Xây dựng quy trình loop mediated isothermal amplification dựa trên gen cpn60 nhằm phát hiện streptococcus suis

ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN



HÀ THANH TUYỀN


XÂY DỰNG QUY TRÌNH LOOP – MEDIATED
ISOTHERMAL AMPLIFICATION DỰA TRÊN GEN
CPN60 NHẰM PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS SUIS


Chuyên ngành: vi sinh
Mã số: 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. NGÔ THỊ HOA




THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012
Lời cảm ơn
Trước tiên, tôi xin bài tỏ sự kính trọng và biết ơn sâu sắc đến TS. Ngô Thị Hoa,
người thầy luôn đầy nhiệt huyết với khoa học, đã định hướng cho tôi, đã truyền cho tôi
ngọn lửa say mê trong nghiên cứu, luôn quan tâm giúp đỡ và dẫn đường cho tôi đi mỗi
khi tôi gặp khó khăn trong suốt thời gian thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn.

Kế đến, tôi xin chân thành cám ơn đến GS. TS. Jeremy Farrar và Trung tâm bệnh
viện Bệnh Nhiệt Đới, Đơn vị Nghiên cứu Lâm Sàng Đại Học Oxford đã tạo điều kiện cho
tôi thực hiện đề tài này.
Tôi xin bày tỏ lòng tri ơn sâu sắc đối với các thầy cô đã truyền đạt những bài học,
kiến thức quý báu và hổ trợ em trong suốt quá trình học tập.
Xin cám ơn Ths. Trần Thị Bích Chiêu và Ths. Sầm Đỗ Dũng cùng tất cả anh chị
em trong nhóm nghiên cứu S. suis và vi sinh đã luôn nhiệt tình chỉ bảo và hướng dẫn em
về kiến thức chuyên môn và kỹ thuật trong phòng thí nghiệm.
Xin được chân thành cám ơn các anh chị, bạn bè đồng nghiệp đã luôn quan tâm,
giúp đỡ và chia sẻ những điều quý giá cùng tôi trong suốt thời gian qua, đặc biệt là thành
viên tập thể nhóm Micro, Enteric và Vibre thân yêu.
Cuối cùng, xin gởi lời cám ơn ba, mẹ và những thành viên trong gia đình tôi,
những người thân luôn ở bên tôi và giúp đỡ tôi trên mọi nẻo đường tôi đi.
Một lần nữa, xin gởi đến tất cả mọi người lời cám ơn chân thành nhất của tôi.
Tháng 9-2012
Hà Thanh Tuyền
Lời mở đầu
Liên cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) là tác nhân gây bệnh hàng đầu trên heo
ở các nước có nền kinh tế chăn nuôi heo phát triển.
Streptococcus suis cư trú ở tuyến hô hấp trên, tuyến sinh dục và tuyến tiêu hóa của
heo. Có 35 serotype S. suis đã được xác định và ghi nhận, trong đó serotype 2 là serotype
phổ biến nhất thường được phân lập từ heo bệnh và người bệnh. Ngoài ra một số trường
hợp gây bệnh ở người do serotype 14, 16 cũng đã được phát hiện và báo cáo.
Các ca bệnh trên người xảy ra rải rác tại nhiều nước trên thế giới tuy nhiên đa số
trường hợp bệnh được ghi nhận ở các nước Châu Á, nhất là Trung Quốc và vùng Đông
Nam Á. Tại Việt Nam, S. suis serotype 2 là tác nhân hàng đầu gây bệnh viêm màng não
mủ ở người lớn. Nhiễm S. suis trên người được xem là bệnh nghề nghiệp đối với các đối
tượng tiếp xúc thường xuyên với heo và thịt heo như người làm công tác thú y, chăn nuôi,
buôn bán, giết mổ và chế biến thịt heo. Vì thế việc tầm soát và xác định tỷ lệ heo mang
trùng S. suis có thể góp phần giúp chúng ta có biện pháp giảm nguy cơ gây bệnh trên heo

và người. Đây là vấn đề cần được quan tâm.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật cho phép phát hiện và phân lập S. suis, trong đó phổ
biến nhất là nuôi cấy vi sinh và PCR. Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy định danh vi
khuẩn bằng kit thương mại dựa trên các đặc tính sinh hóa của vi khuẩn (API 20 Strep,
Biomerieux) và PCR là những phương pháp đòi hỏi chi phí cao nên khó áp dụng tại các
chi cục thú y và các trung tâm y tế địa phương. Trong nghiên cứu này, chúng tôi xây
dựng và phát triển phương pháp Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) với
các ưu điểm: chính xác, hiệu quả, giá thành thấp, kết quả ghi nhận bằng sự chuyển màu,
quan sát bằng mắt thường và dễ thực hiện hơn so với phương pháp PCR truyền thống và
nuôi cấy vi sinh. Phương pháp LAMP hứa hẹn là phương pháp sinh học phân tử có thể
ứng dụng rộng rãi, đặc biệt tại các phòng thí nghiệm với điều kiện cơ sở vật chất hạn chế,
nhằm xác định S. suis không những trong phòng thí nghiệm mà còn trong điều kiện thực
địa.Với các tiền đề như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
“Xây dựng quy trình Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) dựa
vào gen cpn60 nhằm phát hiện Streptococcus suis”.
 Mục đích nghiên cứu
 Mục tiêu đề tài
- Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát hiện Streptococcus suis
- So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP với nuôi cấy vi sinh.
 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tài
Hiện nay, trên thế giới và ở Việt Nam chưa có công trình nghiên cứu ứng dụng
phương pháp LAMP trong việc phát hiện đặc hiệu toàn bộ các serotype của S. suis.
Nghiên cứu của chúng tôi có thể được xem là đề tài nghiên cứu đầu tiên nhằm xây dựng
quy trình LAMP phát hiện S. suis hiệu quả, chính xác, chi phí thấp với độ nhạy và độ đặc
hiệu cao. Những ưu điểm của phương pháp LAMP cho thấy đây là phương pháp có nhiều
tiềm năng ứng dụng rộng rãi nhằm tầm soát nhiễm S. suis trên đàn heo nuôi và cả trong
chẩn đoán bệnh nhiễm ở người.

