KĨ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

1

CHƯƠNG 8
KĨ THUẬT BẢO QUẢN TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

ThS. Đặng Thị Tùng Loan
PTN Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc
Đại học KHTN, Đại học Quốc gia Tp.HCM

I. GIỚI THIỆU
1. Khái niệm
Bảo quản đông lạnh là kĩ thuật trữ tế bào và mô sống ở điều kiện nhiệt độ thấp trong
một thời gian rất dài. Ở nhiệt độ của nitơ lỏng (-196
0
C), hầu hết mọi phản ứng hoá học đều
không xảy ra, tất cả hoạt động bên trong tế bào đều ngừng lại. Các phân tử nước lúc này tồn
tại dưới dạng kết hợp, tinh thể hoặc dạng kính. Thời gian bây giờ không mang đến bất cứ sự
tổn hại nào cho tế bào được trữ. Theo cách này thì tế bào và mô có thể hồi phục sự phát triển
bất cứ khi nào con người cần sử dụng.
Yếu tố duy nhất có thể ảnh hưởng tới tế bào là bức xạ từ môi trường. Tuy nhiên, trên
thực tế yếu tố này không quan trọng. Một số nghiên cứu cho thấy tế bào phôi chuột trữ lạnh
sau khi chiếu một lượng tia xạ tương đương với thời gian trữ là 2000 năm vẫn có thể phát
triển bình thường sau khi giải đông, chuột con sinh ra không có dị tật bẩm sinh nào.
2. Mục đích
(1) Giảm thiểu sự biến đổi kiểu gen, biểu hiện gen, đảm bảo ổn định di truyền.
(2) Ngăn ngừa sự lão hoá tế bào.
(3) Ngăn cản quá trình biệt hoá tế bào.
(4) Giảm rủi ro nhiễm vi khuẩn và sự chết tế bào.
(5) Giảm sự nhiễm chéo giữa các dòng tế bào khác nhau trong in vitro.
(6) Giảm rủi ro biến đổi cấu trúc và sự thay đổi hình thái.
(7) Giảm chi phí nuôi cấy.

(8) Thuận lợi cho việc phân loại, tạo dòng.
(9) Thuận lợi cho việc bảo tồn gen.
(10) Thuận lợi cho vận chuyển.
(11) Thuận lợi cho việc thương mại hoá.
(12) Giảm thiểu các thao tác, nuôi cấy không cần thiết nhiều dòng tế bào cùng một lúc,
cùng một nơi, tiết kiệm thời gian và công sức.
II. SINH HỌC ĐÔNG LẠNH
1. Cơ sở khoa học của bảo quản đông lạnh
1.1. Các biến đổi của tế bào trong bảo quản bằng phương pháp đông lạnh
1.1.1. Sự hình thành tinh thể nước đá
Khi nhiệt độ hạ thấp, sự xuất hiện những tinh thể nước đá đầu tiên là dấu hiệu bắt đầu
của sự biến đổi giai đoạn. Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ bên trong tế bào bằng với độ
hạ băng điểm của dung dịch mà băng điểm của dung dịch này lại phụ thuộc vào nồng độ của
chất hòa tan. Tuy nhiên, nồng độ bên trong tế bào đậm đặc hơn bên ngoài tế bào nên sự biến
đổi giai đoạn ở bên trong tế bào được xảy ra ở một nhiệt độ thấp hơn ở bên ngoài tế bào.
Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước đá được tạo thành trước tiên ở môi trường
ngoài tế bào, vì vậy nồng độ chất hòa tan tăng và áp suất thẩm thấu tăng làm cho nước chuyển
động ra ngoài tế bào và dung tích tế bào giảm. Tốc độ mất nước của tế bào lại phụ thuộc vào
tốc độ đông lạnh. Ở trên tốc độ giới hạn (tốc độ thích hợp tối ưu) khả năng tạo băng đá nội
bào tăng; những tinh thể nước đá tăng kích thước và do đó, sự tổn hại tế bào cũng nhiều hơn.
Ngược lại, ở dưới tốc độ giới hạn, sự sống của tế bào giảm do nồng độ của chất hoà tan nội
bào tăng lên. Người ta nhận thấy trong môi trường huyền phù, nước biến đổi chậm hơn và sự
mất nước nội bào được duy trì sao cho có sự cân bằng thẩm thấu với môi trường bên ngoài, do
2

đó sẽ gây tổn hại tế bào ít hơn. Sự có mặt của băng đá nội bào và “hiệu ứng của dung dịch” là
hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh, quyết định khả năng sống của tế bào.
Sự hoạt động phối hợp của 4 yếu tố sau đây quyết định hình dạng tinh thể nước đá được
tạo thành trong quá trình đông lạnh:
 Nhiệt độ ở thời điểm biến đổi giai đoạn

 Tốc độ làm lạnh
 Thành phần các chất hoà tan trong dung dịch
 Nồng độ dung dịch
Hình 1. Sự hình thành tinh thể đá
Ở môi trường đẳng trương (áp suất thẩm thấu khoảng 300mOsm/kg), tinh thể đá
thường hình thành ở nhiệt độ -5 đến -15
o
C. Tuy nhiên, đá chỉ tạo thành tự nhiên ở nhiệt độ -
10
o
C. Ở nhiệt độ -5 đến -10
o
C cần có điều kiện kết hợp. Đó là sự tham gia của một phần nhỏ
chất rắn (ví dụ như hạt bụi hoặc tinh thể đá nhân tạo). Sự tạo đá càng tăng khi nhiệt độ càng
giảm. Ở nhiệt độ khoảng -130
o
C, tất cả chất liệu không còn ở dạng lỏng mà đều ở dạng hạt
kết tinh hay dạng thủy tinh. Đây là hiện tượng kết tinh hóa hay còn được gọi là thủy tinh hóa.
Hiện tượng này xảy ra do môi trường có pha chất hoà tan cũng như chất bảo quản đông lạnh
có nhiệt độ đông đá thấp hơn bình thường. Những tinh thể nước hình thành bên trong cũng
như sát bên ngoài tế bào có khả năng gây tổn thương cơ học lên màng tế bào và các bào quan.





