Bài giảng Nuôi cấy tế bào trần slide

NUÔI CẤY
TẾ BÀO TRẦN (PROTOPLAST)
Tạ Ngọc Ly
Chương 5
CẢI TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG BẰNG NCMTBTV
www.themegallery.com

Protoplast là gì?

Đặc điểm của protoplast

Mục đích nghiên cứu protoplast?
www.themegallery.com
Phương pháp tách Protoplast

Nguyên liệu:

2 phương thức phân lập protoplast
- Cơ học (không dùng các enzyme).
-
Sử dụng enzyme :
+tuần tự (qua hai bước).
+Sử dụng hỗn hợp enzyme (xử lý đồng thời).
* Kỹ thuật từng bước của Hanaka
www.themegallery.com
Phương pháp cơ học
www.themegallery.com
Phương pháp cơ bản tách protoplast
bằng enzyme

Khử trùng mẫu lá


Ngâm trong dung dịch thẩm thấu

Tách lớp mặt dưới lá

Ngâm trong hỗn hợp enzyme

Tinh sạch tế bào trần

Nuôi trong môi trường thích hợp
www.themegallery.com
Hỗn hợp enzyme

Pectinase phân hủy pectin.

Macease

Macerozyme R-10

Pectolyase Y-23

Pectinase (Sigma)

Cellulase phân hủy cellulose

Cellulase Onozuka (R-10, RS)

Cellulysin

Meicelase (CESB, CMB)


Driselase

Hemicellulase phân hủy hemicellulose.

Rhyzyme HP-150

Hemicellulase (Sigma)
Phối hợp các enzym phân hủy màng tế bào đã
được thực hiện trên một số cây trồng

Hemerocallis
Cellulysin (1%) + Rhozyme (1%) + Macease (0,5%) (Huyền phù tế bào)

Pisum sativum
Onozuka R-10 (2%) + Driselase (2%) + Rhozyme (2%) + Pectinase (1%)
(Tế bào thịt lá)

Solanum sp.
Onozuka R-10 (1%) + Macerozyme R-10 (0,02%) + Pectolyase Y-23
(0,013%) (Tế bào thịt lá)

Medicago sativa
Meicelase (4%) + Rhozyme (2%) + Macerozyme R-10 (0,03%) (Rễ, lá
mầm)
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Thành phần dịch enzyme (trên lít) gồm có:
- Các enzyme (pectinase, cellulase, hemicellulase) từ
0,1-2%

- Sorbitol (0,15 M) 27,3 g’
- Mannitol (0,15 M) 27,3 g
- Glucose (0,1 M) 18 g
- CaCl
2
.2H
2
O (6 mM) 441 mg
- KH
2
PO
4
(0,7 mM) 95 mg
- Đệm MES: 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid
(3 mM) 650 mg
- Điều chỉnh pH 5,6 và khử trùng dung dịch enzyme
bằng màng lọc Millipore.
Tinh sạch protoplast
www.themegallery.com
Xác định chất lượng của protoplast

Phát hiện thành tế bào: calcoflour

Xác định khả năng sống sót của protoplast
+ quan sát trực tiếp
+ FDA( Fluorescein diacetate)
+ nhuộm xanh Evan
www.themegallery.com
Đếm protoplast bằng buồng đếm hồng cầu
www.themegallery.com

Nhuộm xanh evan
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Xác định mật độ protoplast và khả năng sống sót

Fluorescein diacetate:
thấm vào bên trong lớp
plasmalemma của
protoplasts, có thể được phát hiện
dưới kính hiển vi với đèn huỳnh
quang hoặc /UV
Tế bào không thấm đối với Evans
blue chứng tỏ tế bào đang sống.