Trang i

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

MỤC LỤC
Mục lục trang i
Danh mục hình trang iv
Danh mục, bảng, đồ thị trang vi
Bảng các chữ viết tắt trang vii
1. Tổng quan 1
1.1 Đặc điểm chung 1
1.1.1 Hình thái, phân loại và một số đặc điểm sinh học 1
1.1.2 Phân loại các serotype 2
1.1.3 Các serotype thường gây bệnh và ít gây bệnh ở người và heo 3
1.1.4 Nhiễm S. suis ở heo 3
1.1.4.1 Phương thức lây truyền 3
1.1.4.2 Triệu chứng lâm sàng trên heo 4
1.1.5 Nhiễm S. suis ở người 4
1.1.5.1 Đối tượng có nguy cơ lây nhiễm 5
1.1.5.2 Triệu chứng lâm sàng trên người 6
1.2 Tình hình nhiễm S. suis 7
1.2.1 Nhiễm S. suis trên thế giới 7
1.2.2 Nhiễm S. suis ở Việt Nam 8
1.3 Cơ chế phát sinh bệnh 9
1.3.1 Khu trú: quá trình gắn kết và xâm nhiễm bề mặt biểu mô 9
1.3.2 Xâm nhiễm: phát tán và tồn tại trong dòng máu 9
1.3.3 Hoạt hóa đáp ứng viêm và sốc nhiễm trùng huyết 10
1.3.4 Xâm nhiễm hệ thần kinh trung ương (CNS) và gây viêm màng não 11
1.4 Chaperonin 13
1.4.1 Nguồn gốc 13
1.4.2 CPN60 13

Trang ii


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

1.4.2.1 Cấu trúc 13
1.4.2.2 Sự hiện diện gen cpn60 14
1.4.2.3 Chức năng 15
1.4.2.4 Tiềm năng gen cpn60 16
1.5 Phương pháp Loop mediated isothermal amplification (LAMP) 17
1.5.1 Sơ lược về một số phương pháp chẩn đoán tác nhân gây bệnh 17
1.5.2 Lịch sử ra đời và ứng dụng của phương pháp LAMP 18
1.5.3 Nguyên tắc hoạt động LAMP 18
1.5.4 Cơ chế hoạt động 19
1.5.5 Đánh giá kết quả LAMP 21
1.5.5.1 Đánh giá kết quả LAMP bằng điện di 21
1.5.5.2 Quan sát kết quả LAMP bằng mắt thường 22
1.5.6 Ưu điểm phương pháp LAMP 24
2. Vật liệu và phương pháp 25
2.1 Vật liệu 25
2.1.1 Chủng vi khuẩn S. suis 25
2.1.2 Trang thiết bị và hóa chất 25
2.2 Các kỹ thuật trong nghiên cứu 27
2.2.1 Quy trình tách chiết DNA từ chủng thuần 27
2.2.2 Tách chiết DNA vi khuẩn gram dương từ mẫu máu toàn phần dựa theo
quy trình DNeasy Blood and Tissue Kit 30
2.2.3 Phương pháp Miles - Misra cấy trải theo bậc pha loãng và đếm CFU
ước tính mật độ vi khuẩn trong dung dịch 32
2.2.4 Thiết kế mồi và thành phần phản ứng PCR 34
2.2.4.1 Thiết kế mồi dựa trên gen cpn60 của S. suis trong phản PCR 34

2.2.4.2 Hóa chất và dụng cụ dùng trong PCR 35
2.2.4.3 Thành phần phản ứng PCR 35
2.2.5 Thiết kế mồi và thành phần phản ứng trong phương pháp LAMP 37
Trang iii


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
2.2.6 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng 42
2.2.7 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng PCR và LAMP 42
2.2.8 So sánh độ nhạy giữa phương pháp LAMP và phương pháp nuôi cấy 43
3. Kết quả 46
3.1 Xác định độ đặc hiệu của mồi cpn60 bằng phản ứng PCR 46
3.2 Xây dựng quy trình LAMP nhằm phát hiện S. suis 48
3.2.1 Quan sát kết quả LAMP bằng điện di và chất chỉ thị Pico green 48
3.2.2 Khảo sát độ đặc hiệu của Pico Green 49
3.2.3 Tối ưu hóa các thành phần và điều kiện phản ứng 50
3.2.3.1 Nhiệt độ phản ứng 50
3.2.3.2 Nồng độ Betaine 51
3.2.3.3 Nồng độ dNTPs 52
3.2.3.4 Thời gian phản ứng 53
3.2.3.5 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi trong phản ứng LAMP 54
3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy 57
3.3.1 Khảo sát nồng độ kháng sinh ceftriaxone có thể gây chết S.suis CM368
57
3.3.2 Xác định đường cong chết phụ thuộc thời gian (time kill-curve) của
chủng S. suis CM 368 trong môi trường có ceftriazone nồng độ 8xMIC 62
3.3.3 So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP 64
3.4 Thảo luận 65
4. Kết luận – Đề xuất 67
4.1 Kết luận 67