3


A B

Hình 2. Sự biến đổi vật lý của tế bào khi đông lạnh
A. Không có chất bảo quản lạnh, B. Có chất bảo quản lạnh

Sự tăng thêm nồng độ của các chất hoà tan trong môi trường đông lạnh ảnh hưởng đến
việc hình thành những tinh thể nước đá. Khi nước chuyển sang dạng tinh thể, lượng nước ở
thể lỏng giảm đi. Do đó, nồng độ các chất hoà tan tăng lên gây mất cân bằng về áp suất thẩm
thấu, kéo nước bên trong tế bào ra ngoài và làm tổn thương màng tế bào.
Việc tăng nhiệt độ tiềm năng cũng là hậu quả của sự hình thành tinh thể nước đá. Phân
tử nước khi chuyển từ thể lỏng sang thể rắn sẽ thoát ra một nhiệt lượng. Nếu nhiều phân tử
cùng chuyển sang thể rắn thì lượng nhiệt thoát ra đủ lớn để làm thay đổi nhiệt độ của môi
trường đang từ vài độ âm lên lại 0
o
C. Thay đổi này ảnh hưởng đến chức năng của tế bào sau
khi giải đông.
1.1.2. Độ thẩm thấu của môi trường đông lạnh
Nhiệt độ chính xác để kết tinh và thủy tinh hóa hoàn toàn phụ thuộc vào phức hợp có
trong nước. Trong dung dịch NaCl có cùng một áp suất, hiện tượng thủy tinh hóa xảy ra ở
nhiệt độ -20
o
C đến -30
o
. Nhiệt độ này gọi là điểm Eutecti. Vì vậy, trước khi đạt đến điểm này
NaCl vẫn ở dạng dung dịch. Số lượng phân tử nước có ở dạng dung dịch giảm xuống cùng
với nhiệt độ, kết quả trực tiếp là giảm độ thẩm thấu của môi trường, môi trường trở nên ưu
trương.
Hình 3. Khi nhiệt độ của dung dịch NaCl đẳng trương hạ thấp liên tục đến điểm đông,
hiện tượng kết tinh đá và nồng độ NaCl tăng lên
Làm lạnh ở nhiệt độ xấp xỉ 0
o
C làm giảm sự khuếch tán một chiều của protein màng.

Ở những nhiệt độ thấp hơn, màng tế bào hướng về nồng độ muối cao, nhất là trong quá trình
đông lạnh chậm. Màng tế bào bị sốc thẩm thấu cùng với sự co thể tích trong quá trình mất
nước. Sau đó, màng tế bào giãn ra, nồng độ các ion tăng lên, vì vậy, tế bào trở nên rất nhạy
cảm với các stress trong quá trình đông lạnh khi nhiệt độ giảm (choc thermique) hoặc khi pha
loãng môi trường (choc de la dilution) trong quá trình giải đông.
1.1.3. Tốc độ khử nước
4

Tốc độ mất nước của tế bào phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Các yếu tố này thay đổi khác
nhau tùy theo từng loại tế bào và vì vậy đóng vai trò quyết định trong việc xác định quá trình
bảo quản đông lạnh ở điều kiện tốt nhất. Các yếu tố liên quan là tính thấm nước của màng tế
bào (Lp), năng lượng hoạt hóa của tính thấm nước này (dH*) và tỉ lệ diện tích bề mặt/thể tích
của tế bào (SA/V).
Bằng cách đo tỉ lệ thay đổi về diện tích bề mặt tế bào và thể tích tế bào ở các độ thẩm
thấu khác nhau, có thể xác định được tính thấm của màng tế bào (Lp). Diện tích bề mặt càng
lớn, tỉ lệ SA/V càng cao thì tính thấm của màng tế bào (Lp) càng lớn. Đối với hầu hết các tế
bào của đông vật có vú, tính thấm của màng tế bào (Lp) có giá trị khoảng 0.43
m
3
/m
2
.phút.atmosphere. Tuy nhiên, đối với hồng cầu và tinh trùng thì tính thấm của màng tế
bào (Lp) lớn hơn nhiều. Điều này có nghĩa là hồng cầu và tinh trùng mất nước nhanh hơn
trong dung dịch ưu trương; do đó, tốc độ bảo quản đông lạnh tốt nhất đối với loại tế bào này
là rất quan trọng.
Yếu tố quan trọng thứ hai trong quá trình khử nước là năng lượng hoạt hóa cho tính
thấm nước (dH*). Năng lượng (ở dạng nhiệt) làm cho tế bào có khả năng thấm nước. Trước
đây, bằng cách đo tính thấm của màng tế bào (Lp) ở các nhiệt độ khác nhau để xác định dH*
đối với trứng. Về thực hành, đây là khoảng nhiệt độ trên điểm đông lạnh. Kết quả đo được là
14.5 Kcal/mol. Giá trị này tương đối cao và nói chung, nhiệt độ cứ hạ 10

o
C thì tốc độ khử
nước sẽ giảm một nửa.
Cuối cùng, tỉ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích cũng góp phần quan trọng đối với tốc
độ khử nước của tế bào. Nếu tỉ lệ này cao thì tế bào sẽ khử nước nhanh hơn.
Hình 4. Tốc độ mất nước của tế bào trong môi trường ưu trương phụ thuộc vào nhiệt độ

1.1.4. Sự giảm thể tích thực của tế bào
Sự thay đổi thể tích tế bào có thể đo được để biểu thị quá trình khử nước. Quá trình
khử nước phụ thuộc vào tính thấm nước màng tế bào (Lp) và năng lượng hoạt hóa tính thấm
nước (dH*) của tế bào. Các giá trị này phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh. Dựa trên cơ sở tính
toán, phạm vi thể tích giảm có thể xác định được ở các tốc độ làm lạnh khác nhau. Vì vậy, ở
tốc độ làm lạnh cao, tế bào không bị mất nước nhiều, và thể tích tế bào không giảm nhiều như
5

ở tốc độ làm lạnh thấp. Tốc độ làm lạnh thấp sẽ làm cho tế bào mất nước. Tuy nhiên, thể tích
giảm thực sự ít hơn so với tính toán, điều này có thể là do sai lầm trong phép ngoại suy đối
với năng lượng hoạt hóa tính thấm nước (dH*) (được xác định ở nhiệt độ trên điểm đông
lạnh).
Hình 5. % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu ở các nhiệt độ khác nhau.
Các đường cong tương ứng với tốc độ làm lạnh khác nhau