Sự chuyển động vòng hay sự sự
xắp xếp của nguyên sinh chất thể
hiện khả năng sống được của
protoplast
www.themegallery.com
Phương pháp cơ bản để tách protoplast
từ lá cây

Khử trùng mẫu lá

Ngâm mẫu trong dung dịch thẩm thấu để tế
bào co nguyên sinh chất

Tách lớp mặt dưới lá

Ngâm mẫu trong hỗn hợp enzym


Tinh sạch protoplast

Nuôi cấy protoplast trong môi trường thích
hợp
Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và
phát triển protoplast

Môi trường nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy

Mật độ nuôi cấy
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Môi trường nuôi cấy protoplast
-
Thành phần dinh dưỡng
- MS hoặc B5 có cải tiến ( giảm Fe, Zn, NH
4
+
,
tăng Ca
2+
)
-
Auxin + cytokinin cao
-
Tăng áp suất thẩm thấu

Điều kiện nuôi cấy

Hệ thống nuôi cấy:
-
nuôi cấy trên môi trường lỏng
-
nuôi cấy trên môi trường bán rắn
-
Nuôi cấy trong giá thể cố định (alginate, đĩa
petri)

Điện trường kích thích sự phát triển của
protoplast

Bổ sung kháng sinh, chất bề mặt và
polyamine.
www.themegallery.com
www.themegallery.com
Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast từ lá cây
www.themegallery.com
Nuôi cấy tái sinh cây bằng protoplast từ lá cây
www.themegallery.com
Môi trường KM 8p dùng cho nuôi cấy protoplast ở mật
độ thấp (khử trùng bằng phương pháp lọc)
Thành phần Nồng độ
(mg/L)
Thành phần Nồng độ
(mg/L)
Muối khoáng
NH

4
NO
3
KNO
3
CaCl
2
.2H
2
O
MgSO
4
.7H
2
O
KH
2
PO
4
KCl
Sequestrence 330 Fe
KI
H
3
BO
3
MnSO
4
.H
2

O
ZnSO
4
.7H
2
O
Na
2
MoO
4
.2H
2
O
CuSO
4
.5H
2
O
CoCl
2
.6H
2
O
600
1900
600
300
170
300
28

0,75
3
10
2
0,25
0,025
0,025
Các acid hữu cơ
(chỉnh pH tới 5,5 bằng NH
4
OH)
Sodium pyruvate
Citric acid
Malic acid
Fumaric acid
Các vitamin
Inositol
Nicotinamide
Pyridoxine-HCl
Thiamine-HCl
D-Calcium pantothenate
Folic acid
p-Aminobenzoic acid
5
10
10
10
100
1
1

10
0,5
0,2
0,01
www.themegallery.com
Thành phần Nồng độ
(mg/L)
Thành phần Nồng độ
(mg/L)
Đường Biotin 0,005
Glucose
Sucrose
Fructose
Ribose
Xylose
Mannose
Rhamnose
Cellobiose
Sorbitol
Mannitol
68400
125
125
125
125
12
125
125
125
125

Choline chloride
Riboflavin
Ascorbic acid
Vitamin A
Vitamin D
3
Vitamin B
12
0,5
0,1
1
0,005
0,005
0,01
Các phytohormone
2,4-D
Zeatin
NAA
Vitamin-free casamino
acid
Nước dừa (lấy từ quả già
xử lý 60
o
C/30 phút rồi
lọc)
Đậu tương × lúa mạch
1
0,1
-
125

10 ml/L
Đậu tương × đậu Hà Lan
hoặc N. glauca
0,2
0,5
1
-
-
www.themegallery.com
Áp lực thẩm thấu của môi trường

Vì sao cần duy trì áp suất thẩm thấu ?

Cách duy trì áp lực thẩm thấu:
-
Các chất tạo áp suất thẩm thấu
-
Các chất phân li

Mật độ dàn trải protoplast
-
1×10
4
đến 1×10
5
tế bào/mL
www.themegallery.com
Kỹ thuật nuôi cấy protoplast

Kỹ thuật tầng nuôi dưỡng


Đồng nuôi cấy các protoplast

Nuôi cấy vi giọt
www.themegallery.com
Tái sinh cây từ protoplast

Tạo vách tế bào

Tăng trưởng và phân chia tế bào

Phát triển callus/cây hoàn chỉnh
Sử dụng chất mang oxi để tăng khả năng sống
sót của protoplast

Perfluorocarbon liquids(PFCs)

Hemoglobin (Hb)
www.themegallery.com