4.2 Đề xuất 67
Tài liệu tham khảo 68
Phụ lục 76



Trang iv


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: S. suis trên môi trường thạch máu và dưới kính hiển vi 1
Hình 1.2: Ban hoại tử trên da, xuất huyết dưới da 7
Hình 1.3: S. suis lẫn tránh hệ miễn dịch bẩm sinh của tế bào vật chủ 10
Hình 1.4: Quá trình xâm nhiễm vào hệ thần kinh trung ương 12
Hình 1.5: Cấu trúc chaperonin 60 và chaperonin 10 14
Hình 1.6: Mô hình tế bào hình thành chaperonin trong tình trạng bị stress 15
Hình 1.7: Vị trí các mồi phản ứng trên trình tự DNA mục tiêu 19
Hình 1.8: Cơ chế hoạt động của các mồi trong phản ứng LAMP 21
Hình 1.9: Sản phẩm khuếch đại của phản ứng LAMP 22
Hình 1.10: Độ đục sản phẩm khuếch đại của phản ứng LAMP 23
Hình 1.11: Quá trình phát hiện sản phẩm khuếch đại sử dụng chất chỉ thị huỳnh
quang kim loại (calcein) 23
Hình 1.12: Pico green đổi màu khi có sự hình thành sản phẩm trong phản ứng
LAMP 24
Hình 2.1: Các bước cơ bản trong phương pháp Miles-Misra nhằm ước mật độ tế
bào vi khuẩn trong dung dịch 33
Hình 2.2: Hình minh họa điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen cpn60 của
S. suis 34

Hình 2.3: Vị trí của các mồi trên trình tự gen cpn60 của S. suis 39
Hình 3.1: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng PCR 46
Hình 3.2: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng PCR 47
Hình 3.3: Sản phẩm LAMP quan sát bằng mắt thường 48
Hình 3.4: Độ đặc hiệu Pico Green 50
Hình 3.5: Ảnh hưởng nhiệt độ 51
Hình 3.6: Ảnh hưởng nồng độ Betaine 52
Trang v


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hình 3.7: Ảnh hưởng nồng độ dNTPs 53
Hình 3.8: Ảnh hưởng thời gian phản ứng 54
Hình 3.9: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP đối với các chủng khác 55
Hình 3.10: Độ đặc hiệu mồi của phản ứng LAMP đối với chủng S. suis 56
Hình 3.11: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
ceftriaxone với nồng độ 2xMIC (0.4 μg/ml) ở 24h 58
Hình 3.12: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
ceftriaxone với nồng độ 4xMIC (0.8 μg/ml) ở 24h 69
Hình 3.13: S. suis CM 368 mọc trên môi trường thạch máu sau khi ủ với
ceftriaxone với nồng độ 8xMIC (1,6 μg/ml) ở 24h 61
Hình 3.14: Ngưỡng phát hiện phương pháp LAMP và sản phẩm được quan sát
bằng điện di 64

Trang vi


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

DANH MỤC BẢNG, ĐỒ THỊ VÀ SƠ ĐỒ

Bảng 2.1: Trình tự mồi trong phản ứng PCR 34
Bảng 2.2: Thành phần hóa chất trong phản ứng PCR 35
Bảng 2.3: Thông số của mồi trong phản ứng LAMP 39
Bảng 2.4: Thành phần hóa chất trong phản ứng LAMP 41
Bảng 3.1: Nồng độ S. suis giảm sau khi ủ với ceftriaxone (2xMIC và 4xMIC) ở
thời điểm 24h 60
Bảng 3.2: Nồng độ S. suis giảm sau khi ủ với ceftriaxone 8xMIC ở thời điểm 24h
62
Bảng 3.3: So sánh ngưỡng phát hiện giữa phương pháp LAMP và nuôi cấy 65
Biểu đồ 1.1: Số ca bệnh do S. suis tại bệnh viện Nhiệt Đới 1998-07/2007 . 8
Đồ thị 3.1: Đường cong chết phụ thuộc thời gian của chủng S. suis CM368 nhạy
ceftriaxone trong môi trường có ceftriaxone nồng độ 8xMIC 64
Sơ đồ 2.1: Quy trình tách chiết DNA từ chủng thuần 28
Sơ đồ 2.2: So sánh độ nhạy giữa phương pháp nuôi cấy và LAMP 44

Trang vii


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADS Arginine deiminase
BA Blood agar
BBB Blood-brain barrier
BLOOD-CSF Blood-cerebrospinal fluid
BIP Backward inner primer
CSF Capsular polysaccharide
CFU Colony forming unit
CPEC Chroid plexus epithelial cell
EF Extracellular protein factor
FIP Forward inner primer
HNB Hydroxyl naphthol blue
LAMP Loop-mediated isothermal amplification
LTA Lipoteichoic acid
MRP Muramidase-released protein
MRSA Methicillin-resistance staphylococcus aureus

MSSA Methicillin-susceptible Staphylococcus aureus
NET Neutrophil-extracellular trap
PCR Polymerase chain reaction
PBS Phosphate buffer saline
SLY Suilysin
S. suis Streptococcus suis
SspA Surface-associated subtilisin like protease
STSS Streptococcal toxic shock syndrome
SOD Superoxide dismutase
THB Todd Hewith Broth
WHO Word Health Organisation







Chương 1
TỔNG QUAN
TÀI LIỆU


Trang 1


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
B
1. Tổng quan
1.1 Đặc điểm chung S. suis

1.1.1 Hình thái, phân loại và một số đặc điểm sinh học
Theo Elliot 1966 và Kilper, Schleifer 1987, Streptococcus suis (S. suis) được
phân loại như sau:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus
Loài: Streptococcus suis
Streptococcus suis (S. suis) là cầu khuẩn Gram dương, kỵ khí tùy nghi,
dạng liên cầu có thể đứng riêng lẽ, thành đôi, hay chuỗi ngắn và được xếp vào
nhóm phân loại Lancefield D. S. suis tạo khuẩn lạc nhỏ, có đường kính 0,5-1,0
μm, hơi xám hoặc trong suốt và bề mặt hơi nhờn. Hầu hết các chủng S. suis có đặc
tính tiêu huyết α (α-hemolysis) trên thạch máu cừu (hình 1.1A) và tiêu huyết β (β-
hemolysis) trên máu ngựa [60].
A