Hình 6. % khối lượng tế bào giảm so với khối lượng ban đầu được tính (đường liền)
và được ghi lại bằng thực nghiệm (dường đứt).
1.1.5. Sự giảm tốc độ hoạt động của Enzyme
Nghiên cứu cho thấy khi nhiệt độ giảm từ 37
o
C xuống còn 7
o
C, hoạt động của enzyme

giảm 8 lần. Tốc độ phản ứng enzyme phụ thuộc vào năng lượng hoạt hóa của các phân tử
phản ứng. Từ 20
o
C, tốc độ phản ứng enzyme giảm theo nhiệt độ một cách ổn định theo trình
tự 2-3 lần với mỗi khoảng giảm 10
o
C (Q
10
). Tuy nhiên, trong một số trường hợp, khi hạ nhiệt
độ thì sự thay đổi tốc độ phản ứng enzyme (ở nhiệt độ tương ứng) không còn rõ rệt, dẫn đến
sự biến đổi cấu trúc và hoạt động của các protein. Các chất bảo quản đông lạnh có thể đề
phòng sự biến đổi này.
1.1.6. Độ pH của dung dịch
Trong quá trình đông lạnh, độ pH của dung dịch tăng theo sự giảm nhiệt độ, sự cân
bằng acid – base của môi trường biến đổi như sau: lực ion tăng lên, sự kết tủa của các hợp
chất như các protein hòa tan trong môi trường trở nên dễ dàng (salting out). Các chất bảo
quản đông lạnh có thể biến đổi cân bằng acid – base của dung dịch, chẳng hạn như glycerol và
các glycol hoạt động như những base yếu, ester hoạt động như base mạnh (DMSO chẳng
hạn). Sự biến đổi độ pH của dung dịch theo nhiệt độ sẽ khác nhau theo loại chất bảo quản
được sử dụng: với nồng độ DMSO hay glycerol tăng thêm 50%, độ pH của dung dịch PBS
tăng nhanh, nhưng lại ổn định hơn với propanediol hay methanol; với nồng độ giảm (10-20%)
độ pH của dung dịch PBS và glycerol ổn định, trong khi đó, pH dung dịch đệm Tris có sự
thay đổi nổi bật. Tuy nhiên, pH thích hợp để duy trì hoạt động sinh lí của tế bào phụ thuộc
vào nhiệt độ. Người ta nhận thấy rằng tế bào có thể sống sau bảo quản ở nhiệt độ xấp xỉ 0
o
C
với pH trên 9.
1.1.7. Sự hình thành bọt khí
Tế bào có thể chết theo nhiều cách khác nhau do sự hình thành đá. Hơn nữa, tinh thể
nước đá tạo ra các lỗ gây rò rỉ và thể tích nước bị đông lạnh tăng lên (tỉ trọng của đá thấp hơn

tỉ trọng của nước). Do đó, bọt khí có thể được hình thành khi giải đông tế bào. Năm 1988,
Ashwood-Smith mô tả sự hình thành bọt khí dưới tác động của sự hình thành đá. Kích thước
của bọt khí thay đổi từ 25 đến 100µm và tỉ lệ nghịch với tốc độ làm lạnh. Số lượng bọt khí
tương ứng với tốc độ làm lạnh.
Bên cạnh các khí hoà tan theo nồng độ, môi trường nuôi cấy tế bào thường dùng CO
2

làm hệ đệm để cân bằng độ pH trong môi trường. Khi làm lạnh, các khí này không còn ở dạng
6

hoà tan nữa mà tách ra thành những bọt khí có khả năng gây hại tế bào. Trong quá trình giải
đông, trong vài phút, bọt khí phát triển thành không bào lớn bên trong tế bào, làm tế bào
phình to. Trong thực tế, bọt khí hình thành rất nhanh, dẫn đến vỡ tế bào.
Sự hình thành khí xảy ra nhiều khi sử dụng môi trường đông lạnh có chứa bicarbonat.
Vì vậy, PBS thường được sử dụng hơn.
1.2. Thuyết hai yếu tố
Căn cứ vào những quan sát thực nghiệm về mối quan hệ giữa sự sống sót của tế bào
với nhiệt độ làm lạnh chúng, Mazur đã đưa ra giả thuyết hai yếu tố về những tổn thương khi
đông lạnh tế bào. Hai yếu tố này đã đặt nền tảng cơ sở cho hai cơ chế khác nhau, và có thể
chúng là các nguyên nhân trực tiếp, gây ra những tổn hại cho tế bào, trong suốt quá trình tiến
hành đông lạnh và lưu giữ.
Bảng 30.1. Khả năng phản ứng của tế bào khi gặp phải các tác nhân gây stress trong tiến
trình đông lạnh
Tác nhân stress
Phản ứng của tế bào
Giảm nhiệt độ
Những biến đổi của lớp màng lipid, khử polymer hoá
bộ xương tế bào
Gia tăng nồng độ các chất hoà tan
Giảm áp suất thẩm thấu

Tăng nồng độ ion
Những phản ứng trực tiếp trên màng bao gồm tính
tan của màng protein
Mất nước
Sự mất ổn định của lớp đôi lipit
Kết tủa muối
Không rõ
Hình thành bọt khí
Tổn thương cơ học
Tính nhớt môi trường tăng
Quá trình khuếch tán, kể cả sự thẩm thấu bị hạn chế
Thay đổi pH
Protein bị biến tính
Tế bào bị chèn xếp khít lại
Sự tổn thương của màng
(1) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh chậm, sự tổn thương xảy ra do những
tác động dung dịch (ví dụ như nồng độ chất tan/chất điện li, sự mất nước của tế bào nhanh đột
ngột, và sự giảm phần không bị đóng đá trong khoảng không ngoại bào).
(2) Với diễn tiến nhiệt độ của quy trình làm lạnh nhanh, sự tổn thương do hình thành
đá nội bào gây chết. Nhiệt độ làm lạnh tối ưu cho sự sống sót của tế bào phải đủ thấp để tránh
sự hình thành đá nội bào, nhưng cũng phải đủ cao để giảm đến mức tối thiểu những tác động
của dung dịch.

