3 ống. Một ống dùng kiểm tra trước khi sản xuất, một ống dùng để
sản xuất và một ống dùng để bảo quản.[3]
Môi trường nhân giống: giống với môi trường lên men nhưng không chứa lactose,
một số khoáng chất và tiền chất.[3][8]
Trong công nghiệp để có đủ lượng giống cung cấp cho quá trình sản xuất phải tiến
hành nhân giống qua nhiều cấp, khối lượng môi trường qua mỗi cấp tăng từ 10 – 15
lần. Tùy theo quy mô của nhà máy mà có thể tiến hành nhân giống qua các cấp khác
nhau cho đến khi đủ 5 – 10% giống cho sản xuất.[3][8]
• Qúa trình lên men.
Đối với phương pháp lên men trên môi trường rắn: sau khi môi trường đã được
khử trùng và làm nguộn đến 30
0
C, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ 5 – 10%.Các khay
được xếp chồng lên nhau trên những giá đỡ có một khoảng cách nhất định để thoáng
khí và thoáng nhiệt. Quá trình lên men kéo dài 6 – 7 ngày ở nhiệt độ 24 – 28
o
C. Ưu
điểm của phương pháp này là đường lactose được nấm mốc đồng hóa chậm nên không
xảy ra hiện tượng dư thừa đường trong tế bào.[3][8]
Đối với phương pháp lên men trong môi trường lỏng: áp dụng công nghệ bổ sung
liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi
trường thường là 0.2 – 0.8 kg phenylacetic/ m

3
dịch lên men. Dung dịch lên men sau
khi được khử trùng sẽ được phân phối vào các khay giống các khay nuôi cấy bề mặt
với môi trường rắn.Thời gian lên men là 6 -7 ngày, nhiệt độ lên men là 24 – 28
0
C.
Tiến hành lên men trong điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G được tổng
hợp tăng lên rõ rệt còn hàm lượng các penicillin khác cũng giảm đi.[3]
Ưu điểm của phương pháp:[7]
-Dễ thực hiện, quy trình công nghệ thường đơn giản.
-Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều so với
nuôi cấy chìm.
-Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối VSV, enzyme
và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản.
Nhóm 7 Page 16
1
6
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
-Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng
như đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém.
-Trong trường hợp bị nhiễm các VSV lạ, ta rất dễ dàng xử lý.Môi trường đặc là môi
trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực
đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ an toàn.
Nhược điểm của phương pháp: Phương pháp này tốn khá lớn diện tích cho nuôi cấy.
Quá trình lên men không cơ khí hóa và tự động hóa được.[7][8]
- Phương pháp len men chìm.
Phương pháp này được ứng dụng nhiều trong những năm 1950 trở lại đây, thay thế
dần phương pháp nuôi cấy bề mặt.[8]
• Quá trình nhân giống.
Trong phương pháp này người ta nhân giống trong môi trường lỏng. Mục tiêu của

quá trình nhân giống là thu được sô lượng tế bào cao. Môi trường nhân giống nấm
Penicillium chrysogenum trong phương pháp lên men chìm cũng giống như môi trường
nhân giống trong phương pháp lên men bề mặt là không bổ sung đường lactose, một số
khoáng chất và tiền chất[8].
Quá trình nhân giống bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống nghiệm sang những
bình tam giác đã chứa sãn môi trường nhân giống. Người ta thường nhân giống vào các
bình lên men dung tích từ 1 lít đến vài trăm lít. Nhiệt độ trong quá trình nhân giống
duy trì ở khoảng 261
0
C và thời gian nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72
0
C.[3]
• Quá trình lên men.
Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương pháp lên men chìm để sản
xuất pencillin trải qua hai pha: [3][8]
- Pha thứ nhất: hệ sợi phát triển rất mạnh, hay còn gọi là pha sinh khối. Trong pha
này các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào nấm men hấp thụ rất mạnh. Tốc
độ sinh sản của nấm xay ra nhanh. Sự tạo thành pencillin mới bắt đầu.
- Pha thứ hai: hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần lên và đạt đến giá trị khoảng 7
– 7.5. Trong pha này penicillin tạo ra với mức độ cực đại.
Giống nấm Penicillium chrysogenum là loại hiếu khí bắt buộc. Hơn nữa quá trình
tổng hợp penicillin xảy ra trong điều kiện hiếu khí nên trong suốt quá trình lên men,
việc thổi khí là điều hết sức cần thiết.
Nhiệt độ duy trì khoảng 261
0
C, pH 7 – 7.5, chế độ thổi khí 1.2 – 1.5 thể tích/lít/phút.
[8]
Ưu điểm của phương pháp:[7][8]
Nhóm 7 Page 17
1