Hình 1.1: (A) S. suis tiêu huyết α trên môi trường thạch máu cừu, (B) dưới kính
hiển vi
Trang 2


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Heo là ký chủ tự nhiên của S. suis, ngoài ra S. suis còn được phát hiện ở

heo rừng, ngựa, chó và mèo. S. suis khu trú ở tuyến hô hấp trên của heo đặc biệt ở
hạch amidan, khoang mũi, cơ quan sinh sản, cơ quan tiêu hóa [55], [62].
S. suis có thể chịu đựng nhiều điều kiện môi trường khác nhau như: có thể
sống sót ở nhiệt độ 60
o
C trong 10 phút, ở 50
o
C trong 2 giờ, ở 10
o
C trong xác súc
vật trong 6 tuần. Hơn nữa, ở điều kiện 0
o
C, chúng có thể tồn tại trong bụi bẩn 1
tháng, trong chất thải 3 tháng. Ngược lại, ở 25
o
C, chúng chỉ có thể sống trong bụi
1 ngày và trong chất thải 8 ngày. Tuy nhiên, S. suis có thể bị tiêu diệt một cách dễ
dàng với dung dịch chất tẩy 5% ở độ pha loãng 800 lần [110].
1.1.2 Phân loại các serotype
Dựa vào thành phần polysaccharide vỏ nang (Capsular polysaccharide –
CPS), S. suis được xác định có tất cả 35 serotype (serotype 1 - 34 và 1/2). Gần
đây, dựa vào trình tự gen 16S rRNA và cpn60, Janet E.Hill và cộng sự đã đề nghị
serotype 32, 34 có mối quan hệ gần với Streptococcus orisratti hơn so với nhóm
33 serotype còn lại nhưng vẫn chưa tách khỏi loài S. suis [39]. Trong các nghiên
cứu dịch tễ học, một số serotype gây bệnh được xác định bằng quy trình PCR với
cặp mồi 16S rRNA [85]. Gần đây, các serotype còn được xác định bằng phương
pháp lai tại chỗ với mẫu dò 16S rRNA chuyên biệt. Ngoài ra, phương pháp miễn
dịch huỳnh quang còn sử dụng để xác định các serotype S. suis ở những mô nhiễm
như lưỡi, hạch amidan [110].
1.1.3 Các serotype thường gây bệnh và ít gây bệnh ở người và heo

Năm 1983 lần đầu tiên phát hiện ra 9 serotype [75], sau đó năm 1991 tìm
thấy đến serotype 28 [28] và cuối cùng đến năm 1995 phát hiện 6 serotype cuối 29
- 34 [37]. Năm 2000, dựa vào trình tự 16S rRNA và gen cpn60 chứng minh
serotype 32, 34 có mối quan hệ gần với Streptococcus orisratti. Trong các
serotype S. suis, serotype 1 - 9 và 14 là những serotype hiện diện phổ biến ở heo
nhiễm bệnh [23], [34]. Trong đó, serotype 2 gây bệnh cho cả người và heo, được
Trang 3


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
phân lập nhiều nhất trên thế giới. Khi phân lập vi khuẩn từ heo bị bệnh ở Châu Âu
kết quả thu được chủ yếu là S. suis serotype 2 chiếm (32%), serotype 9 (20%),
serotype 1 (12%), trong đó S. suis serotype 2 được phân lập phổ biến ở Pháp, Ý,
Tây Ban Nha; serotype 9 chiếm ưu thế ở Đức, Bỉ và Hà Lan; serotype 1 và 14
phân lập chủ yếu ở Anh [34]. Ngoài ra có 2 trường hợp nhiễm S. suis ở người do
serotype 1 và một trường hợp nhiễm trùng máu gây ra bởi serotype 4, còn lại tất cả
các ca nhiễm ở người chủ yếu do serotype 2 gây ra [48].
Năm 1991 lần đầu tiên phát hiện ra serotype 27, trong số 46 chủng S. suis thì
chỉ có 4 chủng được xác định serotype 27 [28]. Một nghiên cứu khác năm 1996
Amass cùng cộng sự phát hiện serotype 27 chỉ chiếm (3.7%) trong số 54 mẫu thực
địa [81]. Bên cạnh đó, năm 1995 trong số 75 chủng S. suis xác định 7 chủng là
serotype 29 [37]. Từ đó đến nay rất ít bài báo công bố phát hiện S. suis serotype 29
ở heo nhiễm bệnh. Tỉ lệ S. suis serotype 27 và 29 trên heo nhiễm bệnh do S. suis
rất thấp.
1.1.4 Nhiễm S. suis ở heo
Nhiễm trùng S. suis được tìm thấy khá phổ biến tại quốc gia có nền công
nghiệp chăn nuôi heo phát triển. Heo có thể mang vi trùng S. suis suốt đời mà
không có triệu chứng, nhưng S. suis có thể gây ra một số bệnh như: viêm màng
não mủ, nhiễm trùng huyết, viêm khớp, viêm phổi, viêm nội tâm mạc trên heo
dẫn đến những tổn thất kinh tế trong ngành chăn nuôi heo trên thế giới mỗi năm.