Thuyết 2 yếu tố

Hình 7. Ảnh hưởng của tốc độ làm lạnh lên sức sống tế bào

Quy trình đông lạnh-giải
đông tối ưu

Tổn thương
“dung dịch”

Tổn thương
đá nội bào

Tốc độ làm lạnh

Sức sống

7

Hình 7 mô tả nhiệt độ làm lạnh tối ưu, ở đó hai yếu tố gây thiệt hại được giữ một cách
cân bằng, và xác suất sống của tế bào đạt đến một giá trị cực đại. Những giá trị tốt nhất cho tất
cả các quá trình làm lạnh hữu dụng có thể được giải thích trong giới hạn của sự cân bằng giữa
tác động dung dịch và sự hình thành đá nội bào.
Mặc dù, từ những bằng chứng thực nghiệm đều thấy rằng, thuyết hai yếu tố nói trên
như là một lời giải thích hiển nhiên, hợp lí về sự tổn thương của tế bào trong suốt quá trình

làm lạnh, nhưng phương pháp bảo quản bằng đông lạnh tốt nhất sẽ khác nhau tuỳ vào từng
loại tế bào.
Bổ sung thêm cho hai cơ chế tổn thương này, còn có những cơ chế khác đáng quan
tâm, chẳng hạn sự làm lạnh cũng có thể gây nên tổn thương hệ miễn dịch và kích hoạt tế bào
chết theo chương trình (apoptosis), có thể những vấn đề nêu trên cũng là nguyên nhân gây ra
sự tổn thương tế bào.
Tế bào ít khi tiếp xúc trực tiếp với các tinh thể nước đá, và đúng hơn là chúng tập hợp
vào những nơi không có sự đóng băng, đồng thời cũng chính tại các vị trí này, tế bào được cô
lập bởi các tác nhân vật lý, và điều này đã tạo nên các stress cho tế bào. Đó là sự phản ứng tự
nhiên của tế bào đối với các tác nhân này để chúng có thể sống sót và tồn tại.
Tế bào phải chịu tác động của những tác nhân nói trên và luôn luôn thay đổi trong suốt
quá trình đông lạnh. Tuy nhiên, các phản ứng thẩm thấu qua màng sinh chất là yếu tố có tính
quyết định đầu tiên cho sự tồn tại của tế bào. Trong những môi trường ưu trương, tế bào sẽ
gặp phải sự mất tính thấm với nước, giới hạn tổn thương này phụ thuộc vào nhiệt độ đông
lạnh. Sức chịu đựng của tế bào khi đông lạnh tại những thang nhiệt độ chậm sẽ phụ thuộc vào
khả năng của tế bào, nhằm chống lại sự thâm nhập của các tác nhân stress.
Sức chống chịu của tế bào trước áp lực của sự tăng khuếch tán nước, khi nhiệt độ làm
lạnh tăng và những thành phần của tế bào có thể chậm đông hơn, trước khi tất cả những phần
nước đóng băng bị loại thải. Dưới những điều kiện này, tế bào co lại và sự tổn thương màng
sẽ giảm đến mức tối thiểu. Những hiện tượng này xảy ra khi tốc độ làm lạnh được cho là tốt
nhất.
2. Chất bảo quản đông lạnh
2.1. Định nghĩa
Là những chất tan được trong nước, có khả năng tạo liên kết hydro với phân tử nước và có
khả năng xâm nhập vào bên trong tế bào.
2.2. Tác dụng
 Thâm nhập và thay chỗ cho nước bên trong tế bào
 Giảm hình thành tinh thể nước đá bên trong tế bào
 Giảm tổn thương gây nên do tinh thể nước đa
 Hạn chế sự gia tăng nồng độ của các chất hoà tan

 Kết lên màng bào tương để bảo vệ cho tế bào
2.3. Đặc tính của chất bảo quản đông lạnh
 Có thể thấm qua màng tế bào một cách bị động
 Có khả năng hoạt động thay thế nước
 Chỉ độc với tế bào ở nồng độ cao
2.4. Phân loại
Trong quá trình đông lạnh, tế bào chỉ có khả năng sống được nếu trong môi trường có
chất bảo quản đông lạnh thích hợp. Hiệu quả của từng chất bảo quản đông lạnh lên từng loại
tế bào rất khác nhau. Các loại chất bảo quản đông lạnh thường được sử dụng trong trữ tế bào:
 Glycerol
 DMSO (Dimethyl sulfoxide)
 1,2-propanodiol (propylene glycol)
 1,2-ethalnediol (ethylene glycol)
8

2.5. Nguyên tắc hoạt động của chất bảo quản đông lạnh
Hoạt động của chất bảo quản đông lạnh thể hiện qua 2 hiện tượng “khử nước” trong
quá trình đông lạnh và “bù nước “ trong quá trình giải đông.
2.5.1. Sự khử nước
Theo nguyên tắc, phôi ở môi trường nuôi cấy có sử dụng chất bảo quản đông lạnh phải
trải qua phản ứng thẩm thấu, vì vậy sẽ mất nước. Sau một thời gian (thời gian này nhanh hơn
khi ở nhiệt độ cao so với ở nhiệt độ thấp), tế bào hấp thụ chất bảo quản đông lạnh và trở lại
thể tích ban đầu. Khi tế bào trở lại thể tích bình thường thì quá trình đông lạnh bắt đầu. Do có
sự bổ sung chất bảo quản đông lạnh nên nước trong tế bào có ít hơn và do đó, ít hình thành
tinh thể đá hơn.
Hình 8. Khối lượng tế bào phôi tương ứng trong quá trình
A.Trữ trong nitơ lỏng B. Tan đông
C. Tái thủy hợp D. Trong môi trường nuôi cấy
2.5.2. Sự bù nước
Sau khi tan đông, trong quá trình bù lại nước, phản ứng của phôi hoàn toàn ngược lại.