7
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị Hương
- Tốn ít mặt bằng trong xây dựng và lắp đặt dây chuyền.
- Chi phí điện năng, nhân lực và các khoản phụ cho một đơn vị sản phẩm thấp.
- Dễ tổ chức được xí nghiệp có sản lượng lớn.
- Các thiết bị lên men chìm dễ cơ khí hoá, tự động hoá .
Nhược điểm của phương pháp:[7]
- Đòi hỏi trang bị kĩ thuật cao, dễ bị nhiễm trùng toàn bộ.
- Trong lên men chìm cần phải khuấy và sục khí liên tục vì vi sinh vật chỉ sử dụng
được ôxy hoà tan trong môi trường. Khí được nén qua một hệ thống lọc sạch tạp trùng,
hệ thống này tương đối phức tạp và dễ gây nhiễm cho môi trường nuôi cấy .
Hiện nay trong sản xuất công nghiệp, kỹ thuật lên men chìm được áp dụng trong
hầu hết các cơ sở sản xuất penicillin và thường được vận hành theo phương pháp lên
men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay
bán liên tục) một hay một vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ
sợi của mẻ lên men trước (hoặc không). Quá trình lên men được vận hành theo phương
pháp lên men hai pha, với pha đầu nuôi thu sinh khối trong khoảng 2 – 3 ngày, sau đó
chuyển sang pha lên men thu sản phẩm. Trong hầu hết các trường hợp người ta thay
thế đương lactose thành đường glucose. Để tránh hiện tượng thiếu hụt nhất thời
glucose người ta có thể kết hợp bổ sung một lượng nhỏ lactose.[3]
Kỹ thuật lên men này có hiệu suất lên men cao do đó làm tăng năng suất sản xuất,
giảm chi phí về nhân công do quá trình lên men được cơ giới hóa và tự động hóa, giảm
mặt bằng sản xuất và tận dụng tối đa nguồn giống ban đầu.
Nhóm 7 Page 18
1
8
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
Chương II: Sản xuất penicillin
2.1. Sơ đồ công nghệ.

Nguyê
MT nhân giống
MT lên men
Hình 2.1: Sơ đồ công nghệ tổng quát sản xuất kháng sinh Pencillin.
2.2. Quá trình lên men sản xuất Penicillin.
Nhóm 7 Page 19
Penicillium
chrysogenum.
Nguyên liệu
Nhân giống
Lên men
Tách và tinh chế
Sản phẩm
1
9
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
Hình 2.2: Thiết bị lên men
2.2.1.Đặc điểm về thiết bị lên men
Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày nay chủ yếu được tiến hành
trong thiết bị lên men chìm chế tạo bằng nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với
khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách
dẫn dòng trong thùng). Công suất khuấy trộn tiêu hao được thiết kế khoảng
3kW/m
3
/h.
Không khí nén đã vô khuẩn được cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng
xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát dưới đáy (hay phía dưới cánh tuốc-
bin). Bên trong thiết bị được lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng
xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm

bảo điều nhiệt hiệu quả trong suốt quá trình lên men.
Dung tích thiết bị phổ biến trong khoảng 150 – 300m
3
, hệ số đổ đầy
thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật và thiết bị phá bọt). Thiết
bị nhận sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, được thiết
kế tương tự và thường được ghép cứng với thiết bị lên men. Toàn bộ thiết bị
lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn và hệ thống trang thiết bị phụ trợ
được thiết kế và lắp đặt đảm bảo có thể vệ sinh và thao tác vận hành theo chế
độ vô khuẩn cao (tốt nhất nên bố trí sao cho có thể áp dụng chế độ thanh trùng
đồng thời cho toàn bộ hệ thiết bị này).
Nhóm 7 Page 20
2
0
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
Các thông số kiểm tra quá trình lên men bao gồm: pH môi trường, nồng độ
oxy hòa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối và tốc độ biến thiên lượng sinh
khối, số lượng, kích thước và cấu trúc pellet, nồng độ các cấu tử cơ chất, nồng
độ penicillin, thành phần khí thải và các chỉ tiêu kiểm tra về vi sinh vật.
2.2.2.Thành phần môi trường dinh dưỡng .
Môi trường cơ sở để lên men penicillin, vào thời kỳ đầu trong những năm
40 - 50 là môi trường lactoza - nước chiết ngô.
Nguồn cơ chất chính:là lactoza có thể được thay thế từng phần hoặc toàn bộ
bằng các cơ chất khác như: các loại đường hexoza, đường pentoza, disaccarit,
dextrin hay thay thế bằng dầu thực vật. Trong các cơ chất nêu trên, hiệu quả
cao hơn cả vẫn là glucoza.
Ngoài ra, khi sử dụng dầu thực vật làm chất phá bọt phải xét đến hiệu ứng
nấm mốc sử dụng một phần dầu thực vật làm nguồn cung cấp thức ăn cacbon,
để tính toán điều chỉnh nồng độ glucoza trong môi trường lên men (và cả sự

cản trở quá trình chuyển khối do ảnh hưởng của dầu phá bọt).
Nguồn cung cấp thức ăn nitơ: có thể sử dụng là bột đậu tương, bột hạt bông,
các loại dầu cám. Nhu cầu về thức ăn nitơ cũng có thể được đáp ứng bằng cách
cung cấp liên tục (NH
4
)
2
SO
4
, nhưng duy trì ở nồng độ thấp, khoảng 250 -
340g/l (nếu dư thừa hiệu quả sinh tổng hợp penicillin sẽ giảm, nếu thiếu sẽ xảy
ra hiện tượng tự phân hệ sợi) .
Nhóm 7 Page 21
2
1
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
Hàm lượng các chất khoáng bổ sung: Được tính toán, phụ thuộc vào lượng
dịch chiết ngô sử dụng; pH môi trường được điều chỉnh trước khi thanh trùng,
sau đó trong suốt quá trình lên men được giám sát chặt chẽ và điều chỉnh theo
yêu cầu công nghệ.
Nồng độ tiền chất tạo nhánh: Trong quá trình sinh tổng hợp penicillin, việc
kết gắn mạch nhánh của phân tử penicillin không mang tính đặc hiệu chặt chẽ.
Nhờ vậy, nếu duy trì nồng độ tiền chất tạo nhánh cần thiết phenylacetat (hoặc
phenooxyacetat) sẽ cho phép thu nhận chủ yếu một loại penicillin G trong dịch
lên men (hoặc penicillin V). Theo lý thuyết, nhu cầu về phenylaceta là
0,47g/gam penicillin G (hoặc phenooxyacetat là 0,50g/gam penicillin V ). Cần
chú ý cả hai cấu tử trên thực chất đều gây độc cho nấm nên người ta thường
lựa chọn giải pháp bổ sung liên tục cấu tử này và khống chế chặt chẽ nồng độ
theo yêu cầu, để không làm suy giảm năng lực lên men của chủng sản xuất.

Bảng 2.1: Thành phần môi trường nhân giống Penicillium
Thành
phần
Cao
ngô
Glucose lactose Nitrat
amon
Sunfat
magie
Sunfat
natri
Kaliphosphat
monoboric
CaCO
3
% 2 2 0,5 0.125 0.025 0.05 0.2 0.5
Bảng 2.2: Thành phần môi trường lên men
ST
T
Thành phần
Môi trường
1
Môi
trường 2
Môi
trường 3
1 Cao ngô 2.0-2.4 - 2.0-3.0
Nhóm 7 Page 22
2
2

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
2
Khô hạt có dầu (lạc,
đậu tương hứơng dương)
- 2.0-2.4
3 Lactose 5.0 5.0 1.0
4 Glucose hoặc hydol 1.0 1.0 1.0
5 Dầu thực vật 0.5-1.0 0.5-1.0 2.5-3.5
6 Amon nitrat 0.4 0.4 0.4
7 Sulfat natri 0.05 0.05 0.05
8 Kali photphat 0.4 0.4 0.4
9 Magie sulfat 0.025 0.025 0.25
10 Natri hyposunfit 0.2 0.2 0.2
11 Canxi cacbonat 0.5-1.0 0.5-1.0 0.5-1.0
12 Tiên chất 0.2-0.4 0.3-0.4 0.3-0.4
2.2.3. Điều kiện lên men.
- Nhiệt độ :là thông số có ảnh hưởng lớn đến sự phát triển của nấm mốc,
khả năng sinh tổng hợp và năng lực tích tụ penicillin của chúng. Nhìn chung
nấm mốc phát triển thuận lợi hơn ở dải nhiệt độ khoảng 30
0
C. Tuy nhiên, ở ở
dải nhiệt độ này tốc độ phân huỷ penicillin cũng xảy ra mạnh mẽ. Trong thực
tế, ở giai đoạn nhân giống sản xuất người ta thường nhân ở dải nhiệt độ 30
0
C;
sang giai đoạn lên men thường áp dụng một trong hai chế độ nhiệt là :
Nhóm 7 Page 23
2
3

Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
+ Lên men ở một dải nhiệt độ: Thường duy trì nhiệt độ trong suốt quá trình
lên men ở dải nhiệt độ 25 - 27
0
C.
+ Lên men ở hai chế độ nhiệt độ: Giai đoạn lên men bắt đầu tiến hành ở
30
0
C cho đến khi hệ sợi phát triển đạt yêu cầu về hàm lượng sinh khối thì điều
chỉnh nhiệt độ sang chế độ lên men penicillin ở dải nhiệt độ 22 - 25
0
C (có công
nghệ điều chỉnh xuống 22 - 23
0
C, giữ ở nhiệt độ này tiếp hai ngày rồi chuyển
sang lên men tiếp ở 25
0
C cho đến khi kết thúc quá trình lên men).
- pH môi trường: thuận lợi cho sự phát triển hệ sợi và cho quá trình
sinh tổng hợp penicillin thường dao động trong khoảng pH = 6,8 - 7,4. Tuy
nhiên ở điều kiện pH cao xu hướng phân huỷ penicillin cũng tăng lên. Vì vậy,
trong sản xuất pH môi trường thường được khống chế chặt chẽ ở giá trị lựa
chọn trong khoảng pH = 6,2 - 6,8.
- Nồng độ oxy hoà tan và cường độ khuấy trộn dịch lên men: Với
nhiều chủng nấm mốc, nồng độ oxy hòa tan thuận lợi cho quá trình sinh tổng
hợp penicillin dao động quanh mức 30% nồng độ oxy bão hòa.
- Nồng độ CO
2
trong dịch lên men: ở mức nhất định cũng cần thiết cho

quá trình nảy mầm của bào tử nấm mốc; tuy nhiên nếu nồng độ CO
2
quá cao sẽ
làm cản trở quá trình hấp thu và chuyển hoá cơ chất của chủng, nghĩa làm làm
cản trở quá trình sinh tổng hợp penicillin.
Nhóm 7 Page 24
2
4
Bài tập nhóm môn vi sinh II GVHD:Phạm Thị
Hương
2.2.4. Tiến hành lên men.
Kỹ thuật được áp dụng là lên men chìm được vận hành theo phương pháp
lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung
liên tục (hay bán liên tục) một hay một vài cấu tử kết hợp với phương án tuần
hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men trước (hoặc không).
Giống nấm men được sử dụng là Penicillium chrysogenum.
Trong quá trình lên men chìm người ta nhân giống trong môi trường lỏng.
Mục đích của quá trình nhân giống là thu nhận được số lượng tế bào cao
( thường tính tổng lượng tế bào/ml).
 Quá trình nhân giống :được bắt đầu bằng việc chuyển giống từ ống nghiệm
sang những bình tam giác đã chứa sẵn môi trường nhân giống. Người ta
thường nhân giống vào các bình lên men dung tích từ 1 lít cho đến hàng ngàn
lít. Nhiệt độ trong quá trình nhân giống duy trì ở khoảng 26 ± 1
o
C và thời gian
nhân giống ở mỗi cấp độ khoảng 72 giờ. Thành phần môi trường lên men cho
ở bảng 2.1.
 Quá trình lên men: Quá trình lên men trong môi trường lỏng bằng phương
pháp lên men chìm để sản xuất penicillin được vận hành theo phương pháp lên
men hai pha:

- Pha thứ nhất: nuôi thu sinh khối trong khoảng 2 – 3 ngày. Trong pha này
hệ sợi phát triển rất mạnh vì các chất dinh dưỡng dễ đồng hóa sẽ được tế bào
Nhóm 7 Page 25
2
5