1.1.4.1 Phương thức lây truyền
Heo con có thể nhiễm bệnh từ heo mẹ qua các con đường: tiếp xúc mũi-mũi
[24] hoặc qua dây rốn, cơ quan sinh sản và tuyến tiêu hóa [87]. Amass và cộng sự
phân lập được S. suis trong hạch amidan của heo con sau khi sinh 24 giờ, tác giả
cho rằng - nguyên nhân nhiễm trên heo con là do tiếp xúc với chất bài tiết của heo
mẹ (nước bọt, dịch mũi họng, phân, dịch âm đạo). Ngoài ra còn có sự lây truyền
bệnh từ heo mẹ sang heo con trong quá trình mang thai [81].
Trang 4


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Một số nghiên cứu trước đây chứng minh rằng tỉ lệ mang trùng ở hạch
amidan heo chiếm 100% [4], [87]. Heo mang trùng không triệu chứng là nguyên
nhân gây lan truyền vi khuẩn giữa bầy/đàn. Một vài yếu tố: phân, bụi, nước và
thức ăn là nguyên nhân khiến heo bị bệnh [87]. Bên cạnh đó, nếu heo được nuôi
trong các điều kiện: chuồng trại vệ sinh kém, chật hẹp, thiếu hệ thống thông gió,
vận chuyển hoặc chia bầy đàn dẫn đến heo bị stress hay suy giảm hệ thống miễn
dịch, do đó làm tăng nguy cơ nhiễm bệnh ở heo [16], [110].
1.1.4.2 Triệu chứng lâm sàng trên heo
Viêm màng não và viêm khớp có thể xảy ra riêng rẽ hoặc kết hợp phổ biến
ở heo 2-6 tuần tuổi. Trên da heo có thể có các mảng đỏ, sần. Các hạch lymphô
sưng tấy, sung huyết, bao khớp dày lên, khớp bị sưng và có dịch. Màng não có thể
bị tổn thương dạng phù nề, sung huyết, dịch não tủy đục. Viêm màng não với phản
ứng toàn thân như sốt 40
o
C – 45
o
C, ủ rủ, biếng ăn và cơ thể suy sụp, có biểu hiện
về thần kinh như run rẩy, đứng không vững, liệt [13].
Trong các đợt dịch viêm màng não do S. suis serotype 2, biểu hiện chết đột

ngột một hay nhiều con có thể là dấu hiệu đầu tiên. Có hiện tượng co giật nhãn
cầu, đạp bơi chèo, rối loạn và chết dưới 4 giờ [106].
Viêm phổi do S. suis thường ở heo 2 - 4 tuần tuổi, song cũng xảy ra ở heo vỗ
béo. Phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc, có mủ. Vi khuẩn
S. suis thường phối hợp với các vi khuẩn gây bệnh khác: Pasteurella multocida,
Acinobacillus pleuropneumoniae hoặc virus [106].
1.1.5 Nhiễm S. suis ở người
S. suis cũng là một tác nhân lây truyền từ động vật sang người (zoonotic
disease), người có thể nhiễm S. suis khi tiếp xúc với heo và thịt heo. Nhiễm khuẩn
ở người gây hậu quả nghiêm trọng, có thể viêm màng não, nhiễm trùng máu, viêm
nội tâm mạc
Trang 5


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
1.1.5.1 Đối tượng có nguy cơ lây nhiễm
Đối tượng có nguy cơ nhiễm S. suis cao là những người có nghề nghiệp
thường xuyên tiếp xúc với heo và sản phẩm từ heo như: người chăn nuôi, công
nhân lò mổ, người vận chuyển thịt heo, nhân viên kiểm tra chất lượng thịt, thú y
[70].
Nguy cơ nhiễm S. suis đối với công nhân lò mổ và người chăn nuôi heo ở
Hà Lan ước tính 3/100.000 trên năm, với tỉ lệ cao hơn 1500 lần so với những đối
tượng không làm việc trong ngành chăn nuôi heo [4]. Đặc biệt đối với công nhân
lò mổ, trong đó những người thường xuyên tiếp xúc với thanh quản và phổi của
heo có nguy cơ nhiễm S. suis nhiều hơn [4]. Ở Anh thống kê tỉ lệ người bán thịt
nhiễm S. suis hằng năm 1,2/100.000 [30]. Ở Đức, nhóm đối tượng có nguy cơ cao
nhiễm S.suis serotype 2 cao gồm: người bán thịt, công nhân lò mổ, nhân viên kiểm
tra thịt chiếm tỉ lệ 5,3%, trong khi đó không phát hiện bất kỳ ca nhiễm S. suis đối
với những người không tiếp xúc với heo và thịt heo [88]. Ở Việt Nam, theo thống
kê trong nghiên cứu gần đây công bố, trong số 50 bệnh nhân nhiễm S. suis chủ yếu

nông dân chiếm (70%), 16 ca do tiếp xúc với heo và thịt heo (32%) và 13 bệnh
nhân có tiền sử nghiện rượu [100]. Một nghiên cứu khác chứng minh đối tượng có
nguy cơ nhiễm S. suis cao (48%) là những người tiêu thụ thực phẩm và món ăn từ
heo không qua chế biến hay chế biến chưa kỹ như tiết canh, lưỡi, lòng heo. Đối
tượng tiếp theo là những người tiếp xúc với heo (46%) và bệnh nhân có vết thương
trên da (33%) [70]. Bên cạnh đó, những trường hợp nhiễm S. suis qua vết thương
cũng đã được mô tả và báo cáo ở một số nước trên thế giới như ở Mỹ (14%) [109],
Hong Kong (16%) [44], Trung Quốc (48%) [109].
Zhu và cộng sự báo cáo một trường hợp nhiễm bệnh từ nước ở lò giết mổ
heo, nguyên nhân do bệnh nhân không đi giày bảo hộ lao động. Ngoài ra, heo rừng
cũng là nguồn lây nhiễm S. suis cho thợ săn [35]. Baums và cộng sự báo cáo ở
Đức tỉ lệ S. suis serotype 2 ở heo rừng (11%) tương đương với heo nuôi (14%) [8].
Trang 6