Quá trình này diễn ra chậm. Nếu có quá ít chất bảo quản đông lạnh trong môi trường bù nước,
tế bào sẽ phồng lên và vỡ do áp suất thẩm thấu trong tế bào cao. Vì vậy, quá trình bù nước
xảy ra từng bước một, tế bào được nuôi trong môi trường có nồng độ chất bảo quản đông lạnh
giảm dần. Mỗi lần như vậy, thể tích của phôi tăng lên do hấp thu nước, rồi trở lại bình thường
do chất bảo quản đông lạnh thoát ra.
2.5.3. Các chất không thấm
Chất không thấm là những đại phân tử tuy không xâm nhập tế bào nhưng cũng được
xem như những chất bảo quản đông lạnh, được dùng kèm với những chất bảo quản đông lạnh
nội bào. Các chất không thấm hoạt động phối hợp với các chất bảo quản đông lạnh, làm giảm
áp suất thẩm thấu bên ngoài tế bào, dẫn đến hiện tượng chất bảo quản đông lạnh thoát ra
nhiều hơn. Do đó, tế bào được bảo vệ tránh khỏi các tổn thương do tế bào bị phình to trong
quá trình bù nước.
Các chất không thấm thường là mono-,di- hoặc tri-saccharide. Sucrose và dextran
được sử dụng phổ biến.
Hình 9. Sự thay đổi khối lượng tế bào trong quá trình đông lạnh có sử dụng kèm sucrose ở
các quá trình
9

A. Trữ trong nitơ lỏng B. Tan đông
C. Tái thủy hợp khi có đường sucrose D. Trong môi trường nuôi cấy
2.6. Nồng độ chất bảo quản đông lạnh
Tất cả chất bảo quản đông lạnh đều là những chất gây độc cho tế bào. Việc sử dụng
chúng phù hợp cho từng loại tế bào, từng giai đoạn của tế bào cũng như sử dụng với một nồng
độ thích hợp là rất quan trọng. Các tính chất của chất bảo quản đông lạnh như: khả năng thấm
được vào trong tế bào, tính độc đối với tế bào, cũng như những ảnh hưởng sinh học trên tế
bào sẽ được xác định trên thực nghiệm để đánh giá, lựa chọn chất bảo quản tốt nhất.
Độ đậm đặc của các chất bảo quản đông lạnh tăng lên khi nhiệt độ giảm. Điều này dẫn
đến độ nhớt của dung dịch tăng, từ đó, chuyển động của nước và sự xáo trộn của các thành
phần trong dung dịch giảm.

III. KĨ THUẬT ĐÔNG LẠNH TẾ BÀO ĐỘNG VẬT
1. Nguyên, vật liệu được dùng trong đông lạnh
1.1. Môi trường đông lạnh
Môi trường đông lạnh và giải đông được lọc vô trùng với phin 0,22 µm và giữ ở nhiệt
độ 4
0
C, được sử dụng ở nhiệt độ phòng trong 48h. Ngoài chất bảo quản đông lạnh, các chất
được bổ sung vào môi trường bảo quản bao gồm:
1.1.1. HEPES
Vì quá trình đông lạnh và làm tan đông được thực hiện ngoài tủ ấm CO
2
nên môi
trường có đệm HEPES thường được sử dụng. Môi trường này có thể là môi trường nuôi cấy.
1.1.2. Huyết thanh
Mặc dù vai trò của huyết thanh trong trữ lạnh tế bào chưa được làm rõ. Một số nghiên
cứu chứng tỏ rằng khi sử dụng môi trường có bổ sung huyết thanh, sau giải đông, khả năng
sống của tế bào tăng; đối với tế bào phôi, ngoài sức sống tế bào tăng, tỉ lệ có thai cũng như tỉ
lệ thai làm tổ sau khi chuyển phôi cũng gia tăng. Tuy nhiên, việc dùng huyết thanh trong trữ
lạnh làm gia tăng nguy cơ các bệnh truyền nhiễm cũng như phải chấp nhận tính không ổn
định của huyết thanh với rất nhiều thành phần không thể xác định được.
1.1.3. Kháng sinh
Việc sử dụng kháng sinh nhằm mục đích hạn chế sự nhiễm khuẩn trong quá trình đông
lạnh và giải đông.
1.1.4. Muối: đóng vai trò đệm sinh lí
1.1.5. Đường
Đường là nguồn cung cấp năng lượng chính và cũng được xem như một tác nhân bảo
quản đông lạnh do có tương tác trực tiếp với màng tế bào. Đường sẽ ngăn cản sự khử nước
quá mức của màng và làm giảm sự chuyển phase của phospholipid khi hạ nhiệt độ. Sucrose là

một trong những loại đường được sử dụng với mục đích này.
1.1.6. Một số chất khác: như Natri pyruvat, polyethylenglycol (PEG 8000), …
1.2. Ni-tơ lỏng
Ni-tơ lỏng là ni-tơ dạng khí được cô đặc lại. Chúng không màu, không mùi, không dễ
cháy, không độc. Ni-tơ lỏng rất lạnh, có nhiệt độ là -196
0
C, nhiệt độ sôi khoảng -210
0
C. Do
đó, khi thao tác với ni-tơ lỏng phải mang găng tay và mắt kính bảo vệ.
1.3. Thiết bị trữ lạnh bằng ni-tơ lỏng
Thiết bị này là những bình chứa ni-tơ lỏng được thiết kế đặc biệt
 Bình này được gắn nhôm, cô lập hoàn toàn với bên ngoài
 Cổ bình thường được làm bằng nhựa tổng hợp
 Bình chịu nhiệt và rất rắn chắc.
10

Bình trữ ni-tơ lỏng có nhiều loại và thường xuyên được cải tiến nhằm phục vụ cho
việc bảo quản đông lạnh một cách hiệu quả và tiện lợi hơn.


