Enzyme trong chế biến thủy sản

Chương 1
Tổng quan
1.1 Tổng quan về enzyme
Enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa học trong và
ngoài cơ thể. Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện ôn
hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất hóa học
cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản
ứng hóa học càng cao.
Ưu điểm:
- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa để
giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rất
cao.
- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm phản ứng đầu
sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.
- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật. Số lượng enzyme được
tổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ
thể. Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởi enzyme.
- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà khoa học đã
tìm ra trên 1000 loại enzyme khát nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này là rất
nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào. Trong hơn 1000 loại enzyme đã biết,
loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại.
1.2 Một số enzyme
1.2.1 Enzyme α–amylase
1.2.1.1 Đặc điểm
Enzyme α–amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50000 đến 60000Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α–amylase từ loài vi
khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130000Dal. Các nghiên cứu về
tính đồng nhất của chuỗi mạch acid amin và về vùng kị nước cho thấy các chuỗi
mạch acid amin của tất cả các enzyme α–amylase đều có cấu trúc bậc 3 tương tự

nhau.
1
Hình 1: Cấu trúc không gian của enzyme α - amylase
1.2.1.2 Tính chất
Điều kiện hoạt động của α–amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống
nhau. pH tối thích cho hoạt động của α–amylase từ nấm sợi là 4.0 – 4.8 (có thể hoạt
động tốt trong vùng pH từ 4.5 – 5.8 ). Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt
động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.orysee trong vùng 5.6
– 6.2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của
nó là 6.0 – 7.0.
Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau, α–amylase của Asp.orysee
bền vững đối với acid tốt hơn là α–amylase của malt và vi khuẩn B. subtilis. Ở pH =
3.6 và ở 0°C, α–amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15 – 30 phút; α–amylase
vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α–amylase của nấm sợi
không giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi 1989). Trong dung dịch α–amylase
nấm sợi bảo quản tốt ở pH = 5.0 – 5.5; α–amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có
thể chịu được pH từ 2.5 – 2.8. Ở 0°C và pH = 2.5 , nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1
giờ.
Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α–amylase từ các nguồn khác nhau
cũng không đồng nhất, α–amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt.
Nhiệt độ tối thích của nó là 50°C và bị vô hoạt ở 70°C (Kozmina, 1991).
Trong dung dịch đệm pH = 4.7, α–amylase của Asp.orysee rất nhạy với tác động của
nhiệt độ cao, thậm chí ở 40°C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 –
29%, hoạt lực đường hóa còn 27 – 85%. Ở 50°C trong 2 giờ, α–amylase của nấm sợi
này bị vô hoạt hoàn toàn (Miller và cộng sự).
()
1.2.2 Enzyme β – amylase
1.2.2.1 Đặc điểm
Enzyme β-Amylase là một Enzyme ngoại bào (exoenzyme). Tiến trình phân giải bắt
đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng cơ chất. β – Amylase phân cắt các

liên kết α – l,4glucoside nhưng khi gặp liên kết α – 1,4 glucoside đứng kế cận liên kết
α-l,6glucoside thì nó sẽ ngừng tác dụng. Phần polysaccharide còn lại là dextrin phân
tử lớn có chứa rất nhiều liên kết α -1,6-glucoside và được gọi là dextrin.
2
Hình 2: Cấu trúc không gian enzyme β–amylase
1.2.2.2 Tính chất
Enzyme β–amylase là một albumin, tâm xúc tác có chứa nhóm –SH, nhóm X–COOH
và vòng imidazol của các gốc histidine và là Enzyme ngoại bào (exoEnzyme ).
Enzyme β–amylase không thuỷ phân tinh bột sống, mà chỉ có khả năng phân cắt
tinh bột đã hồ hoá. Enzyme β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không có Ca
2+
, và
bị kiểm hãm bởi Cu
2+
, Hg
2+
, urea, iodine, ozon,
Enzyme β-amylase chịu nhiệt kém hơn α–amylase nhưng bền với acid hơn. Enzyme
β–amylase bị bất hoạt ở nhiệt độ 70
0
C. Nhiệt độ hoạt động thích hợp của β-amylase
là 50-60
0
C, hoạt động thích hợp ở pH=4.2 – 5.6. Enzyme β-amylase có nguồn gốc từ
vi khuẩn thì bền nhiệt hơn của thực vật và nấm mốc.
Tham gia vào cơ chế tác dụng của β–amylase thường có một nhóm caboxyl thể hiện
tính chất ái nhân và một nhóm imidazol thể hiện tính chất ái electron. Sự nghịch
đảo hình thể của cacbon anome (Cl) được thực hiện nhờ việc tạo thành hợp chất
đồng hoá trị trung gian kiểu este axetal giữa cacbon anome và nhóm cacboxyl của
tâm hoạt động. Sau đó este này bị phân huỷ bởi tác động của một phân tử nước lên