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Một số nghiên cứu cũng phân lập thành công và phát hiện S. suis ở hạch
amidan của công nhân lò mổ khỏe mạnh [30]. Ngoài ra, tại New Zealand tỉ lệ
huyết thanh dương tính ở người chăn nuôi bò sữa chiếm 9%, người kiểm tra chất
lượng thịt chiếm 10% và 21% đối với nông dân chăn nuôi heo [78]. Bên cạnh đó,
những bệnh nhân cắt lá lách có nguy cơ nhiễm S. suis cao [5], [7] và tỉ lệ tử vong
(khoảng 80%) [25]. Một nghiên cứu khác ở Thái Lan cho thấy 75% bệnh nhân
nhiễm S. suis có tiền sử nghiện rượu [89].
Trong những báo cáo gần đây không loại trừ khả năng S. suis khu trú ở
người khỏe mạnh [30], [86] có thể trở thành tác nhân gây bệnh cơ hội nếu người
bệnh bị stress, suy giảm miễn dịch, hoặc ung thư [30], [59].
Tóm lại, những kết quả trên chứng minh nguy cơ nhiễm S. suis cao chủ yếu
do tiếp xúc trực tiếp với heo bệnh hay thịt heo bệnh và nhiễm qua các vết thương,
vết trầy trên da; ngoài ra tiêu thụ thực phẩm làm từ heo chưa chế biến cũng là một
yếu tố nguy cơ đáng kể.

1.1.5.2 Triệu chứng lâm sàng trên người
Viêm màng não là bệnh phổ biến nhất ở người bị nhiễm S. suis với các biểu
hiện lâm sàng bao gồm: sốt cao, nhức đầu, ớn lạnh, buồn nôn, ói và chóng mặt.
Sau đó các dấu hiệu khác: hôn mê, xuất huyết, đau khớp, tụ máu bầm, phát ban
[63], [90]. Đối với hội chứng sốc độc tố (streptococcal toxic shock syndrome -
STSS) có thể dẫn đến tử vong với biểu hiện (ngoài sốt cao, ớn lạnh, đau đầu, ói,
đau bụng), có thêm dấu hiệu lâm sàng khác như: hạ huyết áp, nhịp tim nhanh,
giảm chức năng gan, suy thận, xuất huyết dưới da và hội chứng rối loạn hô hấp
[64], [99]. Điếc tai là di chứng khi bệnh nhân bị viêm màng não do nhiễm S. Suis
đã phục hồi. Thời gian ủ bệnh do nhiễm S. suis từ vài giờ đến 2 ngày [54].




Trang 7


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC








(Zhao-Rong Lun và cộng sự, 2007)
Hình 1.2: (A): Ban hoại tử trên da, (B): xuất huyết dưới da
1.2 Tình hình nhiễm S. suis
1.2.1 Nhiễm S. suis trên thế giới

Năm 1968, Perch và cộng sự báo cáo trường hợp viêm màng não đầu tiên
do S. suis gây ra tại Đan Mạch [74]. Từ đó về sau, các trường hợp nhiễm S. suis ở
người được phát hiện ở các nước Châu Âu [99] và Châu Á chẳng hạn như: Thái
Lan [79], [93], Hong Kong [41], Trung Quốc [107] và Việt Nam [58]. Ở Bắc Mỹ,
thỉnh thoảng cũng xuất hiện trường hợp nhiễm S. suis [61]. Năm 2005, Hy lạp
thông báo xuất hiện trường hợp nhiễm trùng máu và viêm màng não đầu tiên do S.
suis [64]. Năm 2006 Mỹ mới báo cáo có ca nhiễm S. suis ở người [103].
Tại Hồng Kông, ca viêm màng não ở người do nhiễm S. suis được báo cáo
đầu tiên năm 1983 [14] và đến năm 2008 có hơn 60 trường hợp nhiễm S. suis [42],
[44], và 3 trường hợp ở Đài Loan [40], [108].
Năm 1998 và 2005 ở Trung Quốc bùng phát hai trận dịch bệnh do S. suis
gây ra và điều này làm tăng mối quan ngại về sức khỏe cộng đồng trên thế giới
[92], [109]. Trong năm 1998, dịch bệnh xảy ra ở tỉnh Giang Tô, Trung Quốc,
trong 25 người nhiễm có 14 người tử vong do sốc độc tố và viêm màng não (tỷ lệ
tử vong 56%) và khoảng 80.000 con heo bị nhiễm [92]. Năm 2005, ở tỉnh Tứ
A
B
Trang 8


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Xuyên ghi nhận trong số 215 người nhiễm có 38 người tử vong (18,6%) và hơn
600 con heo bị nhiễm [109].
Năm 2007, toàn thế giới có 409 ca bệnh, trong đó có 73 trường hợp tử vong
(17,8%). Trung Quốc có 283 ca với 54 ca tử vong (19,1%); Thái Lan có tổng số 47
ca với 12 ca tử vong (26%); Hà Lan có 34 ca chỉ với 1 ca tử vong (3%); Anh, Đức,
Tây Ban Nha có khoảng 6 ca. Một số trường hợp riêng lẽ còn được báo cáo ở
Pháp, Crotia, Đan Mạch, Bỉ, Nhật Bản, Mỹ, Bồ Đào Nha [110]. Đến năm 2009,
tổng số ca nhiễm S. suis ở người trên thế giới ghi nhận hơn 550 trường hợp [82].
1.2.2 Nhiễm S. suis ở Việt Nam