Hình 10. Sự phân bố nhiệt độ trong bình trữ ni-tơ lỏng
Các thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng cho phép trữ lạnh ở pha khí ở trên có nhiệt độ từ -
140
o
C đến -180
o
C và pha lỏng ở dưới có nhiệt độ dưới -196
o
C. Việc trữ ở pha khí làm giảm

đáng kể nguy cơ rò rỉ hay nổ của các ống/tube chứa mẫu trong lúc lấy ra để giải đông. Tuy
nhiên, vì một lượng lớn ni-tơ lỏng bị giảm để cung cấp không gian cho việc trữ ở pha khí nên
thời gian giữ lạnh (duy trì nhiệt độ trữ mà không cần bổ sung ni-tơ lỏng) giảm xuống. Điều
này làm giảm giới hạn an toàn và đòi hỏi phải kiểm soát và bổ sung thường xuyên. Nhiệt độ
trong bình chứa ni-tơ lỏng có sự khác biệt giữa các vùng, phân bố như hình 10.
Những bình trữ ni-tơ lỏng có khả năng duy trì nhiệt độ dưới -130
o
C phù hợp với việc
trữ lạnh trong thời gian dài. Mặc dù hầu hết các thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng và một số thiết bị
lạnh cơ học đạt được yêu cầu này, thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng vẫn được các phòng thí nghiệm
nuôi cấy tế bào chuộng hơn. Quyết định chọn cuối cùng thường dựa trên việc cung cấp ni-tơ
lỏng ổn định, nhu cầu về khả năng trữ, và ngân sách.
Điều quan trọng khi sử dụng thiết bị trữ lạnh ni-tơ lỏng là việc kiểm tra định kì mức
chất lỏng trong bình chứa. Hơi khí ni-tơ phụ thuộc vào cả mức độ sử dụng và thời gian giữ
tĩnh (yên lặng) của bình chứa. Sự gia tăng đột ngột tỉ lệ khí có thể gây ra nhiều vấn đề cho
bình trữ. Sự hình thành đá hay tuyết bên ngoài cổ bình có thể làm gia tăng tỉ lệ khí ni-tơ và
làm tăng nhiệt độ của phần trên của pha khí trong bình.


11

Hình 11. Một số thiết bị trữ lạnh bằng ni-tơ lỏng
1.4. Dụng cụ bảo quản
Sau khi bổ sung chất bảo quản đông lạnh và trộn đều vào huyền phù tế bào, hỗn hợp
dung dịch này được cho vào các ống nhỏ (thường có dung tích 1 – 2 ml). Những dụng cụ này
được thiết kế và sản xuất bằng những chất liệu đặc biệt nhằm có thể chịu được nhiệt độ quá
thấp trong bình ni-tơ (không bị giòn, dễ vỡ và không bị bật nắp). Hai đặc tính quan trọng của
loại dụng cụ được chọn là vật liệu tạo ra và thiết kế của dụng cụ đó, đặc biệt là phần nắp. Nắp
của ống đông lạnh được thiết kế nhằm đảm bảo sự nguyên vẹn trong quá trình bảo quản trong
ni-tơ lỏng. Nếu sự rò rỉ xảy ra, ni-tơ lỏng sẽ đi vào bên trong ống. Sau đó, trong quá trình giải

đông, khi trở lại nhiệt độ phòng, ni-tơ từ dạng lỏng nhanh chóng chuyển sang dạng khí. Quá
trình này nhanh chóng tạo ra một áp suất đáng kể, ống đông lạnh có thể bị vỡ bung nắp để giải
áp suất và đồng thời dung dịch bên trong cũng bị thoát ra ngoài. Điều này đặc biệt nguy hiểm
trong trường hợp trữ sinh phẩm bệnh hay có độc tố; vì vậy, các mẫu bệnh thường được trữ
trong pha khí của bình ni-tơ.
Hai dạng ống đông lạnh thường được sử dụng để trữ mẫu: ống đông lạnh thủy tinh
được đóng kín bằng nhiệt (heat-sealable glass ampule) và ống đông lạnh nhựa có nắp vặn
xoắn ốc (thường được làm bằng polypropylene).



Hình 12. Ống trữ tế bào dùng trong đông lạnh

Hiện nay, trong trữ lạnh tế bào, ống thủy tinh ít được sử dụng do tính kém tiện lợi và
an toàn. Đầu tiên, việc sử dụng các ống này gây khó khăn cho việc dán nhãn và đánh dấu. Các
lỗ rò rỉ nhỏ khó quan sát thấy trong quá trình dán kín bằng nhiệt; nếu không phát hiện được sẽ
gây nguy hiểm và thất thoát trong khi giải đông.
1.5. Bể ổn nhiệt
Thiết bị này được dùng trong giải đông nhanh. Các ống đông lạnh sau khi được lấy ra
khỏi bình ni-tơ sẽ được chuyển vào bể ổn nhiệt 37
o
C cho đến khi phần bên trong ống tan hoàn
toàn. Sau khi loại bỏ dung dịch bảo quản lạnh, tế bào được tái nuôi cấy trong môi trường mới.
2. Các phương pháp đông lạnh
Dựa trên nguyên tắc đông lạnh, người ta đã thành công trong việc bảo quản các tế bào
sống bằng bốn phương pháp sau đây:
(1) Đông lạnh chậm theo chương trình và giải đông nhanh: đây là quy trình đông lạnh
được cải biến và áp dụng từ các nghiên cứu trên phôi và giao tử của người và động vật. Để
tiến hành phương pháp này, phòng thí nghiệm cần phải được trang bị máy làm lạnh theo
chương hoá (Programming freezer). Các tube chứa tế bào đông lạnh trong môi trường thích

hợp được đặt trong buồng làm lạnh, nhiệt độ sẽ được giảm theo chương trình cài đặt trước. Hệ
thống làm lạnh sẽ sử dụng hơi lạnh từ nitơ lỏng hay điện. Thông thường, máy làm lạnh này sẽ
đưa mẫu về nhiệt độ -80
0
C, sau đó, mẫu sẽ được đặt vào bình nitơ lỏng.
12

Sau khi đông lạnh, mẫu tế bào chứa trong tube (hay cọng rạ) được giải đông nhanh
bằng cách cho vào nước ấm -37
0
C.
(2) Đông lạnh nhanh (3 bước) và giải đông nhanh: phương pháp này tiến hành bằng
cách đặt các ống mẫu tế bào (trong môi trường bảo quản lạnh) vào trong tủ lạnh 4
0
C, sau đó
đặt tiếp vào tủ -20
0
C, rồi -80
0
C; cuối cùng đặt mẫu vào bình chứa nitơ lỏng.
Một biến tấu khác cũng hiệu quả của kĩ thuật này là các mẫu được đặt trong một hộp
có vách dày cách nhiệt tốt; sau đó đặt hộp này vào tủ đông -80
0
C. Nhờ vào lớp dày của hộp
cách nhiệt, nhiệt độ được truyền vào trong tube mẫu chậm dần. Đặt hộp trong tủ đông qua
đêm, các ống mẫu được đặt vào bình chứa nitơ lỏng.
(3) Đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hoá): phương pháp này tiến hành bằng cách đặt
mẫu chứa tế bào trong môi trường đông lạnh vào trong bình chứa nitơ lỏng.
Đây là kĩ thuật mới, tận dụng hiện tượng đông đặc của nước khi giảm nhiệt độ thật
nhanh. Người ta đặt tế bào vào trong môi trường có áp suất thẩm thấu cao (4000 mOSm). Với