nhóm cacboxyl để giải phóng ra α – maltose và hoàn nguyên nhóm cacbxyl của
Enzyme.
()
1.2.3 Enzyme γ – amylase
1.2.3.1 Đặc điểm
Enzyme này có nhiều tên gọi khác nhau: amyloglucosidase, glucoamylase, α–1,4–
gucan–glucohdrolase, α–l,6–glucan–4, 6–glucohydrolase, taka–amylase B, -amylase,
thuộc nhóm enzyme ngoại bào exoamylase chủ yếu được tạo ra bởi các vi sinh vật.
Đặc biệt là kiểu nấm mốc aspergillus, pesnicillium và Rhizopus.
Amyloglucosidase từ nấm mốc là các protein có khối lượng phân tử lượng dao động
rất lớn từ 27000 đến 112000Dal tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme. Nói chung
thì các amyloglucosidase đều chứa các gốc mêthioni, tritophan, và một nửa gốc
cystein.
1.2.3.2 Tính chất
Các amyloglucosidase chủ yếu được tạo nên từ hai isoenzyme I và II khác nhau ở
khả năng thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn và bởi độ bền của chúng.
Amyloglucosidase I tự hấp thụ và thuỷ phân tinh bột ở trạng thái rắn, ngược lại
amyloglucosidase II không có cả hai tinh chất này.
Đặc trưng phản ứng: enzyme γ-amylase xúc tác phảnứng thủy phân liên kết 1,4-1,6
o-glucoside và tách tuần tự từng gốc gluco từ đầu không khử của chuỗi
polysaccharide.
Enzym γ-amylase xúc tác phản ứng thủy phân tinh bột và tách tuần tự từng gốc
glucose từ đầu không khử của chuổi polysaccharide. Gốc glucose từ đầu không khử
3
được gọi là glycone, còn chuổi oligosaccharide sau khi glucose được tách ra thì
được gọi là Alglycone.
Hoạt tính:
- pH = 3.5 – 5.5
- Nhiệt độ 50°C
- Bền với acid hơn α–amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không

được bảo vệ bởi Ca
2+
.
()
1.2.4 Enzyme protease
Enzyme protease là các protein có khối lượng phân tử lượng rất lớn từ 27000 đến
112000 Dal, tuỳ thuộc vào nguồn gốc của enzyme.
Protease cần thiết cho sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ cấp độ tế bào, liên
quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rãi trên nhiều đối tượng từ vi sinh vật, thực
vật, động vật. So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc
điểm khác biệt. Hệ enzyme protease trong vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp
bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về mặt cấu trúc, khối lượng và hình dạng
phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. Nó cũng là phức hệ nhiều
enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản
phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng.
Protease là các enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptit (-CO-NH-) trong phân tử
protein và các cơ chất tương tự.
Nhiều protease có khả năng liên kết este và vận chuyển acid amin. Protease có khả
năng thuỷ phân protein thành acid amin, peptid mạch ngắn, pepton.
Theo phân loại quốc tế các enzyme thuộc nhóm này chia thành 4 phân nhóm phụ:
- Aminopeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu nitơ của mạch
polypeptit.
- Cacboxypeptidase: xúc tác sự thủy phân liên kết peptit ở đầu cacbon của mạch
polypeptit. Cả hai phân nhóm enzyme trên đều là các exo – peptidase.
- Dipeptidhydrolase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết dipepit.
- Proteinase: Xúc tác sự thủy phân các liên kết peptid nội mạch.
1.2.5 Enzym Pullulanase
Enzym pullulanase (EC.3.2.1.41) là enzym thu nhận từ vi khuẩn Aerbacter
aerogenes hay từ Klebsiella.
Enzym pullulanase thuỷ phân các liên kết α–1,6–glycoside trong tinh bột và

glycogen. Phân tử lượng của nó là 14500. Enzym này có khả năng thuỷ phân những
dextrin phân tử thấp chỉ gồm hai gốc maltose nối với nhau bằng liên kết α–1,6–
glycoside.
Dưới tác động của isoamylase hay pullulanase, sản phẩm tạo thành sẽ là glucose.
Trong quá trình thuỷ phân người ta sử dụng enzym này với amyloglucosidase. Hoạt
4
tính tối ưu của chúng ở pH = 6 và nhiệt độ tối ưu 60
0
C. Khi thuỷ phân cùng với
amyloglucosidase, hoạt tính tối ưu của chúng ở pH= 4.0 – 5.0 và nhiệt độ 45
0
C.
(Hoàng Đình Hoà, 2000)
1.2.6 Enzyme cellulase
1.2.6.1 Đặc điểm
Enzyme cellulase là một phức hệ enzyme có tác dụng thuỷ phân cellulose thông qua
việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose tạo ra sản phẩm glucose cung
cấp cho công nghiệp lên men. Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm: endo-β-1,4-
glucanase, exoglucanase, và β-glucosidase thủy phân cellulose thành glucose.
- Endo-β-1,4-glucanase đựợc gọi là endoglucanase hoặc 1,4-β-D-glucan-4-
glucanohydrolase hay CMCase (EC 3.2.1.4). Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng 1
của phức hệ cellulase.2
- Exoglucanase, gồm 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase (giống như cello
dextrinase) (EC 3.2.1.74) và 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase (cellobiohydrolase)
(EC 3.2.1.91).
- Dạng 3 là β -glucosidase hoặc β -glucoside glucohydrolase (EC 3.2.1.21).
1.2.6.2 Tính chất
Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại
oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu
khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose

(glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase).
Endocellulase: xúc tác quá trình cắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin
và α-D-glucan một cách ngẫu nhiên. Sản phẩm của qúa trình phân giải là các
cellulose phân tử nhỏ, cellobiose và glucose.
Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose tạo
thành các cellobiose (disaccharide) và một số cellotetrose.
()
1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme
1.3.1 Nhiệt độ
Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác của enzyme, bản
chất của enzyme là protein nên không bền ở nhiệt độ cao, cấu hình có được là nhờ
các lực hấp dẫn yếu (liên kết hidro); các liên kết này trở nên không bền khi nhiệt độ
cao làm cho enzyme trở nên biến tính, trung tâm hoạt động mất đi cấu hình chuẩn
và không phù hợp với cơ chất, do đó không thể hoạt động như chất xúc tác.
Phản ứng hoá học có sự xúc tác enzyme cũng tuân theo quy luật Vant – Hoff (khi
tăng nhiệt độ lên 10
0
C thì tốc độ phản ứng tăng lên 2 lần). Ở mỗi cơ thể khác nhau
thì thường không giống nhau (amilaza ở sinh vật là 70
o
C còn ở người là 37
o
C).
Mỗi enzyme có một nhiệt độ tối thích khác nhau, phần lớn phụ thuộc nguồn cung
cấp enzyme, thông thường ở trong khoảng từ 40 – 60
o
C. Ở nhiệt độ thấp, enzym
5
không mất hoạt tính mà chỉ giảm, khi nâng lên nhiệt độ tối thích thì hoạt động bình
thường và khi quá nhiệt độ tối thích thì enzyme bị tiêu diệt.

1.3.2 pH
Hoạt tính của enzym phụ thuộc chặt chẽ vào pH của môi trường. Trị số pH mà tại đó
enzyme hoạt động mạnh là pH tối thích và thường thì không giống nhau.
Ảnh hưởng của giá trị pH đến tác dụng enzyme có thể:
- Enzyme có sự thay đổi không thuận nghịch ở phạm vi pH cực hẹp.
- Ở hai sườn của pH tối thích có thể xảy ra sự phân ly nhóm prosthetic hay
coenzyme.
- Làm thay đổi mức ion hóa hay phân ly cơ chất.
- Làm thay đổi mức ion hóa nhóm chức nhất định trên phân tử enzyme dẫn đến làm
thay đổi ái lực liên kết của enzyme với cơ chất (thay đổi hoạt tính).
1.3.3 Các chất hoạt hoá (activator)
Là chất làm tăng khả năng xúc tác chuyển hóa cơ chất thành sản phẩm. Thông
thường là những cation kim loại hay những hợp chất hữu cơ như các vitamin tan
trong nước.
Các cation kim loại có thể có tính đặc hiệu, tính đối kháng và tác dụng còn tuỳ thuộc
vào nồng độ.
1.3.4 Các chất kìm hãm (inhibitior)
Chất kiềm hãm là chất có tác dụng làm giảm hoạt độ hay làm enzyme không còn
khả nâng xúc tác biến cơ chất thành sản phẩm. Có 2 loại:
- Kìm hãm không thuận nghịch (irreversible inhibition): chất kìm hãm liên kết với
enzym – cơ chất làm thay đổi cấu trúc, hoạt tính.
- Kìm hãm thuận nghịch (reversible inhibition): có 2 dạng
+ Kìm hãm cạnh tranh (Competitive inhibition): chất kìm hãm cấu tạo tương tự cơ
chất, kết hợp tạo phức với enzym, ngăn cản sự tạo phức của emzym – cơ chất.
+ Kìm hãm phi cạnh tranh (Uncompetitive inhibition): chất kìm hãm gắn vào vị trí
khác trong phân tử enzym nên không ngăn cản sự tạo phức enzym – cơ chất nhưng
làm giảm hoạt tính của enzym.
1.3.5 Nồng độ enzym, cơ chất
Nồng độ enzyme càng cao thì vận tốc phản ứng enzyme càng lớn. Vận tốc đạt cực
đại khi toàn bộ enzyme liên kết với cơ chất.

1.3.6 Các yếu tố khác
Ánh sáng: có ảnh hưởng khác nhau đến từng loại enzyme, các bước sóng khác nhau
có ảnh hưởng khác nhau, thường ánh sáng trắng có tác động mạnh nhất, ánh sáng
đỏ có tác động yếu nhất. Ánh sáng tử ngoại cũng có thể gây nên những bất lợi.
Sự chiếu điện: điện chiếu với cường độ càng cao thì tác động phá hủy càng mạnh.
6
Sóng siêu âm: tác động rất khác nhau đối với từng loại enzyme, có enzyme bị mất
hoạt tính, có enzyme lại không ảnh hưởng.
7
Ngâm nước
Để nguội
Lên men
Chưng cất
Trộn bánh men
Nguyên liệu
Sản
phẩm
Nấu chín
Chương 2
Ứng dụng của enzyme trong sản xuất rượu
2.1 Quy trình sản xuất rượu
Hình 3: Quy trình sản xuất rượu
2.2 Giải thích quy trình
2.2.1 Nguyên liệu
Gạo, nếp hoặc các loại nông sản có hàm lượng tinh bột cao thường chứa khoảng
14% nước và trên 74% tinh bột. Nguyên liệu tốt không sâu mọt, mốc, không lẫn tạp
chất khác, …
2.2.2 Ngâm nước
Cho nguyên liệu ngâm trong nước nhằm loại bỏ tạp chất bẩn để rượu có chất lượng
cao. Trong quá trình ngâm nguyên liệu hút nước và trở nên mềm hơn, rút ngắn thời