Tại Việt Nam, theo báo cáo tổng kết của Bệnh viện Bệnh nhiệt đới, trong
10 năm gần đây, số trường hợp nhiễm liên cầu khuẩn heo ngày càng gia tăng. Giai
đoạn từ năm 1996 đến 1998, mỗi năm chỉ ghi nhận được khoảng 3 bệnh nhân. Từ
năm 1999 đến năm 2003, trung bình mỗi năm là 13 trường hợp. Trong năm 2004,
ghi nhận được 19 trường hợp. Tính đến tháng 7 / 2007, tổng số cộng dồn các bệnh
nhân nhiễm Streptococcus suis khoảng 230 trường hợp . Theo số liệu nghiên cứu
của Nguyễn Thị Hoàng Mai và cộng sự, từ năm 1996 đến 2005, Streptococcus suis
là tác nhân hàng đầu gây viêm màng não mủ ở bệnh nhân điều trị tại Bệnh viện
Nhiệt Đới chiếm tỉ lệ 38,6%, kế đó mới là phế cầu (Streptococcus pneumoniae) –
18,4% [58]. Tháng 1/2007 – 09/2008 có 68 trường hợp tại Bệnh viện Nhiệt đới
trung ương.







Biểu đồ 1.1: Số ca bệnh do S. suis tại bệnh viện Nhiệt Đới 1998-07/2007
Trang 9


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
1.3 Cơ chế phát sinh bệnh
1.3.1 Khu trú: quá trình gắn kết và xâm nhiễm bề mặt biểu mô
S. suis có thể tồn tại trong hạch amidan của heo trong một thời gian dài, tuy
nhiên ở nồng độ rất thấp và không biểu hiện triệu chứng lâm sàng [15], [97]. Giả
thuyết được chấp nhận nhất hiện nay S. suis có khả năng gây bệnh do xuyên thủng
niêm mạc biểu mô của tuyến hô hấp ở heo [29]. Tương tự, S. suis có thể gắn kết
với tế bào biểu mô tuyến hô hấp ở người [10], [71]. Tuy nhiên quá trình S. suis

gắn kết bề mặt tế bào bị cản trở bởi vỏ nang polysaccharide (CPS), một nghiên
cứu chứng minh những chủng bị đột biến mất vỏ nang có khả năng gắn kết với tế
bào tốt hơn so với chủng hoang dại. Vì thế, giả thuyết cho rằng trong suốt giai
đoạn đầu của quá trình gắn kết và xâm nhiễm S. suis giảm điều hòa biểu hiện CPS
nhằm giúp cho việc gắn kết giữa vi khuẩn và vật chủ trở nên tốt hơn [22].
1.3.2 Xâm nhiễm: phát tán và tồn tại trong dòng máu
Sự gắn kết hay xuyên thủng tế bào biểu mô là giai đoạn đầu của quá trình
phát triển bệnh. Sau khi gắn kết và xâm nhiễm vào tế bào biểu mô, S. suis tấn công
vào hệ tuần hoàn thông qua hạch amidan [56], [104]. Vi khuẩn nhiễm vào các mô
hay dòng máu sẽ kích thích tế bào thực bào của hệ miễn dịch bẩm sinh hoạt động.
Tuy nhiên, nếu không có kháng thể đặc hiệu, S. suis có thể chống lại sự thực bào
và tồn tại trong máu với hàm lượng cao đồng thời gây ra đáp ứng viêm. Vỏ nang
CPS bảo vệ S. suis thoát khỏi sự thực bào của bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn
nhân hay đại thực bào. Cấu trúc CPS của S. suis gồm: galactose, glucose, N-acetyl
glucosamin, rhamnose và sialic acid. Trong đó sialic acid giữ vai trò giúp cho S.
suis gắn kết và ẩn nấp bên trong bạch cầu đơn nhân (monocyte), đây được cho giả
thuyết “ con ngựa thành Troa” giúp vi khuẩn có thể lưu hành trong dòng máu [62]
(hình 1.3).
Quá trình S. suis tăng trưởng và tồn tại in vivo phụ thuộc vào một số yếu tố
có vai trò điều hòa trao đổi chất. Lipoprotein TroA giúp vi khuẩn tăng trưởng
Trang 10


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
trong môi trường mangan thấp [102]. Thêm vào đó, hệ thống arginine deiminase
giúp vi khuẩn tồn tại trong môi trường axit bằng quá trình phân giải arginine thành
ornithine, ammonia và carbon dioxide [31], [105].

(Nahuel Fittipaldi và cộng sự 2012)
Hình 1.3: S. suis lẫn tránh hệ miễn dịch bẩm sinh của tế bào vật chủ : S. suis

có cấu tạo vỏ nang (CPS) và đây là thành phần giúp cho S. suis thoát khỏi sự thực
bào của vật chủ. Quá trình lẫn tránh do S. suis ẩn nấp bên trong bạch cầu nhờ
vào Acid sialic. N-deacetylation của peptidoglycan làm giảm khả năng giết của
bạch cầu trung tính, và tăng tính kháng chống lại hoạt động của lysozyme. D-
anaylation của LTA có vai trò ngăn cản sự giết của bạch cầu trung tính. SspA có
khả năng làm biến tính IL8. Hệ thống arginine deiminase giúp S. suis tồn tại trong
môi trường nội bào.
LTA: Lipoteichoic acid; NET: Neutrophil-extracellular trap; SOD: Superoxide
dismutase.
1.3.3 Hoạt hóa đáp ứng viêm và sốc nhiễm trùng huyết
S. suis seroptype 2 kích thích sản xuất cytokine tiền viêm khi gây nhiễm ở
tế bào chuột, heo và người [83], [84]. Nồng độ các cytokine TNF-α, IL-6. IL-12,
và IFN-γ khá cao ở điều kiện in vivo trong vòng 24h sau khi nhiễm kết quả dẫn
đến chết đột ngột ở mô hình động vật thí nghiệm.
Trang 11