điều kiện áp suất thẩm thấu này, sự khử nước sẽ xảy ra rất nhanh, sau đó tế bào được đặt thẳng
vào trong bình chứa nitơ lỏng. Khi đó nước không chuyển thành nước đá (ice) thông qua sự
kết tinh (crystallization), mà chuyển thành dạng kính hay thủy tinh (glass). Ở dạng thủy tinh,
phân tử nước (cũng như các chất hoà tan khác) được giữ nguyên vị trí. Kĩ thuật này có ưu
điểm là giúp tế bào trữ lạnh tránh được những tổn thương do hiện tượng hình thành tinh thể
nước đá gây ra.
Ngược lại, quy trình giải đông cũng phải được thực hiện rất nhanh để hạn chế hiện
tượng nước (và các yếu tố hoà tan) chuyển từ dạng kính sang dạng nước đá.
Phương pháp thủy tinh hoá đặc biệt được sử dụng để đông lạnh tổ chức và cơ quan.
Phương pháp này đã được áp dụng thành công trong việc bảo quản đông lạnh các mô tụy đảo
Langerhan và giác mạc của người hay của động vật.
(4) Đông lạnh in situ: nhiều nghiên cứu chứng minh rằng, có thể đông lạnh tế bào ở
trạng thái mà chúng đang phát triển trong dụng cụ nuôi (in situ). Chẳng hạn có thể đông lạnh
thành công khi thay flask đang nuôi tế bào (tế bào bám dính) bằng môi trường đông lạnh; sau
đó đặt flask vào trong hộp xốp cách nhiệt và đặt vào tủ đông -80
0
C. Với cách bảo quản này,
các tế bào có thể sống từ 2-3 tháng. Phương pháp này có nhiều tiện lợi cho bảo quản nhanh
các tế bào khi nuôi trong flask.
Các flask chứa tế bào đang được đông lạnh ở -80
0
C có thể được lấy ra, giải đông
nhanh bằng cách đặt flask vào nước ấm 37
0
C, trong 2-3 phút. Sau khi tan đá, sẽ có hai quần
thể tế bào hiện diện trong flask: quần thể tế bào còn bám dính vào bề mặt flask; và quần thể tế
bào nổi lên. Số lượng tế bào nổi lên nhiều hay ít phụ thuộc vào mật độ tế bào trước khi nuôi,
và sức khỏe tế bào khi tiến hành đông lạnh.
Thông thường, công việc được bắt đầu bàng cách đổ bỏ dịch nổi (có chứa quần thể tế
bào nổi), và sau đó bổ sung môi trường mới (môi trường nuôi cấy tăng sinh) để tiếp tục nuôi.

Các tế bào nổi khi đếm với trypan blue thì cho thấy số lượng tế bào chết thấp. Một số thử
nghiệm đã cố gắng li tâm nhằm thu nhận quần thể tế bào nổi để nuôi, nhưng hầu như các tế
bào này không thể sống tốt.
3. Quy trình đông lạnh và giải đông
Quy trình đông lạnh có sự khác biệt ở các phương pháp đông lạnh khác nhau (nhanh,
chậm hay cực nhanh). Tuy nhiên, nhìn chung, quy trình đông lạnh tế bào đều có các bước
chính như sau:
3.1. Chuẩn bị
3.1.1. Hóa chất
Các hóa chất được khử trùng trước khi sử dụng trong đông lạnh tế bào bằng cách lọc
qua phin 0.2 µm hoặc hấp ở 121
o
C, 1 atm.
- Dung dịch bảo quản lạnh: thành phần chính của dung dịch này là chất bảo quản lạnh
được pha loãng trong dung môi thích hợp. Dung môi này có thể là môi trường nuôi cấy tế bào
13

hoặc dung dịch muối sinh lí có bổ sung thêm một số thành phần như huyết thanh, kháng sinh,
… Trong một số trường hợp, đối với các tế bào khó, dung dịch bảo quản chỉ gồm huyết thanh
(90 – 95%) và chất bảo quản đông lạnh. Việc lựa chọn chất bảo quản đông lạnh phù hợp với
từng loại tế bào và nồng độ thích hợp rất quan trọng, quyết định đến hiệu quả đông lạnh.
DMSO và glycerol được sử dụng phổ biến nhất vì có khả năng áp dụng cho nhiều loại tế bào
khác nhau. Nồng độ chất bảo quản đông lạnh thường là 5 -10%.
- Trypsin hay tác nhân tách tế bào
- Thuốc nhuộm như trypan blue để xác định tỉ lệ tế bào sống, chết trước và sau đông
lạnh.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ
Việc sử dụng các thiết bị và dụng cụ trữ phải phù hợp với điều kiện đông lạnh. Đông
lạnh in situ được tiến hành trực tiếp trên dụng cụ đang nuôi tế bào trong tủ đông -80
o