gian nấu.
8
2.2.3 Nấu chín
Sau khi ngâm nguyên liệu được để ráo và cho vào nồi, thêm nước và nấu chín.
Lượng nước cho vào được tính toán sao cho cơm sau khi nấu không quá nhão cũng
không quá khô. Tỉ lệ gạo nước khoảng 1:1 theo thể tích.
Mục đích của công đoạn nấu chín nhằm hồ hoá tinh bột dưới tác dụng của nhiệt độ
cao sẽ cung cấp năng lượng để giải phóng các hạt tinh bột ra khỏi lớp vỏ bọc bên
ngoài, đồng thời các phân tử tinh bột hút nước sẽ trương lên do liên kết giữa các
phân tử tinh bột bị yếu đi, điều này giúp cho vi sinh vật dể dàng thuỷ phân tinh bột
thành đường, cung cấp đường cho nấm men lên men rượu. Có thể thay thế phương
pháp nấu bằng phương pháp hấp để cơm không bị nhão và hạn chế tổn thất chất
dinh dưỡng.
- Vai trò của amylase: α – amylase hoạt động mạnh trong giai đoạn đầu của quá
trình đường hóa. Nguyên nhân vì có sự thay đổi pH trong thời gan đường hóa và
giới hạn hoạt động của a-amylase tới đường không vượt quá 70 – 80%. Như vậy vai
trò cơ bản của enzyme trong giai đoạn này là làm dịch hóa nhanh ở giai đoạn nấu
và cả giai đoạn đầu của quá trình đường hóa, dextrin và tích tụ đường.
- Vai trò của glucoamylase: Glucoamylase thủy phân kiên kết α-1,4-glucose trong
các polysacharide. Ngoài ra enzyme này còn có khả năng phân cắt liên kết α–1,6-
glucoside. Phần lớn các glucoamylase hoạt động ở pH không cao. Nhiệt độ tối ưu là
55 – 60°C. Sản phẩm cuối cùng của quá trình thủy phân này là glucose.
- Vai trò của pululanase: Đây là enzyme tham gia thủy phân liên kết α – 1,6
glucoside trong các polyscharide và oligosacharide. Pululanase phân cắt liên kết α–
1,6 glucoside trong trường hợp liên kết này được bao quanh tất cả các phía nhờ liên
kết α–1,4 glucoside. Dextrin có phân tử thấp, dễ bị pululanse phân hủy tạo thành từ
2 gốc maltose, nối với nhau bằng liên kết α–1,6 glucoside. Nếu có sự kết hợp của α-
amylase và pululanase, dextrin sẽ bị thủy phân hoàn toàn.
- Vai trò của hệ enzyme cellulase: Các hệ thuộc nhóm enzyme cellulase (cellulase,
hemicellulase, xylanase gia phân huỷ các polysacharide không phải là glucide. Các

chất này bao gồm cellulose, hemicellulose, pectin, … Các chất này nằm trong thành
tế bào của tế bào thực vật, nằm ở gian bào và một số thành phần khác. Việc phá vỡ
các thành phần này sẽ làm tăng khả năng chuyển hóa vật chất có trong tế bào. Như
vậy việc bổ sung enzyme cellulase vào trong quá trình đường hoá thấy rằng hàm
lượng đường galactose, arabinose, cylose, glucose tăng lên. Khi tiến hành lên men,
dung dịch đường hoá bởi amylase và các enzyme cellulase hiệu suất cồn tăng 15%.
Hệ enzyme cellulase được coi như biện pháp tăng cường khả năng đường hoá và
làm tăng hiệu suất thu cồn sau lên men.
- Vai trò của enzyme protease: Khi xử lý nguyên liệu bằng chế phẩm protease, trong
dung dịch đường hóa tích tụ nhiều amino acid. Amino acid là thành phần rất cần
thiết cho sự phát triển của nấm men.
2.2.4 Làm nguội
Nguyên liệu sau khi nấu chín được trãi đều trên một bề mặt phẳng để làm nguội đến
nhiệt độ thích hợp (khoảng 35 – 40
o
C) cho việc trộn bánh men rượu. Nếu cho men
9
vào lúc nhiệt độ cơm cao sẽ làm bánh men rất khó hoạt động hoặc có thể gây chết
men. Bánh men rượu được trộn vào bằng cách bóp nhỏ, rắc đều lên bề mặt lớp
nguyên liệu với tỷ lệ thích hợp tùy theo hướng dẫn trên từng loại men. Sau đó cho
hỗn hợp vào thiết bị và đậy kín để tiến hành quá trình lên men.
2.2.5 Lên men
Gồm hai giai đoạn: lên men ẩm và lên men lỏng
2.2.5.1 Lên men ẩm
Quá trình lên men ẩm chính là quá trình tạo điều kiện cho enzym amylase của nấm
mốc, vi khuẩn xúc tác thủy phân tinh bột.
Cơm đã trộn men được đem ủ trong 5 – 10 giờ để mốc mọc đều cả khối cơm; sau đó
vun thành đống, phủ kín bằng vải và giữ ở nơi thoáng mát (nhiệt độ 28 – 32
o
C)