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Các lipoprotein hiện diện trên thành tế bào của S. suis hoạt hóa hệ thống
miễn dịch bẩm sinh [101]. Tuy nhiên, còn có một số yếu tố khác góp phần vào quá
trình viêm nhiễm chẳng hạn như: CPS kích thích việc sản xuất MCP-1 [51],
Suilysin ly giải hemoglobin của hồng cầu và góp phần hoạt hóa quá trình ly giải
cytokine tiền viêm [91]. Gần đây, SspA (surface-associated subtilisin like
protease) đã được chứng minh có khả năng kích ứng việc tiết cytokine tiền viêm
và chemokines [11].
1.3.4 Xâm nhiễm hệ thần kinh trung ương (CNS) và gây viêm màng não
S. suis là tác nhân gây bệnh viêm màng não thông qua hai con đường chính
là xuyên qua hàng rào máu – não (bood-brain barrier - BBB ) hoặc hàng rào máu -
dịch não tủy (blood-cerebrospinal fluid) (Blood-CSF).
S. suis thâm nhập và đi xuyên qua BBB nhờ vào một số yếu tố gắn kết và

xâm nhiễm như các protein cấu tạo thành tế bào (cell wall) như LTA D-
alanylation, SrtA và protein neo màng LPXTG [9], [23]. Con đường thứ hai S. suis
xuyên qua các tế bào biểu mô đám rối màng mạch (chroid plexus epithelial cell -
CPEC) thuộc hàng rào máu– dịch não tủy (blood-CSF). Quá trình xâm lấn vào
CPEC của vi khuẩn nhờ vào vỏ nang polysaccharide và các protein thành tế bào,
protein bề mặt [95]. Suilysin giữ vai trò quan trọng tác động hàng rào máu - dịch
não tủy (blood-CSF) [94]. Ngoài ra, một số chủng S. suis xuyên thủng hàng rào
máu - dịch não tủy bằng cách phá vỡ mối liên kết giữa các vách ngăn của CPEC
[94] (hình 1.4).

Trang 12


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

(Nahuel Fittipaldi và cộng sự , 2012)
Hình 1.4 : Quá trình xâm nhiễm vào hệ thần kinh trung ương : Hai con đường
chính gây bệnh viêm nàng não (CNS) bằng cách xuyên qua hàng rào máu - não
(BBB) và dịch não tủy – máu (blood – CSF). BBB có cấu tạo chủ yếu bởi các tế
bào nội mô vi mạch (BMEC). S. suis xuyên thủng BMEC nhờ các protein gắn kết,
xâm nhiễm và thành phần thành tế bào acid lipoteichoic. Sự tương tác giữa các
protein ngoại bào với vật chủ (fibronectin/fibrinogen) cũng rất quan trọng.
LPXTG, protein neo thành tế bào, enolase giữ vai trò gắn kết và xâm nhiễm.
Những chủng có gen sly có khả năng xuyên thủng BBB. Sự xâm nhiễm và xuyên
qua hàng rào dịch não tủy – máu bằng cách gắn kết và xuyên thủng với tế bào
biểu mô đám rối màng mạch (CPEC).
BMEC : tế bào nội mô vi mạch ; CPEC : tế bào đám rối màng mạch ; CSF : dịch
não tủy.

Trang 13


LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
1.4 Chaperonin
1.4.1 Nguồn gốc
Cuối thế kỷ 20, một số nghiên cứu đã phát hiện sự thay đổi biểu hiện của một
vài protein trong điều kiện sốc nhiệt (heat-shock) hoặc stress và những protein này
có liên quan đến sự tồn tại của tế bào. Những protein được tổng hợp trong tình
trạng stress chẳng hạn như: nhiệt hay lạnh, độc tố, kim loại nặng… gọi là protein
sốc nhiệt (heat-shock protein) (hsps) hay chaperone [76].
Chaperone chia làm 2 nhóm: nhóm I và nhóm II [57]. Nhóm I gồm
chaperonin 60 (CPN60) và chaperonin 10 (GroES). Ngoài ra, CPN60 còn được
biết dưới tên khác “GroEL”, “Hsp60”. Hemmingsen và cộng sự tiến hành so sánh
trình tự phân tử chaperonin với gen groEL (protein cần thiết cho sự sống sót ở bất
kỳ điều kiện) của E.coli phát hiện thấy rằng protein GroEL thuộc họ protein
chaperonin nhóm I [36]. Nhóm II gồm TriC (TCP-1 ring complex), họ protein này
phát hiện ở vi khuẩn nhân thật (eukaryote) và vi khuẩn cổ (archaebacteria) [33] .
1.4.2 CPN60
1.4.2.1 Cấu trúc
Cấu trúc gồm 2 vòng bao gồm 14 tiểu đơn vị (hình 1.5) [77] liên kết lại tạo
thành lỗ hổng ở trung tâm (central cavity). Mỗi tiểu đơn vị gồm có 3 domain :
domain đỉnh (apical domain), domain xích đạo (equatorial domain) và domain
trung gian (intermediated domain).
- Apical domain : liên kết với các protein hay GroES.
- Equatorial domain : là vị trí gắn kết với ATP và các đơn vị khác qua cấu
trúc vòng (ring).
- Intermediate domain : là điểm nối (hinge) giữa 2 domain trên và thay đổi

hình dạng từ trạng thái kỵ nước sang háo nước khi có sự liên kết của ATP
[77].