C. Đông
lạnh trong ni-tơ lỏng cần có các dụng cụ chuyên biệt, bền và chịu được nhiệt như các ống
đông lạnh (cryotube), cọng rạ, … và nhiều thiết bị như tủ lạnh (4
o
C), tủ đông (-20
o
C, -80
o
C),
bình trữ ni-tơ.
3.2. Kiểm tra tình trạng tế bào
Đầu tiên, tế bào được đông lạnh phải đang ở tình trạng tăng trưởng mạnh để đảm bảo
chất lượng và khả năng phục hồi sau giải đông tốt nhất. Tế bào đang ở pha log của chu kì tăng
trưởng là phù hợp nhất (thường là 2-4 ngày sau cấy chuyền, tùy vào loại tế bào). 24 giờ trước
khi tiến hành đông lạnh, môi trường nuôi cấy được thay mới và tình trạng tế bào được dấu
hiệu nhiễm khuẩn được ghi nhận qua việc quan sát dưới kính hiển vi. Đồng thời, các khuẩn
lạc nấm có thể xuất hiện ở mặt phân cách giữa pha lỏng và pha khí và được phát hiện bằng
cách quan sát bằng mắt thường (quan sát bằng kính hiển vi không thể phát hiện được). Bằng
cách khác, môi trường không bổ sung kháng sinh được sử dụng để nuôi tế bào trong ít nhất 1
tuần trước khi đông lạnh nhằm dễ dàng phát hiện nhiễm và giảm thiểu khả năng phục hồi của
các vi khuẩn tiềm ẩn.
3.3. Thu nhận tế bào và đông lạnh
Quy trình thu nhận tế bào khác nhau đối với các loại tế bào khác nhau, thông thường
được chia thành hai loại: tế bào bám dính và tế bào không bám dính (tế bào huyền phù).
Quy trình thu nhận tế bào bám dính
Quy trình thu nhận tế bào huyền phù
Loại môi trường cũ bằng cách hút bỏ
Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ môi trường
cũ
Rửa đĩa tế bào bằng PBS vài lần

Rửa tế bào bằng PBS vài lần
Tách toàn bộ tế bào khỏi đĩa nuôi bằng dung
dịch trypsin. Sau đó, bổ sung chất ức chế
protease để làm ngừng hoạt động của trypsin.

Li tâm thu cặn tế bào và loại bỏ trypsin, chất
ức chế protease

Rửa tế bào bằng PBS vài lần

Xác định số lượng tế bào sống
Xác định số lượng tế bào sống
Huyền phù cặn tế bào vào môi trường đông
lạnh
Huyền phù cặn tế bào vào môi trường đông
lạnh
Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh
Phân phối dịch tế bào vào các ống đông lạnh
Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm
lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh)
Chuyển các ống đông lạnh vào thiết bị làm
lạnh (tùy theo phương pháp đông lạnh)
3.4. Giải đông
14

Các ống đông lạnh được giải đông nhanh trong điều kiện nhiệt độ 37
o
C. Sau khi loại
bỏ dung dịch bảo quản lạnh, tế bào được huyền phù vào môi trường nuôi mới. Thao tác loại
bỏ chất bảo quản đông lạnh được thực hiện nhanh và nhẹ nhàng nhằm tránh làm tổn thương tế

bào. Việc bổ sung nhanh một lượng lớn môi trường mới có thể gây shock thẩm thấu cho tế
bào. Các kĩ thuật được thực hiện tùy theo loại chất bảo quản đông lạnh và đặc tính của tế bào.
Phần lớn dịch tế bào giải đông được nuôi ngay vào bình flask và môi trường có chứa chất bảo
quản đông lạnh được thay sau khi tế bào đã bám vào bề mặt nuôi cấy và tiếp tục thay mỗi 6 –
8 giờ sau đó cho đến khi chất bảo quản đông lạnh được pha loãng đến mức thấp nhất. Đối với
tế bào nhạy cảm với chất bảo quản đông lạnh, việc loại bỏ hoàn toàn chất này trước khi tái
nuôi cấy là rất cần thiết. Dịch tế bào sau khi tan đông được bổ sung thêm môi trường mới, hỗn
hợp này được li tâm để thu cặn tế bào. Môi trường mới được thêm vào và số lượng tế bào
sống, chết được đếm để xác định hiệu quả đông lạnh. Đồng thời, tế bào được đem nuôi cấy.
4. Các nguy cơ của việc bảo quản đông lạnh
Trong toàn bộ quá trình bảo quản đông lạnh, ở từng giai đoạn, nhiều yếu tố có thể gây
những thay đổi cho tế bào.
4.1. Trong quá trình thu nhận và xử lí tế bào
Việc thu nhận một lượng lớn tế bào ở nhiệt độ phòng hay với điều kiện dung dịch quá
base trong thời gian dài làm tăng tỉ lệ chết của tế bào. Nguy cơ này cũng có thể xảy ra khi xử
lí tế bào với chất bảo quản đông lạnh. Các chất này độc đối với tế bào nên khi được sử dụng
với nồng độ hay thời gian xử lí không phù hợp sẽ gây chết tế bào.
4.2. Trong quá trình đông lạnh
Tổn thương tế bào tăng và hiệu quả tái nuôi cấy giảm khi đông lạnh với tỉ lệ làm lạnh
quá nhanh hay quá chậm, hay gián đoạn. Như đã bàn đến ở trên, các tổn thương thường xảy ra
đối với tế bào là do sự hình thành tinh thể trong quá trình đông lạnh hoặc tan đông. Điều này
thường dẫn đến khả năng sống của tế bào giảm.


4.3. Trong thời gian trữ lạnh
Bất kì một gián đoạn nào trong thời gian trữ đông đều ảnh hưởng đến khả năng sống
của tế bào sau giải đông. Chẳng hạn như sự làm lạnh bị gián đoạn bởi sự tăng nhiệt độ hay
nhiệt độ trữ không ổn định.
Ở nhiệt độ -196
o

C, trong tế bào không diễn ra một quá trình sinh lí nào, có nghĩa là
protein hoặc DNA không hồi phục lại được khi bị tổn thương. Tổn thương xảy ra trong dung
dịch ni-tơ giống như hậu quả của phóng xạ. Phóng xạ gây đột biến tự nhiên trên tế bào sống
với tỉ lệ khoảng 1%. Vì vậy, về lí thuyết, các nhà sinh học về đông lạnh đã cho rằng chất
lượng tế bào không bị giảm trong khi bảo quản và tế bào có thể được bảo quản trong hàng
ngàn năm.
4.4. Trong quá trình giải đông
Nguy cơ gây chết tế bào tăng khi thao tác giải đông quá chậm hay chất bảo quản đông
lạnh được loại bỏ không hợp lí.

THAM KHẢO
[1] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định (2009). Bảo quản tế bào gốc. Công nghệ
tế bào gốc.
[2] Ryan JA. Cryogenic preservation and storage of animal cells. Corning Incorporated Life
Sciences.
[3] Ryan JA. General guide for cryogenically storing animal cell cultures. Corning
Incorporated Life Sciences.
[4] Özkavukcu S, Erdemli E (2002). Cryopreservation: Basic knowledge and biophysical
effects. Journal of Ankara medical school, Vol. 24, No. 4.
15