trong 2 – 3 ngày. Mục đích của quá trình này là tạo điều kiện cho nấm mốc và vi
khuẩn phát triển, tiết ra enzym đường hóa tinh bột. Trong giai đoạn này, nấm men
cũng bắt đầu phát triển và chuyển hóa một ít đường thành rượu.
2.2.5.2 Lên men lỏng
Quá trình lên men lỏng: nấm men sử dụng đường tạo ra để lên men rượu.
Khi cơm ủ có mùi thơm nhẹ của rượu, ăn thấy ngọt, có hơi cay vị của rượu thì
chuyển sang ủ trong chum vại kín với nước sạch theo tỉ lệ gạo:nước = 1:2 – 3. Thời
gian ủ lỏng (lên men lỏng) khoảng 2 – 3 ngày. Cơm rượu ủ trong điều kiện kín, nấm
mốc ngừng phát triển nhưng enzyme tạo thành vẫn tiếp tục thủy phân tinh bột.
Trong giai đoạn này, nấm men phát triển mạnh nhờ lượng oxi hòa tan trong nước
và lượng đường tạo thành, sau đó chuyển sang lên men rượu.
2.2.6 Chưng cất
Quá trình lên men kết thúc thì tiến hành chưng cất để thu được rượu thành phẩm.
Quá trình chưng cất rượu nhằm tách hỗn hợp rượu và nước có nhiệt độ sôi khác
nhau. Ở áp suất thường, rượu sôi và bốc hơi ở 78
o
C, còn nước là 100
o
C. Khi chưng
cất, rượu được tách ra khỏi nước nhờ nhiệt độ bốc hơi thấp hơn nước. Quá trình
chưng cất được tiến hành bằng cách đun sôi hỗn hợp lên men, hơi bay lên được dẫn
qua ống dẫn và được làm lạnh bằng cách cho ống dẫn đi qua bồn nước để ngưng tụ
rượu bên trong lòng ống. Dung dịch rượu thu được trong suốt, có mùi thơm đặc
trưng và nồng độ rượu sẽ giảm dần theo thời gian chưng cất. Tùy theo yêu cầu của
khách hàng mà ta có thể tiến hành pha trộn các loại rượu thu được ở các khoảng
thời gian chưng cất khác nhau để tạo ra rượu có nồng độ khác nhau.
10
Ủ
Lên men phụ Làm trong bia Bão hoà CO2
Chiết rót chaiThanh trùng

Thành phẩm
Đại mạch Ngâm Ươm mầm Sấy Nghiền
Đường hoáLọc bã
Nấu
Lọc bã maltLàm lạnh
Lên men chính
Chương 3
Ứng dụng enzyme trong sản xuất bia
3.1 Quy trình sản xuất bia
Hình 4: Quy trình sản xuất bia
3.2 Giải thích quy trình
3.2.1 Nguyên liệu
Hạt đại mạch đem về được làm sạch, phân loại và tách các tạp chất trước khi đưa
đại mạch vào quá trinh ươm mầm.
3.2.2 Ngâm
Mục đích: loại bỏ hạt lép, hạt không lép nhưng không chắc, các tạp chất, … mà trong
quá trình làm sạch và phân loại hạt chưa loại bỏ ra khỏi khối hạt, đồng thời còn rữa
sạch bụi và một số vi sinh vật, côn trùng bán trên hạt.
Tăng độ ẩm của hạt lên 43 – 45% đối với malt vàng và 45 – 47% đối với malt đen.
3.2.3 Ươm mầm
Mục đích:
- Tạo và hoạt hóa enzyme amylase.
- Tấn công và làm thay đổi khả năng thẩm thấu màng tế bào của nội nhũ nhờ
enzyme sitase.
- Biến tính hay hòa tan protein bởi enzyme protease.
- Làm nội nhũ mềm.
11
3.2.3.1 Enzyme trong quá trình ươm mầm
- Tác động của Sitase (β – glucanase – pentosanase)
Sitase là nhóm enzyme thủy phân thành hemixenlulo, cấu tử chủ yếu của thành tế

bào thành các hợp chất trung gian, sau đó thành đường đơn pentose, hexose và các
sản phẩm khác. Sitase hoạt động trước các enzyme khác, và nó bắt đầu tác động
của mình ở phần gần nội nhũ.
Trong thời kỳ ươm mầm, đầu tiên là sự hóa lỏng màng của tế bào gần kề với ngù,
tiếp đó sang đến phần đối diện. Enzyme tấn công theo trục của hạt. Mất khoảng 7 –
8 ngày ở nhiệt độ 14 – 15
0
C để cho Sitase phân giải hạt hoàn toàn. Khả năng họa
động của Sitase quyết định thời gian nảy mầm hạt. Khi nhiệt độ tăng thì khả năng
tấn công của Sitase tăng.
Tuy nhiên, sự tấn công của sitase sẽ hiệu quả và đều đặn hơn ở nhiệt độ thấp. Hoạt
động của Sitase còn phụ thuộc vào bản chất đại mạch. Đại mạch càng nhiều nitơ thì
càng khó nhuyễn hơn các hạt đại mạch khác.
Sitase không hòa tan màng tế bào mà làm thay đổi một cách sâu sắc khả năng thấm
qua màng tế bào, tạo điều kiện cho các enzyme khác và các sản phẩm của các quá
trình phân hủy đi qua một cách dễ dàng.
- Hoạt động của protease
Protease được tiết ra từ phôi hạt và hoạt động ngay khi bắt đầu ươm mầm.
Protease tác động trước tiên vào các tế bào nội nhũ. Protease liên tục thuỷ phân
protein thành các abumo, pepton (tan trong dung dịch keo) sau đó thành các chuỗi
peptid và cuối cùng là các acid amin hoà tan trong dịch thực.
Các acid amin tan trong dịch thấm vào hạt và phân tán qua ngù rồi đến mầm. Các
acid amin là nguồn cung cấp nito chủ yếu cho mầm.
- Tác động của amylase
Có hai dạng enzyme amylase chính: α–amylase và β – amylase. Nguồn gốc của các
enzyme này được xét qua hai mặt: được hoạt hoá do enzyme Protease và amylase
chiết ra từ các tế các tế bào gần phôi, bởi vì trong quá trình nảy mầm, hoạt lực
enzyme tăng nhiều nhất ở xung quanh phôi. Amylase còn tác động lên các phần
khác của hạt.
Trong giai đoạn ươm mầm, khả năng dịch hoá tăng dần nhưng chậm hơn khả năng

đường hoá. Các amylase tấn công và ăn mòn bề mặt hạt tinh bột. Các tế bào gần
mầm bị tấn công mạnh hơn còn các tế bào khác hầu như không bị tấn công. Maltose
được tạo thành dưới dạng hoà tan và di chuyển đến mầm.
- Thuỷ phân lipid nhờ lipase
Có khoảng 20 – 30% lipid bị thuỷ phân. Acid oleic bị phân huỷ hoàn toàn và acid
linoleic bị phân huỷ một phần. Một phần acid oleic được dùng để chuyển thành acid
stearic, còn lại phần lớn acid oleic tiêu tốn do hô hấp. Đầu tiên có khoảng 1.4 – 1.5 g
acid béo có trong 100g đại mạch, sau khi thuỷ mầm lượng này còn 1.2 – 1.3 g trong
100 g malt.
12
- Hoạt động của enzyme amylophotphatase, đặc biệt là enzyme phytase thuỷ phân
các este photphoric
Cơ chất của quá trình thuỷ phân là phytin, có nhiều trong tế bào alơron và este
hexaphotphoric của inosit, được chuyển thành hỗn hợp muối photphat của một hay
hai nguyên tử kim loại và các inosit. Các muối photphat này có tác dụng tạo tính
đệm và giữ pH = 5.7 trong quá trình nấu bia.
3.2.4 Sấy malt
Mục đích:
- Dừng quá trình nảy mầm và quá trình chuyển hóa tiếp theo.
- Cung cấp cho malt hương vị phù hợp cho loại bia làm từ chúng.
Malt tươi trước khi sấy có độ ẩm 45%, sấy để giảm độ ẩm xuống nhỏ hơn 5%. Nhiệt
độ sấy luôn đạt 80
o
C, nhiệt độ cuối cùng không vượt quá 105
o
C.
3.2.5 Nghiền malt đại mạch
Mục đích: Nhằm đưa nghiên liệu ở dạng hạt về dạng bột dề dàng thấm nước, tạo
điều kiện thuận lợi cho sự biến đổi lý hóa, sinh hoá trong quá trình đường hoá.
Nhằm thu được chất chiết cao nhất.

Yêu cầu về malt: nội nhũ phải mịn nhưng vỏ trấu chỉ dập chứ không nát để dể dàng
quá trình lọc. Vì vậy nghiền malt có thể thực hiện theo 2 phương pháp: nghiền khô
và nghiền ướt.
3.2.6 Quá trình đường hóa
Mục đích: nhằm chuyển tất cả các chất cao phân tử nằm đưới dạng không hoà tan
trong tinh bột về dạng hoà tan, chúng sẽ cùng với những chất hoà tan trong tinh
bột gạo thành chất hoà tan chung của dịch đường nhờ tác động của hệ thống
enzyme sẵn có trong malt. Bao gồm các quá trình thủy phân quan trọng: thủy phân
tinh bột, thủy phân β-glucan và thủy phân protein.
3.2.6.1 Quá trình thủy phân tinh bột
Tinh bột được thuỷ phân thành đường và dextrin. Quá trình thuỷ phân tinh bột xảy
ra theo 3 giai đoạn là hồ hoá, dịch hoá và đường hoá.
- Hồ hóa:
Khi ngâm với nước nóng, một lượng nước lớn ngấm vào phân tử tinh bột làm thể
tích hạt tăng lên và hạt bột trương nở, cuối cùng vỡ tung, dịch trở nên nhớt. Tạo
điều kiện cho các enzyme có trong dịch tấn công trực tiếp vào tinh bột.
- Dịch hóa:
Trong phân tử tinh bột có chuỗi mạch dài tạo nên từ các gốc glucose (amylose và
amylopectin) bị phá huỷ nhanh chóng bởi α–amylase hình thành mạch ngắn hơn.
Làm độ nhớt của dịch hồ hoá giảm nhanh. Enzyme β – amylase chỉ có thể phân tách
13
từ từ mạch tinh bột từ đầu không khử, do vậy mà sự thuỷ phân nhờ enzyme này rất
nhiều thời gian.
Do vậy, quá trình dịch hoá làm giảm độ nhớt của dịch bột đã hồ hoá.
- Đường hoá:
Enzyme α–amylase phân cắt dần dần mạch amyloza và amylopectin để tạo thành
các chuỗi ngắn mạch ngắn hơn, các dextrin chứa 7 – 12 gốc glucose. Các chuỗi này
lại được β–amylase tiếp tục phân cắt ra chuỗi có 2 gốc (maltose) từ đầu không khử.
Sự phân cắt của β–amylase diễn ra lâu hơn do sự phân cắt mạch dài của α–amylase.
Do có sự khác nhau về độ dài của các mạch mà ngoài sự tạo thành maltose còn tạo

nên các đường khác như glucose, maltotriose.
Trong quá trình phân cắt amylopectin luôn luôn hình thành các chuỗi chứa 2 – 3
gốc glucose có mối liên kết 1,6-glucan đó là các dextrin mà cả α–amylase và β–
amylase đều không phân cắt được mối liên kết này. Do vậy, các dextrin luôn tồn tại
trong dịch đường.
Trong malt còn chứa enzyme dextrinasa giới hạn, enzyme này không giống α, β –
amylase nó có thể phân cắt mối liên kết 1, 6 nhưng do nhiệt độ tối ưu của enzyme
này là 55 – 60
0
C và vô hoạt ở 65
0
C cho nên enzyme này có ảnh hưởng rất nhỏ trong
quá trình đường hoá.
Ngoài ra, γ–amylase tham gia thuỷ phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự
từng gốc glucose. Cắt liên kết α–1,4; α–1,6; α–1,2 và α-1,3-glucozid. Sản phẩm tạo
thành là glucose và oligosaccharide.
3.2.6.2 Thuỷ phân β – glucan
Thành tế bào nội nhũ của đại mạch chứa một mạng lưới các protein, cenlulose và
hemixenlulase vững chắc, các chất này liên kết với nhau bởi β–glucan. Enzyme β–
glucan có phân tử lượng cao có xu hướng tạo gel trong nhiều môi trường và làm
tăng độ nhớt của dịch đường và bia gây cản trở quá trình lọc. Vì vậy, cần phải kiểm
soát kỹ β – glucan.
(Nguyễn Thị Hiền)
3.2.6.3 Thủy phân protein
Bảng 1: Sản phẩm thuỷ phân protein
Các sản phẩm thủy phân
Tác động
Tốt Xấu
Cao phân tử (albumo, polypeptid, pepton) Tạo vị, tạo bọt Gây đục bia
Phân tử lượng thấp hơn (dipeptid, acid

amin)
Là nguồn dinh dưỡng cho nấm
men
“Nguồn: Nguyễn Thị Hiền”
14
Sự thủy phân protein nhờ enzyme protease diễn ra mạnh nhất tại 45 – 50
0
C, nhưng
còn tiếp diễn ở nhiệt độ cao hơn. Khi giữ 45
0
C trong thời gian dài sẽ tạo ra các phân
tử lượng thấp, ở 55
0
C sẽ tạo ra các hợp chất có phân tử lượng cao hơn.
Trong quá trình thủy phân, protein bị phân cắt dần thành các mạch nhỏ hơn và cứ
thế cuối cùng thành các acid amin. Do các hợp chất cao phân tử tạo thành trong
quá trình thủy phân protein lại tiếp tục bị phân cắt cho nên thời gian để tạo thành
chúng không cần kéo dài, đặc biệt là các chất keo, tạo bọt bị phân hủy ở cùng nhiệt
độ. Do vậy, nếu kéo dài thời gian đường hóa ở 50
0
C thì bia tạo thành sẽ ít bọt.
Một vấn đề khác cần xét đến là số lượng và tầm quan trọng của các acid amin. Nấm
men dùng ít nhất là 10 – 14 mg, α – amino nitrogen/100ml dịch đường. Bởi vì acid
amin prolin không được nấm men dùng làm chất cung cấp α–amino nitrogen, hàm
lượng nitơ ít nhất phải là 20/100ml dịch đường.
Khi nồng độ này không đảm bảo thì:
- Sự phát triển của nấm men chậm lại.
- Quá trình lên men và tạo hương, độ chín của bia bị chậm lại, do đó các hợp chất
tạo hương vị không mong muốn cho bia vẫn còn tồn tại trong bia.
Do vậy cần phải cung cấp đủ các α–amino acid cho nấm men thực hiện quá trình

trao đổi chất. Dịch đường từ malt đã được biến đổi tốt thì luôn luôn chứa đủ các α–
amin acid cần thiết, bảo đảm thời gian đạm hóa trong khoảng 15 – 30 phút ở 50 –
52
0
C.
3.2.7 Lọc bã
Mục đích: tách dịch đường hay dịch hèm với vỏ và những phần nội nhũ của hạt
không tan. Ngoài ra còn loại bỏ những chất không mong muốn như: kim loại nặng,
tanin, …
Quá trình lọc qua hai giai đoạn: lọc dịch đầu (tách dịch khỏi bã) và rửa bã (thu hồi
các chất hòa tan còn lại).
3.2.8 Nấu với hoa houblon
Mục đích: ổn định thành phần và tạo cho bia có mùi thơm và vị đắng đặc trưng của
hoa houblon. Đồng thời xãy ra cùng lúc các quá trình khác như sự gia tăng nồng độ,
độ acid, cường độ màu, … thỏa mãn các yêu cầu kĩ thuật, bên cạnh đó cũng có một
số quá trình không mong muốn.
Quá trình đun sôi: ban đầu nâng nhiệt độ khoảng 75 – 76
o
C giữ trong 10 phút, tiếp
đến nâng nhiệt độ đến nhiệt độ sôi giữ khoảng 30 – 40 phút, sau đó cho hoa houblon
vào, việc cho hoa được chia thành hai đợt, đợt đầu cho ½ lượng hoa đun sôi khoảng
90 – 120 phút, đợt hai cho ½ lượng còn lại và đun tiếp khoảng 30 phút.
3.2.9 Lọc trong
Mục đích: loại bỏ cặn, chất huyền phù và hoa houblon. Tạo điều kiện thuận lợi cho
vi sinh vật hoạt động.
3.2.10 Làm lạnh
Mục đích: tạo nhiệt độ thích hợp cho vi sinh vật lên men hoạt động.
15
Làm lạnh đến 6 – 12
o

C đối với nấm lên men chìm, 15 – 22
o
C đối với lên men nổi. Phải
tiến hành nhanh và vô trùng để ngừng các phản ứng hóa học và giảm tối đa các cơ
hội phát triển của vi sinh vật tạp nhiễm.
3.2.11 Lên men chính
Là quá trình lên men yếm khí và tỏa nhiệt dưới tác dụng của nấm men. Bao gồm
quá trình duy nhất là lên men rượu từ nguồn cơ chất cacbonhydrat có khả năng lên
men và cho sản phẩm lên men là rượu, acid, este và khí cacbonic.
Mục đích: quá trình là chuyển hoá các chất hoà tan ở trong dịch đường thành
C
2
H
5
OH, CO
2
và các sản phẩm phụ khác (sinh tổng hợp trong quá trình hoạt động
sống của tế bào nấm men) tạo thành bia theo yêu cầu kỹ thuật và chất lượng thành
phẩm.
Quá trình lên men chính thưòng xảy ra ở nhiệt độ 6 – 8
0
C trong thời gian 7 – 12
ngày đối với bia vàng, khoảng 12 – 18 ngày đối với bia đen.
3.2.12 Lên men phụ
Mục đích: Tiếp tục lên men phần chất khô còn sót lại sau lên men chính, bão hòa CO
2
và tăng cường mùi vị cho bia, thực hiện quá trình ủ chín của bia (ổn định chất
lượng bia), làm trong bia; đưa bia về nhiệt độ thấp để hạn chế sự xâm nhập và phá
hủy của vi sinh vật.
Thời gian lên men phụ: 15 - 35 ngày.

3.2.13 Làm trong bia
Mục đích: nhằm tách cặn lơ lửng, tách các tế bào nấm men sống và xác tế bào non
để tăng giá trị cảm quan, ổn định thành phần cơ học, làm tăng độ bền sinh học, độ
bền keo của bia.
Các phương pháp làm trong bia:
- Lắng: nhờ tác dụng của trọng lực, tính chất hạt cặn, kết tủa sẽ lắng và tách khỏi
bia.
- Li tâm: dùng lực li tâm tách kết tủa ra khỏi bia.
- Lọc: dùng bộ phận lọc (màng lọc, lớp lọc) để phân tách cặn.
3.2.14 Bão hòa CO
2
Do các công đoạn làm việc ở nhiệt độ cao và áp suất thấp nên hàm lượng CO
2
ít
nhiều sẽ giãm, do vậy trước khi chiết chai cần bổ sung CO
2
tới mức yêu cầu.
Hàm lượng CO
2
được bổ sung vào bia nhờ các đường ống dẫn dài kết hợp với các
đoạn nối mà hòa tan vào bia. Khí CO
2
bổ sung vào phải đãm bảo không chứa O
2
và vi
sinh vật tạp nhiễm.
3.2.15 Chiết chai và thanh trùng
Bia sau khi bão hòa CO
2
phải được chiết chai ngay. Chiết bia vào chai cần đãm bảo

không làm tổn thất bia, toàn bộ chai bia phải rót đủ lượng và chất lượng bia không
bị ảnh hưởng.
16
Các vi sinh vật gây hư hỏng bia có thể xâm nhập vào sản phẩm do sự thiếu vệ sinh
trong các công công đoạn từ lên men đến ra sản phẩm cuối cùng. Do đó, bia sau khi
rót chai cần được thanh trùng.
Các phương pháp thanh trùng:
- Thanh trùng nhanh (nâng nhiệt đến 68 – 72
o
C trong 50 giây, sau đó làm lạnh).
- Chiết bia nóng (chai sau khi rữa không cần làm nguội).
- Thanh trùng tunnel (nhiệt độ 60
o
C trong 20 phút).
(Nguyễn Thị Hiền, 2009)
17